Trabajo Práctico N°8: AISLAMIENTO DE DISTINTAS ESPECIES

BACTERIANAS A TRAVÉS DEL USO DE MEDIOS DE CULTIVO

SELECTIVOS Y/O DIFERENCIALES.

Delfina Brachfeld Parlaghy

Aylen Lucia Rauch

Introducción

Un medio de cultivo es el responsable de proveer el medio físico químico necesario para el

crecimiento de los microorganismos. Son una mezcla equilibrada de nutrientes (fuente de carbono,
nitrógeno, azufre y base mineral) que en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas
permiten el crecimiento. Según sus propósitos de uso, se puede clasificar en tres grupos: medios de
enriquecimiento, medios selectivos y medios diferenciales.

Los medios de enriquecimiento son medios líquidos que incrementan el número de un tipo de
microorganismo en relación con el número de otros tipos de microorganismos que pueden estar en el
inóculo. Los medios selectivos son iguales a los de enriquecimiento pero se diferencian por ser
medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Los medios
diferenciales se utilizan para la identificación de algún grupo de microorganismos en particular y
contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos
sobre algunos de los componentes del medio.

El objetivo de este trabajo práctico fue utilizar distintos tipos medios de cultivo para poder aislar e
identificar diferentes microorganismos.

Materiales y métodos

1. Enterobacterias

Utilizando el medio de cultivo EMB preparado en el trabajo práctico anterior, se sembró con ansa
esteril una muestra proveniente de un tubo positivo para coliformes fecales y se incubó en estufa a
35°C ± 0,5°C por 48 hs.

2. Bacillus sp.

Primero se prepararon 10 ml de caldo nutritivo en un tubo de ensayo, ajustando el pH entre 7 y 7,2.

Para preparar el caldo, se utilizó peptona de carne (5 g/l), extracto de carne (3 g/l), glucosa (3 g/l) y
extracto de levadura (0,5 g/l). Una vez preparado el caldo, se tapó y se esterilizó por autoclave.

Mientras se preparaba el caldo, se agregaron 5 g de arroz común (no parbolizado) en 15 ml de agua

destilada y se dejó en agitación durante 10 minutos Luego se calentó a 80 ºC durante 5 minutos.
Finalmente, se tomó 1 ml de sobrenadante y se agregó al caldo de cultivo. Se incubó a 37 ºC durante
48 hs.

Luego se prepararon 90 ml de medio de cultivo para el aislamiento de Bacillus sp, ajustando el pH

hasta 7,15. Para preparar el medio, se utilizó peptona bacteriológica (10 g/l), extracto de carne (1 g/l),
glicerol (10 g/l), NaCl (10 g/l), rojo de fenol (0,025 g/l) y agar (12 g/l). Una vez preparado, se tapó y
se esterilizó por autoclave. Después se prepararon 100 ml de solución de NaCl (0,9% m/v) y se
esterilizó por autoclave.
Mientras se preparaba el medio, se dejó un huevo en etanol 70% durante varias horas. Pasado ese
tiempo, se abrió asépticamente y se separó la yema de la clara bajo condiciones de esterilidad. Se
agregó la yema en la solución de NaCl y se mezcló evitando la formación de espuma. Por último, se
agregaron 12 gotas de solución esteril comercial de Polimixina B.

Finalmente, se agregaron 10 ml de la emulsión yema de huevo al medio de cultivo y se plaqueo. Una

vez solidificado, se sembró con ansa esteril una muestra del caldo nutritivo y se dejó incubar a 37 ºC
durante 48 hs.

3. Pseudomonas sp.

Primero se prepararon 100 ml de caldo M9 y luego se trasvasaron a tubos de ensayo 10 ml en cada

uno; ajustando el pH hasta 7,4. Por un lado, se preparó una parte de la solución utilizando NH4Cl (1
g/l), Na2HPO4.12H2O (6 g/l), KH2PO4 (3 g/l), NaCl (0,5 g/l) y glicerol (5 g/l). Se tapó y se esterilizó
por autoclave. Luego se preparó la otra parte de la solución utilizando MgSO4.7H2O 1M (1 ml/l) y
CaCl2 0,01M (10 ml/l). Se tapó y se esterilizó por autoclave. Se mezclaron en frío ambas soluciones y
se sembró 1 ml de muestra de agua contaminada. Se dejó incubar a 37 ºC durante 48 hs.

Luego se prepararon 50 ml de medio de cultivo Agar Cetrimida según especificaciones comerciales

(44,5 g/l). Se tapó y se esterilizó por autoclave. Se plaqueo y una vez solidificado, se sembró con ansa
esteril una muestra del caldo M9 y se dejó incubar a 42 ºC durante 48 hs. En la misma placa, se
sembró una muestra de control de pseudomonas sp.

4. Bacterias con metabolismo fermentativo, aerobicas y anaerobicas

Se prepararon 50 ml de medio de cultivo TSI y se ajustó el pH hasta 7,3 ± 0,2. Para preparar el medio,
se utilizó peptona bacteriológica (20 g/l), extracto de carne (3 g/l), sacarosa (10 g/l), glucosa (1 g/l),
lactosa (10 g/l), NaCl (5 g/l), Na2S2O3.5H2O (0,3 g/l), C6H5FeO7 (0,3 g/l), extracto de levadura (3 g/l),
rojo fenol (0,025 g/l) y agar (13 g/l). Una vez preparado el medio, se trasvasaron 8 ml a 6 tubos de
ensayo y se esterilizaron por autoclave. Luego se dejaron enfriar hasta 60 ºC en forma de pico de
flauta. Por último, se sembraron en profundidad y en la superficie las muestras provistas por las
docentes (E. coli, A, FL, Post y B. cereus). Se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 48 hs.

Resultados y discusiones

1. Enterobacterias

Se pudieron observar colonias de Klebsiella pneumoniae, con un color rosa púrpura de aspecto
mucoso (Figura 1.A).

2. Bacillus sp.

Sembramos una sola placa de Bacillus sp. para todo el curso debido a que el agar que utilizamos para
armar el medio de cultivo no era el correcto y no solidifico adecuadamente. Se pudo observar colonias
con halo rosa, indicando la presencia de B. cereus (Figura 1.B).

3. Pseudomonas sp.

Se pudo observar el crecimiento de colonias de pigmento verde con características similares a las del
control; indicando la presencia de pseudomonas sp. en el medio (Figura 2.A).
Figura 1. Resultado del sembrado de (A) enterobacterias en un medio EMB a 35°C ± 0,5°C por 48 hs
y (B) Bacillus sp. en un medio con yema, NaCl y Polimixina B incubado a 37 ºC durante 48 hs.

4. Bacterias con metabolismo fermentativo, aerobicas y anaerobicas

Se pudieron observar cambios en el medio TSI, lo cual brinda información acerca del tipo de
metabolismo que posee el microorganismo sembrado (Figura 2.B). Los medios que fueron sembrados
con Post y B. cereus presentaron un pico rojo y un fondo amarillo, indicando que estos
microorganismos solamente fermentan la glucosa en anaerobiosis. Los medios sembrados con FL y A
presentaron un pico y fondo amarillo, indicando que estos microorganismos respiran/fermentan
glucosa, lactosa y/o sacarosa tanto en aerobiosis como anaerobiosis. Por último, el medio sembrado
con E. coli presentó un pico y fondo rojo, indicando que este microorganismo no fermenta azúcares.
En ninguno de los tubos se observó ennegrecimiento ni ruptura del medio.

Figura 2. Resultado del sembrado de (A) agua contaminada con posible presencia de pseudomonas
sp. junto a un control de la misma especie en un medio de Agar Cetrimida incubado a 42 ºC durante
48 hs y (B) distintos microorganismos (E. coli, A, FL, Post y B. cereus) en un medio TSI incubado a
temperatura ambiente durante 48 hs.

Conclusiones

En conclusión, los diferentes medios de cultivo armados según las necesidades de cada
microorganismo y su tipo de metabolismo, fueron efectivos para el crecimiento en número de su
población y su posterior selección, así como en su diferenciación. También se pudo realizar el
aislamiento de Bacillus sp. y Pseudomonas sp..