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© 2019. Publicado por The Company of Biologists Ltd|Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977
REVISIÓN
Códigos de comunicación en las vías de señalización del desarrollo
Pulín li1,2y Michael B. Elowitz3,4,*
RESUMEN
Un puñado de vías de señalización intercelular centrales juegan un papel
fundamental en una amplia variedad de procesos de desarrollo. Sigue siendo
desconcertante cómo tan pocas vías pueden proporcionar la precisión y
especificidad de la comunicación célula-célula requerida para el desarrollo
multicelular. Resolver esto requiere que comprendamos cuantitativamente cómo
las vías de señalización detectan, transforman y distribuyen espacialmente de
forma activa la información de señalización relevante para el desarrollo.
Recientemente, el análisis de células individuales y la reconstitución basada en
células, entre otros enfoques, han comenzado a revelar los "códigos de
comunicación" a través de los cuales se representa la información en las
identidades, concentraciones, combinaciones y dinámicas de los ligandos
extracelulares. También han revelado cómo las vías de señalización descifran estas
características y controlan la distribución espacial de la señalización en contextos
multicelulares. Aquí, revisamos trabajos recientes que informan sobre el
descubrimiento y análisis de códigos de comunicación y discutimos sus
implicaciones para diversos procesos de desarrollo.
PALABRAS CLAVE: Códigos de comunicación, Procesamiento de señales,
Arquitectura de rutas
Introducción
El desarrollo embrionario depende de una comunicación precisa, oportuna y
específica entre las células. Nuestra comprensión de la comunicación célula-
célula ha evolucionado durante muchas décadas. A principios del siglo XX,
los experimentos clásicos de injerto de tejidos revelaron funciones cruciales
para la comunicación célula-célula en la toma de decisiones sobre el destino
celular y otros procesos (Hörstadius, 1973; Spemann y Mangold, 1924). Sin
embargo, las identidades de las señales de comunicación siguieron siendo
esquivas durante más de medio siglo debido a la falta de herramientas
moleculares. Sin embargo, durante varias décadas, los investigadores
utilizaron enfoques genéticos moleculares para descubrir un conjunto de
vías centrales altamente conservadas, incluidos los sistemas de señalización
Notch, Transforming Growth Factor beta (TGF-β), Wnt, Hedgehog (HH) y
Receptor Tyrosine Kinase (RTK). , que juegan un papel fundamental en una
gama asombrosamente amplia de procesos de desarrollo (Fig. 1A). Las
pantallas genéticas y los estudios bioquímicos ayudaron a identificar los
componentes moleculares y las interacciones que forman estas vías y
dilucidaron sus funciones en numerosos contextos de desarrollo (Gerhart,
1999), proporcionando un marco fundamental para comprender la
señalización del desarrollo.
Un creciente cuerpo de trabajo, especialmente en células individuales, sugiere
cada vez más que estas vías señalan a través de un conjunto de "códigos de
comunicación". Más específicamente, las vías detectan diferentes características de
las entradas de sus ligandos, incluida la identidad molecular, la concentración,
1InstitutoWhitehead de Investigación Biomédica, Cambridge, MA 02142, EE. UU.
2Departamento de Biología, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA
02139, EE. UU.3División de Biología e Ingeniería Biológica, Instituto de Tecnología de
California, Pasadena, CA 91125, EE. UU.4Instituto Médico Howard Hughes, Pasadena, CA
91125, EE. UU.
* Autor de la correspondencia ( melowitz@caltech.edu )
MBE, 0000-0002-1221-0967
combinación con otros ligandos y dinámica (Fig. 1B). Las vías detectan y
transforman activamente estas características en concentraciones, estados y
dinámicas de efectores intracelulares que, a su vez, controlan en última
instancia genes o proteínas diana. Cada paso de procesamiento puede
depender del tipo de celda o del contexto. Además, a nivel de tejido, las vías
no solo detectan ligandos extracelulares, sino que esculpen dinámicamente
su distribución espacial para permitir la generación de patrones de
desarrollo precisos (Fig. 1C). Desde este punto de vista, cada ruta se puede
considerar como un dispositivo que procesa señales de forma activa
mientras cambia su representación a través de un esquema de
procesamiento extendido espacialmente y de varios niveles.
Los códigos de comunicación dependen de la arquitectura de la ruta. Las
vías difieren en el número y tipo de interacciones moleculares del receptor al
gen diana, la integración de variantes paralelas de ligando y receptor y
circuitos de retroalimentación (Fig. 1A). Aquí, revisamos el progreso reciente
hacia la comprensión de cómo las diferentes arquitecturas de vías
implementan una variedad de códigos de comunicación y discutimos sus
implicaciones funcionales desde células individuales hasta tejidos en
desarrollo. Organizamos la Revisión en torno a cuatro características de
entrada distintas: identidad de ligando, concentración, combinaciones y
dinámica, explorando ejemplos de vías seleccionadas para cada
característica. Luego discutimos nuevos enfoques que están permitiendo el
análisis cuantitativo e incluso unicelular de códigos de comunicación en
sistemas espacio-temporalmente complejos. Finalmente, identificamos
desafíos y oportunidades para el trabajo futuro.
Debido a la naturaleza estocástica y no sincronizada de las respuestas de
señalización en diferentes células, los métodos de una sola célula son
esenciales para analizar la comunicación célula-célula. Por lo tanto, a lo largo
de la revisión, destacamos las funciones de las herramientas y enfoques de
células individuales, incluidos los reporteros fluorescentes, las imágenes
cuantitativas de lapso de tiempo, la microfluídica, la biología sintética, la
ingeniería genómica y el perfil de expresión génica de células individuales.
Restringimos nuestro enfoque al pequeño conjunto de vías de señalización
centrales enumeradas en la Fig. 1A que desempeñan funciones
especialmente predominantes en el desarrollo embrionario en todo el reino
animal y ejemplifican paradigmas de codificación de señales que
probablemente se generalicen a otras vías. Por lo tanto, esta revisión omite
trabajos igualmente relevantes en muchas otras vías y contextos, como NF-
κB en la señalización inmunitaria y el cáncer,
Discriminación de la identidad del ligando
Durante la evolución, la duplicación y la divergencia de genes produjeron múltiples
variantes de ligandos que interactúan con múltiples variantes de receptores de
una manera de muchos a muchos (promiscua) en muchas vías de señalización (Fig.
2A). Por ejemplo, aunque cada una de las siete isoformas principales del receptor
del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) de mamíferos se une
DESARROLLO
preferentemente a un subconjunto de los 22 ligandos del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF), las afinidades de unión por diferentes ligandos tienden a
mostrar una distribución superpuesta amplia (Ornitz et al. al., 1996; Zhang et al.,
2006). En contraste con esta complejidad extracelular, diversos complejos ligando-
receptor parecen converger intracelularmente en un conjunto más pequeño de
efectores superpuestos. Dada esta arquitectura convergente, es desconcertante
entender si y
1
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AArquitecturas de vías de señalización mientras que la activación pulsátil de Notch es suficiente para inducirHes1,
Se requiere una actividad Notch sostenida paraHola1/HolaLregulación al alza
ligando DLL TGF-β WNT S.S FGF/EGF/etc.
Finalmente, Dll1 y Dll4 tuvieron efectos opuestos sobre el destino celular,
Receptor MUESCA TGFBR FRZ PTCH RTK promoviendo o inhibiendo la miogénesis, respectivamente, cuando se
expresaron en células de la cresta neural dentro de embriones de pollo en
GSK3β SMO MAPA AKT
desarrollo. Estos resultados mostraron que incluso la ruta de Notch
Efector NICD SMAD β-catenina GLIA GLIR TF TF
relativamente 'directa' es capaz de discriminar entre ligandos similares,
Objetivo Objetivo Objetivo Objetivo Objetivo objetivo objetivo procesar la identidad del ligando en dinámicas de efectores y luego descifrar
esas dinámicas en distintos programas objetivo. De hecho, el uso de la
dinámica para discriminar entre ligandos o entradas parece ser un tema
BDetección de diferentes ligandos C Control espacio-temporal
creciente en muchos sistemas (Levine et al, 2013; Purvis y Lahav, 2013).
caracteristicas distribución
Identidad Concentración ¿Cómo se procesa la identidad del ligando en la dinámica del efector? Se sabe
que los ligandos y receptores Notch se agrupan en las interfaces celulares. Las
contra
imágenes cuantitativas de estos complejos de señalización agrupados en células
cultivadas (Nandagopal et al., 2018) son consistentes con una hipótesis de trabajo
Dinámica Combinación
en la que Dll1 activa de manera preferencial y coordinada los receptores Notch
Nivel

como grupos, liberando así un "pulso" de muchos NICD en un solo evento,

Tiempo
mientras que Dll4 activa Notch dentro de grupos más pequeños o complejos

Fig. 1. Las arquitecturas de las vías de señalización del desarrollo detectan, procesan y controlan
los ligandos en el espacio y el tiempo. (A) Las principales vías de señalización del desarrollo
utilizan diversas arquitecturas para controlar la comunicación célula-célula. En estas vías, las
interacciones ligando-receptor activan los efectores intracelulares, que luego regulan la expresión
del gen diana. La actividad de señalización intracelular también induce una miríada de bucles de
retroalimentación para modular aún más la capacidad de procesamiento de señales de la vía. TF,
factor de transcripción. (B) A nivel de una sola célula, las vías pueden detectar la identidad
molecular y la concentración de ligandos individuales, las concentraciones relativas de múltiples
ligandos (combinaciones) o la dinámica temporal de las concentraciones de ligandos. (C) A nivel
tisular, las vías de señalización pueden modular activamente la distribución de ligandos
extracelulares y la percepción de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Este control
espacio-temporal ocurre a través de interacciones directas ligando-receptor, inhibidores o
moduladores secretados y circuitos de retroalimentación (flechas dentro de cada celda). La regla y
el reloj representan las escalas espaciales y temporales de la actividad de señalización en
gradientes de morfógenos. Comprender las relaciones entre la arquitectura de la vía (A) y el
procesamiento de la señal (B,C) es un desafío fundamental.
cómo las células activan diferentes programas objetivo en respuesta a diferentes
ligandos a través de un conjunto común de efectores intracelulares (Madhani y
Fink, 1997).
Ligandos Notch discriminantes
La vía Notch permite la comunicación directa entre células vecinas y controla numerosas decisiones sobre el destino de
las células (Bray, 2016; Henrique y Schweisguth, 2019). Dentro de la vía de los mamíferos, cuatro receptores Notch
interactúan de manera promiscua con un conjunto de ligandos Notch, incluidos delta like 1 (Dll1) y delta like 4 (Dll4). La
señalización ocurre cuando un ligando en una célula se une a un receptor Notch en una célula vecina, lo que induce la
liberación proteolítica del dominio intracelular Notch (NICD) del receptor. El NICD se transloca al núcleo para activar
genes diana, como los represores de la familia Hes basic helix-loop-helix (bHLH), que, a su vez, controlan las decisiones
sobre el destino celular (Kageyama et al., 2007) (Fig. 2B). Este mecanismo, junto con la aparente equivalencia entre los
diferentes dominios intracelulares del receptor Notch (Liu et al., 2015), no proporciona una forma obvia para que una
célula receptora de señales determine cualitativamente qué ligando es responsable de su activación. Sin embargo,
diferentes ligandos pueden desencadenar distintas dinámicas de actividad de Notch incluso a través del mismo
receptor. Usando microscopía de lapso de tiempo cuantitativo para seguir la señalización de Notch en células CHO
cultivadas, Nandagopal et al. descubrió que Dll1 y Dll4 activan el receptor Notch1 con una dinámica pulsátil o sostenida,
respectivamente (Nandagopal et al., 2018) (Fig. 2B). Además, demostraron que la modulación directa de la dinámica de
activación de NICD en células C2C12 cultivadas activa diferencialmente los genes diana de Notch. Usando microscopía
de lapso de tiempo cuantitativo para seguir la señalización de Notch en células CHO cultivadas, Nandagopal et al.
descubrió que Dll1 y Dll4 activan el receptor Notch1 con una dinámica pulsátil o sostenida, respectivamente
ligando-receptor individuales, lo que da como resultado un "goteo" constante de
NICD hacia el núcleo (Nandagopal et al., 2018). Estudios adicionales deberían
ayudar a comprender las formas en que la agrupación contribuye a la
discriminación dinámica de ligandos.
El mecanismo a través del cual la dinámica NICD se utiliza posteriormente
para activar diferencialmenteHes1yHola1/HolaLaún no está claro. Sin
embargo, varias características del circuito regulador Hes/Hey podrían
desempeñar un papel clave.Hes1yHola1/HolaLse sabe que inhiben
recíprocamente la expresión de los demás (Heisig et al., 2012; Noguchi et al.,
2019), mientras que Hes1 es inestable a nivel de proteína y ARNm y
autorregula negativamente su propia expresión.Hes1también tiene una
arquitectura única de mejora de Notch, que le permite responder más rápido
que Hola1/HolaLa niveles más bajos de NICD (Arnett et al., 2010; Nam et al.,
2007; Ong et al., 2006). El modelado matemático ha sugerido que estas
características juntas permitenHes1para responder rápidamente a un
aumento repentino en NICD, mientras que las duraciones extendidas (∼Se
requieren 1-2 h) de actividad sostenida de NICD para regular al alzaOye1/
OyeL (Nandagopal et al., 2018). Serán necesarios más estudios para
desentrañar las funciones de estos y otros mecanismos en la discriminación
de las identidades de los ligandos de Notch.
Ligandos RTK discriminantes
La dinámica también permite que las células discriminen entre ligandos RTK.
Estudios recientes han revelado que diferentes ligandos pueden inducir diferentes
dinámicas de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)
al modular las características estructurales del dímero del receptor (Fig. 2C). Por
ejemplo, la epirregulina (EREG) y el epígeno (EPGN) promueven la diferenciación
de las células MCF-7, mientras que el factor de crecimiento epidérmico (EGF)
promueve la proliferación. Estos diferentes resultados se correlacionan con la
fosforilación sostenida o transitoria de EGFR y su efector aguas abajo ERK inducido
por EREG/EPGN o EGF, respectivamente (Freed et al., 2017). Sin embargo, EREG/
EPGN tienen una menor afinidad por EGFR e inducen dímeros de receptores de
vida más corta que EGF. Una posible explicación para este resultado contrario a la
intuición es que los dímeros de receptores de corta duración podrían no activar los
mecanismos de retroalimentación negativa clave y, por lo tanto, evitar la
terminación de la señal (Freed et al., 2017). Por lo tanto, las alteraciones
estructurales de los receptores inducidas por diferentes ligandos podrían ser
DESARROLLO

(Nandagopal et al., 2018) (Fig. 2B). Además, demostraron que la modulación directa de la dinámica de activación de
NICD en células C2C12 cultivadas activa diferencialmente los genes diana de Notch. Usando microscopía de lapso de
tiempo cuantitativo para seguir la señalización de Notch en células CHO cultivadas, Nandagopal et al. descubrió que
Dll1 y Dll4 activan el receptor Notch1 con una dinámica pulsátil o sostenida, respectivamente (Nandagopal et al., 2018)
(Fig. 2B). Además, demostraron que la modulación directa de la dinámica de activación de NICD en células C2C12
cultivadas activa diferencialmente los genes diana de Notch.Hes1yHola1/HolaL;
cruciales para determinar la dinámica de señalización y la discriminación de
ligandos.
Los receptores del FGF y del factor de crecimiento nervioso (NGF) también
procesan la identidad del ligando en dinámicas efectoras, activando distintos
programas objetivo. Por ejemplo, el tratamiento de células de feocromocitoma
PC12 con EGF provoca la proliferación, mientras que el tratamiento con FGF o NGF
induce la diferenciación neural (Greene y Tischler, 1976;

2
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Una arquitectura de ruta convergente B Control dinámico: muesca (celda única)

ligando

ligando
dll1 dll4
Tiempo Tiempo
Receptor Muesca1 Muesca1

Actividad
Efector
NICD Tiempo Tiempo

ARNm
Objetivo

Él es Oye Tiempo Tiempo

C Control dinámico: RTK (población) D Control combinatorio (célula única)

EREG FEAGNGF
Prolifo NGF
ligando TrkA
NGF
EGFR EGFRTrkA Tiempo Tiempo Tiempo

PAQUETE
PI3K ras
RAS PI3K
gaje

diferencia

gaje akt ERK

AKT ERK
Tiempo Tiempo Tiempo

diferencia Dif Prolife diferencia Prolifo diferencia

Fig. 2. Identidad de ligando discriminante. (A) Muchas vías de señalización comparten una estructura convergente, con ligandos que interactúan con los receptores de una manera de
muchos a muchos y la información se "canaliza" hacia abajo para controlar un número menor de efectores intracelulares. Sin embargo, el efector compartido puede discriminar la
identidad ligando-receptor para inducir programas diferenciales de expresión génica. (B) Los ligandos Dll1 y Dll4 de la vía Notch se unen al receptor Notch1 pero activan el NICD
efector corriente abajo con dinámicas diferentes. Dll1 induce respuestas pulsátiles, que preferentemente activan el objetivo transcripcionalHes1,mientras que Dll4 induce respuestas
sostenidas, que son necesarias para activarHola1. (C) Diferentes vías RTK comparten un conjunto común de componentes de transducción de señales intracelulares, incluidos PI3K/AKT
y RAS/ERK, pero inducen diferentes respuestas celulares. Por ejemplo, tanto EREG como EGF comparten el mismo receptor EGFR, pero EREG promueve la diferenciación (Diff) mientras
que EGF promueve la proliferación (Prolif) en las células MCF-7. Según el análisis a nivel de población, EREG provoca la fosforilación sostenida de ERK (pERK), mientras que EGF induce
pERK transitorio (Freed et al., 2017). De manera similar, el tratamiento con EGF/NGF de células PC12 induce pERK transitorio/sostenido que se correlaciona con la proliferación/
diferenciación (Marshall, 1995). (D) El análisis de células individuales ha revelado una respuesta heterogénea de las células PC12 al tratamiento con NGF. A nivel de una sola célula,
estas decisiones de destino celular dependen tanto de pERK como de AKT fosforilada (pAKT), con un límite curvo que separa la proliferación y la diferenciación (izquierda). Los bucles
de retroalimentación dentro de la vía NGF (derecha) mantienen la distribución de las actividades pAKT y pERK dentro de la población celular cerca del límite. Adaptado de Chen et al.
con permiso (Chen et al., 2012).

Huff et al., 1981), aunque las dos vías señalizan a través de
efectores posteriores superpuestos, como AKT y ERK (Fig.
2C). Estudios pioneros que utilizaron poblaciones
sincronizadas de células revelaron que EGF induce la
fosforilación transitoria de ERK (pERK), mientras que NGF
induce pERK sostenida (Fig. 2C; Traverse et al., 1992), lo que
lleva a la hipótesis de que la dinámica de ERK podría
representar el ligando activador y el receptor. identidad.
Numerosos estudios posteriores en el mismo sistema
experimental han revelado cómo la codificación y
decodificación de la duración de pERK surgen tanto de la
actividad de los complejos ligando-receptor como de los
circuitos de procesamiento de señales aguas abajo (Kao et
al., 2001; Marshall, 1995; Murphy et al., 2002). , 2004; Santos
et al., 2007; Sasagawa et al., 2005; Traverse et al., 1994;
Uhlitz et al., 2017; Whitmarsh, 2007). Sin embargo,
El trabajo más reciente ha comenzado a analizar la dinámica de señalización
RTK en células individuales. Por ejemplo, utilizando un biosensor basado en
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para rastrear la
dinámica de actividad de ERK en células individuales en tiempo real, Ryu et al.
descubrió que la aplicación de EGF o NGF conduce a una población mixta de
células PC12 con actividad pERK transitoria o sostenida, respectivamente (Ryu et
al., 2016). También se observó una heterogeneidad similar a nivel de pERK y toma
de decisiones sobre el destino celular (proliferación frente a diferenciación) al
la regulación a la baja de la señalización de Ras/ERK en respuesta a la señalización
de PI3K/AKT parece desplazar las actividades de señalización más cerca de este
límite de destino, lo que permite que una fracción de células permanezca en un
estado proliferativo en una variedad de entradas. Funcionalmente, este sistema de
procesamiento de señales activas podría equilibrar el número de células en
estados de proliferación o diferenciación y, por lo tanto, la estructura general de la
población celular. Dado que EGF y NGF provocan diferentes fenotipos celulares,
sería interesante investigar si diferentes RTK participan en bucles de
retroalimentación aguas abajo similares o distintos, o si las diferentes dinámicas
son el resultado de diferentes características estructurales de varios complejos
ligando-receptor. También se ha observado el control combinatorio de una
respuesta celular por parte de AKT y ERK en células epiteliales de glándulas
mamarias humanas individuales estimuladas con varios factores de crecimiento
(Sampattavanich et al., 2018). Por lo tanto, el sistema de señalización RTK
proporciona un ejemplo importante e intrigante de cómo las vías de señalización
no solo transmiten entradas, sino que las procesan activamente para controlar la
estructura de la población, y cómo las mediciones cuantitativas,
multidimensionales y de una sola célula pueden proporcionar información sobre la
relación entre el procesamiento de señales y la célula. toma de decisiones del
destino.
Modulación o programación de la especificidad del ligando
En los ejemplos discutidos anteriormente, múltiples ligandos activan diferentes
respuestas a través de la misma vía. Pero en otros contextos, las células pueden
DESARROLLO

analizar la morfología celular y los marcadores de proliferación en células fijadas
(Chen et al., 2012). Chen et al. demostró además que los niveles de pERK por sí
solos no predicen los resultados del destino celular. Más bien, el destino celular
depende de una combinación de actividades de AKT y ERK. En realidad, la decisión
entre la diferenciación y la proliferación se puede discriminar por un límite curvo
en este espacio de señalización de dos vías (Fig. 2D). Curiosamente, un ciclo de
retroalimentación mediado por
responder selectivamente a algunos ligandos pero no a otros. Cuando ligandos
diferentes usan receptores distintos, esto podría lograrse simplemente a través de
la expresión diferencial del receptor. Sin embargo, las células parecen detectar
ligandos específicos de forma selectiva, incluso cuando múltiples ligandos pueden
emitir señales a través de los mismos receptores. Una forma de lograr esto es a
través de moduladores de vías, como correceptores y enzimas que inhiben o
facilitan la unión entre ligandos específicos.

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y receptores, y así alterar la especificidad de la comunicación. Por Una modulación de amplitud B Detección de cambio de plegado
ejemplo, las glicosiltransferasas Fringe modifican los receptores Notch,
t0 tfinal t0 tfinal
alterando su preferencia por los ligandos Delta o Jagged (LeBon et al.,

ligando

TGF-β
2014; Moloney et al., 2000; Panin et al., 1997). De manera similar, en la
vía Wnt, el correceptor Reck de la superficie celular puede reconocer Tiempo Tiempo

específicamente Wnt7, pero no otros Wnt, y recluta a Wnt7 en los Celda 1

Smad3 (C)
Nuclear
Celda 1 Celda 2
signalosomas dinámicos Wnt/Frizzled/Lrp5/6 (Eubelen et al., 2018). Esto

Actividad
...
Celda 2
... celda n
podría explicar cómo Wnt7 controla exclusivamente el prosencéfalo de celda n

los mamíferos y la angiogénesis de la médula espinal ventral dentro del Tiempo Tiempo

Smad3 nuclear
sistema neurovascular.

cambio de pliegue
Modulación de frecuencia C
La biología sintética permite un enfoque complementario
1
para comprender la especificidad de la comunicación mediante

FEAG
la ingeniería de canales de comunicación sintéticos
Tiempo Tiempo

'ortogonales' (independientes) (Elowitz y Lim, 2010). Por Tiempo Tiempo

ejemplo, los dominios de unión a ligandos extracelulares y los

Gen diana
ARNm
dominios efectores intracelulares de Notch pueden

Nuclear
reemplazarse con dominios alternativos diseñados para crear

gaje
S tfinal) S tfinal)/S t0)
receptores sintéticos que detectan entradas arbitrarias y (Nivel absoluto) (Cambio de pliegue)
Tiempo Tiempo
activan genes diana arbitrarios (Morsut et al., 2016). Estos y
otros sistemas de comunicación sintética relacionados se han D Modulación de amplitud y duración
utilizado para controlar las respuestas de las células D D
inmunitarias (Roybal et al., 2016), diseñar patrones gli

gli
multicelulares sintéticos (Toda et al., 2018) y mapear el

(Amplitud)
[ SHH]
Olig2Nkx2.2

gli
contacto directo entre células y las conexiones neuronales (He

gli
Pax6
et al. , 2017; Huang et al., 2016, 2017). Al demostrar la Pax6 Olig2

gli
Tiempo

posibilidad de multiplexación ortogonal, provocan la pregunta, Tiempo

Irx3 (duración) Nkx2.2
V V

Concentración de ligando de detección Fig. 3. Diferentes estrategias para detectar la concentración de ligando. (A) En los
Para la mayoría de las vías de desarrollo, diferentes concentraciones de ligandos pueden sistemas de "modulación de amplitud" más simples, las concentraciones de ligandos se
desencadenar distintas respuestas celulares. Por ejemplo, a lo largo de un gradiente de codifican en las concentraciones de efectores intracelulares. (B) La ruta de TGF-β puede

morfógeno, las células adyacentes se comprometen a destinos distintos en función de las
pequeñas diferencias en la concentración de ligando local. En el escenario más simple,
concentraciones más altas de ligando generan actividades correspondientemente más
altas de efectores intracelulares (Fig. 3A). Sin embargo, trabajos recientes han comenzado
a revelar esquemas de procesamiento de señales más complejos.
Detección de cambio de pliegue de concentración de ligando
En algunos sistemas, la concentración de ligando controla el cambio de pliegue
(posestímulo dividido por la actividad de preestímulo) de un efector intracelular,
en lugar de su nivel absoluto, y este cambio de pliegue a su vez determina las
respuestas celulares (Adler y Alon, 2018). La evidencia temprana para la detección
de cambio de pliegue (FCD) en la señalización del desarrollo provino de la
observación enXenopoque los resultados del desarrollo dependen de los cambios
en los pliegues, en lugar de los niveles absolutos, de β-catenina, el efector aguas
abajo de Wnt (Goentoro y Kirschner, 2009).
El análisis de FCD requiere el seguimiento de la actividad de señalización
antes y después de la estimulación en la misma célula. Para lograr esto, Frick
et al. utilizaron imágenes cuantitativas de lapso de tiempo de células
individuales para demostrar que FCD es utilizado por la vía TGF-β (Frick et al.,
codificar la concentración de ligando en el cambio de veces, en lugar del nivel absoluto,
de su efector nuclear Smad3 (S). A nivel de células individuales, las células muestran
niveles muy heterogéneos de Smad3 nuclear tanto antes como después del tratamiento
con TGF-β (paneles superiores), y la distribución del nivel absoluto de Smad3 se
superpone significativamente entre diferentes grupos de concentración (segunda fila).
Sin embargo, los cambios de pliegue de Smad3 nuclear (post-estímulo dividido por su
nivel de pre-estímulo en la misma celda) muestran menos heterogeneidad y
distribuciones mejor separadas entre diferentes grupos de concentración (tercera fila).
Además, la expresión del gen objetivo se correlaciona mejor con el cambio de veces, [S(t
final)/S t0)] que con el nivel absoluto, S(tfinal), de nuclear Smad3 (fila inferior). Los puntos
representan el número de las mismas transcripciones en células individuales tratadas con
concentraciones bajas (gris) o altas (azul) de TGF-β. (C) EGF induce oscilaciones
coherentes de transporte de pERK entre el núcleo y el citoplasma en ciertos contextos
celulares, y la concentración de EGF regula la frecuencia de estas oscilaciones. (D) En el
desarrollo de embriones de ratón y pollo, la SHH secretada desde el lado ventral del tubo
neural forma un gradiente de concentración. Las células en diferentes posiciones
codifican diferentes concentraciones de SHH en perfiles de actividad Gli con distinta
amplitud y duración. La actividad de Gli luego es decodificada por los circuitos de decisión
de destino aguas abajo, compuestos por múltiples factores de transcripción. Un mapa
bidimensional basado tanto en la amplitud como en la duración de la actividad de Gli
determina la salida del destino celular, y por lo tanto los dominios espaciales de distintos
tipos de células progenitoras. D, dorsales; V, ventral. Adaptado de Briscoe & Small con

2017). Los autores estimularon las células C2C12 con diferentes permiso (Briscoe and Small, 2015).

concentraciones de ligando TGF-β, cuantificaron la localización nuclear del

efector Smad3 de TGF-β antes y después de la estimulación utilizando
imágenes de lapso de tiempo y analizaron la expresión de objetivos aguas
abajo en las mismas células mediante fluorescencia de molécula única.en el
lugarhibridación (FISH). Combinando estos enfoques de células individuales,
El análisis teórico y la perturbación experimental han identificado arquitecturas
específicas de circuitos aguas abajo que podrían realizar FCD, como bucles de
retroalimentación tipo 1 incoherentes (Goentoro et al., 2009), bucles de
retroalimentación integral no lineal (Shoval et al., 2010) y bucles logarítmicos.
DESARROLLO

descubrieron que diferentes concentraciones de TGF-β inducen diferentes
cambios en los niveles de Smad3 nuclear. Además, observaron que la
expresión de objetivos transcripcionales aguas abajo se correlaciona más
fuertemente con el cambio de pliegue que con el nivel absoluto de Smad3
nuclear (Fig. 3B). También se han sugerido o informado ejemplos similares
de FCD en vías que emplean ERK o NF-κB como efectores intracelulares
(Cohen-Saidon et al., 2009; Lee et al., 2014). Es más,
sensores (Olsman y Goentoro, 2016), como se revisó en otro lugar (Adler et al.,
2017). Juntos, estos resultados respaldan a FCD como un modo predominante de
detección y decodificación de la concentración de ligandos.
¿Qué ventaja ofrece FCD en comparación con la detección más directa del nivel
absoluto de actividad efectora? Un beneficio es reducir la variabilidad de célula a
célula en las respuestas a la estimulación con ligandos homogéneos. Las células
son inherentemente heterogéneas, o "ruidosas", en el

4
REVISIÓN
nivel de expresión de los componentes de la vía (p. ej., receptores y efectores). Tal
heterogeneidad podría conducir a una alta variabilidad en el nivel absoluto de
actividad efectora tanto en el estado basal como en el estimulado por ligando. Sin
embargo, al detectar la proporción de actividad posterior a la preestimulación,
muchas fuentes de variabilidad se "cancelan" de manera efectiva, proporcionando
una lectura más precisa de la entrada (Frick et al., 2017). FCD, por lo tanto, puede
reducir efectivamente la variabilidad de célula a célula y compensar el ruido
biológico.
Modulación de frecuencia por concentración de ligando
La concentración de ligandos puede representarse por la frecuencia,
duración o amplitud de las oscilaciones del efector (Hao et al., 2013). Por
ejemplo, en células epiteliales mamarias humanas (HMEC) y células MCF-10A,
el EGF induce el desplazamiento oscilatorio de ERK fosforilado entre el
núcleo y el citoplasma, y la concentración de EGF controla la frecuencia de
oscilación (Albeck et al., 2013; Shankaran et al., 2009) (Fig. 3C). También se
han informado oscilaciones ERK similares en Caenorhabditis elegans (de la
Cova et al., 2017). Para probar si la dinámica de ERK genera respuestas
celulares diferenciales, Toettcher y sus colegas utilizaron enfoques
optogenéticos para controlar directamente la actividad de ERK en células
individuales (Toettcher et al., 2013). Aprovecharon la interacción proteína-
proteína activada por la luz entre el fitocromo B (Phy) y el PIF (Shimizu-Sato
et al., 2002). Al anclar Phy a la membrana celular, donde reside la proteína
Ras, y al fusionar el activador de Ras (SOScat) con el PIF localizado en el
citoplasma, pudieron usar la luz para encender y apagar la interacción
SOScat-Ras en segundos, activando Ras , que a su vez fosforila ERK. De esta
manera, demostraron que diferentes dinámicas de oscilación de ERK son
suficientes para inducir distintos programas de expresión génica (Wilson et
al., 2017). Es más, identificaron una red de genes tempranos inmediatos que
descifran directamente la dinámica de ERK en las células NIH3T3. Como las
oscilaciones de ERK no están sincronizadas entre las células, estos
descubrimientos dependieron de imágenes cuantitativas de lapso de tiempo
de células individuales y el desarrollo de indicadores fluorescentes, como
una proteína de fusión ERK-GFP, un indicador de actividad ERK basado en
FRET y un indicador de translocación de quinasa dependiente de
fosforilación ( Regot et al., 2014).
La modulación de frecuencia ahora se ha observado en diversos sistemas
de señalización, incluido p53 en células cancerosas (Lahav et al., 2004; Purvis
and Lahav, 2013), NF-κB en el sistema inmunitario (Hoffmann, 2002; Nelson
et al., 2004) , señalización de calcio-NFAT (Yissachar et al., 2013), señalización
de Notch/Hes en neurogénesis y mantenimiento de células madre (Hirata et
al., 2002; Imayoshi et al., 2013; Manning et al., preimpresión de 2018;
Shimojo et al. ., 2008), así como en varias rutas de levadura (Cai et al., 2008;
Hao y O'Shea, 2012; Lin et al., 2015). En levadura, una pantalla sistemática
basada en películas que se encuentra pulsando en∼10% de los factores de
transcripción (Dalal et al., 2014), lo que sugiere que es probable que
prevalezcan dinámicas pulsátiles u oscilatorias.
A pesar de mucho trabajo en sistemas individuales, las preguntas clave
sobre pulsaciones y oscilaciones siguen sin estar claras. Por ejemplo, aunque
el trabajo teórico reciente identificó circuitos reguladores candidatos que
podrían decodificar la dinámica (Gao et al., 2018) y examinó los mecanismos
de decodificación dinámica por parte de los promotores objetivo en la
levadura (Hansen y O'Shea, 2013), la decodificación sigue sin entenderse por
completo en la mayoría de los contextos. Un segundo problema es la
dependencia del contexto. ERK exhibe oscilaciones moduladas por
frecuencia en células epiteliales, pero pulsos adaptativos modulados por
duración en células PC12 (Albeck et al., 2013; Marshall, 1995; Shankaran et
al., 2009). Del mismo modo, a principiosdrosófilaembrión, las respuestas
celulares dependen de la actividad integrada de ERK a lo largo del tiempo
(Johnson y Toettcher, 2019), en lugar de otras características de la dinámica.
Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977
Comprender cómo el contexto celular afecta la decodificación es un desafío clave.
Finalmente, ¿por qué las oscilaciones suelen ser más esporádicas que periódicas
(Levine et al., 2013)? Una posibilidad es que el sistema funcione principalmente
para controlar, por ejemplo, mediante la frecuencia de pulsos, la fracción total de
tiempo que un regulador dado está activo. Se necesitan más estudios para revelar
los principios del procesamiento dinámico de señales, las compensaciones entre
esquemas de procesamiento alternativos y formas de intervenir y modular
racionalmente la dinámica de señalización.
Modulación de amplitud y duración en gradientes de morfógenos
La concentración de ligando también puede representarse por la amplitud y
duración de pulsos adaptativos de actividad efectora. Un ejemplo clásico
ocurre en el desarrollo del tubo neural, durante el cual múltiples
morfógenos juntos especifican patrones de tejido complejos. Uno de estos,
Sonic hedgehog (SHH), forma un gradiente de concentración en el lado
ventral del tubo neural, especificando varios dominios de destino de
progenitores neurales (Briscoe y Small, 2015). Aquí, la concentración de SHH
controla la amplitud y la duración de un pulso adaptativo de actividad de
señalización de SHH intracelular (Cohen et al., 2015; Dessaud et al., 2007).
Análisis cuantitativo de la dinámica de señalización de SHH, según lo
informado por la actividad del efector Gli aguas abajo y la expresión de
marcadores de destino celular (Pax6, Olig2 y Nkx2.2), ha sugerido que tanto
la amplitud como la duración de la actividad de Gli determinan
colectivamente el destino de las células progenitoras neurales en pollos y
ratones (Dessaud et al., 2007) (Fig. 3D). Estas características de la actividad
efectora se descifran a través de una red reguladora de genes corriente
abajo compuesta por los mismos factores de transcripción que marcan el
destino de las células progenitoras (Balaskas et al., 2012). Un trabajo reciente
en el pez cebra sugiere que las regiones anterior y posterior del tubo neural
del pez cebra en desarrollo podrían ser sensibles a características distintas,
pero superpuestas, de la señal de actividad SHH dinámica (Xiong et al.,
preimpresión de 2018). Estos estudios plantean la pregunta de cuántos
modos de procesamiento de señales existen, cómo varían entre los
contextos de tejido y especie, y cómo se ven afectados por factores como la
geometría del tejido y la velocidad de desarrollo.
Detección de combinaciones de ligandos
Dentro de un embrión, las células están más expuestas a "cócteles" de
múltiples ligandos que a una sola especie de ligando. Estudios recientes
sugieren que las células pueden extraer información codificada en
combinaciones de múltiples ligandos, tanto dentro de una sola vía como
entre múltiples vías.
La promiscuidad ligando-receptor permite la detección combinatoria
Dentro de la vía de la proteína morfogenética ósea (BMP), múltiples ligandos
y receptores interactúan de manera promiscua (Fig. 2A). En la mayoría de los
procesos de desarrollo, múltiples ligandos de BMP están presentes en
regiones superpuestas del tejido y las células individuales típicamente
expresan múltiples variantes de receptores (Danesh et al., 2009; Salazar et
al., 2016). Estas observaciones provocan la pregunta general de qué
capacidad funcional podrían proporcionar estas aparentes redundancias.
Por lo tanto, estudios recientes han utilizado modelos matemáticos y
enfoques experimentales para analizar las formas en que BMP y las vías más
grandes de TGF-β procesan señales de múltiples ligandos (Vilar et al., 2006;
Antebi et al., 2017). Al estudiar cuantitativamente la respuesta de la vía BMP
DESARROLLO
a la presentación simultánea de múltiples ligandos, Antebi et al. mostró que
las células pueden responder a las concentraciones relativas (en lugar de
absolutas) de dos ligandos de formas complejas (Antebi et al., 2017). Por
ejemplo, la vía puede responder a la proporción de dos concentraciones de
ligando, similar a otros sistemas de detección radiométricos (Vilar et al.,
2006; Escalante-Chong et al., 2015), o activarse cuando esos
5
REVISIÓN
los ligandos están cerca ('detección de equilibrio') o lejos de ('detección de
desequilibrio') una relación de concentración específica (Fig. 4A). Molecularmente,
estos cálculos pueden surgir de interacciones competitivas entre el receptor y el
ligando que forman distintos complejos de señalización de proteínas, que luego
fosforilan los efectores aguas abajo a diferentes velocidades. En el caso más
simple, la detección radiométrica puede surgir cuando dos ligandos compiten para
formar complejos activos o inactivos con los mismos receptores. Además, cambiar
el perfil de los receptores expresados puede alterar el cálculo que realiza la vía en
un conjunto determinado de ligandos (Fig. 4A). En consecuencia, la alteración de la
concentración de un solo ligando podría tener efectos opuestos en las células que
exhiben diferentes perfiles de expresión del receptor. Este resultado sugiere una
solución combinatoria al problema de la especificidad de la comunicación en
sistemas promiscuos: la señalización se produce en una alta dimensión, espacio de
codificación combinatoria, con células que efectivamente "sintonizan" a través de
su perfil de expresión de receptor para detectar información codificada en
combinaciones de ligandos. Un estudio teórico reciente sugiere funciones
adicionales para el ligando-receptor promiscuo
A Dos ligandos en la misma vía
BMP radiométrico
9 8
GDF5
BMP10
1 receptores
Aditivo
7 BMP4
Actividad
BMP9
1 BMPR2
7.5
BMP4
BMP9
BMP9
1 1
BMP4
B Dos caminos ortogonales
D no
gli pSmad
BMP
yo
V Percepción de la dinámica del ligando
Actividad de SHH
V D
D: destino dorsal
yo
SHH
yo: destino intermedio
V: destino ventral Actividad BMP
V
Fig. 4. Combinaciones de detección de múltiples ligandos en las mismas vías u ortogonales. (A)
Múltiples ligandos de BMP a menudo pueden unirse a los mismos receptores. La actividad de la
ruta en este contexto puede ser una función compleja de las combinaciones de ligandos. Las
células que expresan los mismos receptores pueden calcular diferentes funciones de distintas
combinaciones de ligandos, incluidas las relaciones aditivas, radiométricas o desequilibradas
entre los dos ligandos (fila superior). Las células también pueden cambiar sus perfiles de
expresión de receptores para calcular diferentes funciones de las mismas combinaciones de
ligandos (fila inferior). Por ejemplo, BMP4 y BMP9 exhiben una relación aditiva en las células
NMuMG, mientras que la eliminación de BMPR2 en las células NMuMG o la alteración del perfil de
expresión de BMPR por completo en un tipo de célula diferente, como las células madre
embrionarias de ratón (mESC), cambia por completo la relación del ligando. (B) SHH y BMP
establecen gradientes antiparalelos en el tubo neural en desarrollo para especificar varios
dominios de destino del progenitor neural dorsal (D), intermedio (I) y ventral (V). Las
concentraciones de ligandos de las dos vías ortogonales controlan las actividades de sus
efectores intracelulares canónicos, Gli y pSmad, que posteriormente son decodificados por una
red reguladora de genes, representada aquí en su forma abstracta. Las diferentes combinaciones
de concentraciones de BMP y SHH conducen a distintos destinos celulares: SHH-bajo/BMP-bajo
produce destinos intermedios, mientras que SHH-alto/BMP-alto produce destinos dorsales o
ventrales de manera estocástica, pero no destinos intermedios, lo que sugiere que las células no
mida el nivel relativo de los dos ligandos. Los diferentes destinos de progenitores dorsales se
indican mediante diferentes tonos de rojo, y los diferentes destinos de los progenitores ventrales
se indican mediante diferentes tonos de azul. Adaptado de Zagorski et al. con permiso (Zagorski
et al., 2017).
Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977
detección, incluida una mayor precisión de detección (Carballo-Pacheco
et al., 2019). Dada la prevalencia de tales interacciones ligandreceptor
promiscuas, es tentador especular que estos cálculos combinatorios
basados en la promiscuidad podrían usarse de manera más amplia
para permitir que diferentes tipos de células respondan en diferentes
entornos de ligando.
Integración de información de vías ortogonales
Un tema recurrente en el desarrollo es el uso de múltiples vías de señalización simultánea o secuencialmente en un proceso de
desarrollo dado. Sin embargo, la lógica subyacente de cómo se integra la información a partir de vías ortogonales a menudo
permanece oscura. En el tubo neural en desarrollo, BMP y SHH forman gradientes dorsoventrales antiparalelos que juntos modelan al
menos diez destinos celulares distintos a lo largo del eje dorsoventral. Para comprender cómo se combina la información de las dos
vías para controlar el destino de las células, Zagorski et al. utilizó la tinción de Smad fosforilada (pSmad) y un indicador de señalización
de SHH para medir cuantitativamente las actividades de ambas vías a lo largo del eje dorsal-ventral y correlacionar estas actividades
con las identidades posicionales resultantes (Zagorski et al., 2017). Como era de esperar, BMP-high/SHH-low provocó destinos
dorsales, Destinos ventrales provocados por BMP-bajo/SHH-alto y destinos especificados por BMP-bajo/SHH-bajo en la zona
intermedia (Fig. 4B). Curiosamente, sin embargo, el tratamiento simultáneo de explantes de tubo neural de pollo con concentraciones
altas de BMP7 y SHH produjo una mezcla de progenitores dorsales y ventrales, pero no destinos intermedios. Este comportamiento
sugiere que, a altas concentraciones de ligando, las decisiones sobre el destino celular pueden ser exclusivas y estocásticas. Los
autores demostraron además cómo un circuito regulador de genes propuesto puede recapitular estos comportamientos de
integración de señales medidos experimentalmente a través de diferentes combinaciones de concentraciones de BMP/SHH (Fig. 4B).
Desequilibrio Es importante destacar que la adquisición de información posicional de ambos gradientes parecía ayudar a minimizar el error
Diferente posicional, un principio que podría generalizarse a otros sistemas de patrones. y destinos especificados BMP-bajo/SHH-bajo en la zona
ligandos,
mismo intermedia (Fig. 4B). Curiosamente, sin embargo, el tratamiento simultáneo de explantes de tubo neural de pollo con concentraciones
1 altas de BMP7 y SHH produjo una mezcla de progenitores dorsales y ventrales, pero no destinos intermedios. Este comportamiento
BMP4
sugiere que, a altas concentraciones de ligando, las decisiones sobre el destino celular pueden ser exclusivas y estocásticas. Los
autores demostraron además cómo un circuito regulador de genes propuesto puede recapitular estos comportamientos de
mESC
4.1Mismo integración de señales medidos experimentalmente a través de diferentes combinaciones de concentraciones de BMP/SHH (Fig. 4B).
ligandos, Es importante destacar que la adquisición de información posicional de ambos gradientes parecía ayudar a minimizar el error
diferente
receptores posicional, un principio que podría generalizarse a otros sistemas de patrones. y destinos especificados BMP-bajo/SHH-bajo en la zona
BMP4 intermedia (Fig. 4B). Curiosamente, sin embargo, el tratamiento simultáneo de explantes de tubo neural de pollo con concentraciones
altas de BMP7 y SHH produjo una mezcla de progenitores dorsales y ventrales, pero no destinos intermedios. Este comportamiento
sugiere que, a altas concentraciones de ligando, las decisiones sobre el destino celular pueden ser exclusivas y estocásticas. Los
autores demostraron además cómo un circuito regulador de genes propuesto puede recapitular estos comportamientos de integración de señales medidos exp
D
Experimentalmente, suele ser conveniente estudiar las respuestas a
yo
D aumentos repentinos en la concentración de ligando. Sin embargo, dentro
V de un embrión en desarrollo, las concentraciones de ligandos pueden
cambiar continuamente. Cómo las células extraen información útil de
entornos en constante cambio es una pregunta importante pero
relativamente poco estudiada. Recientemente, Sorre et al. aplicó
microfluidos e imágenes cuantitativas de lapso de tiempo para estudiar la
respuesta de la vía TGF-β a diferentes dinámicas de ligandos (Sorre et al.,
2014). Analizaron la capacidad de TGF-β para bloquear la diferenciación de
células C2C12 en miotubos en condiciones de suero bajo. Combinando un
reportero GFP-Smad4 para monitorear dinámicamente la localización
nuclear de Smad4 y un reportero transcripcional sintético para cuantificar la
actividad del promotor objetivo, observaron que un aumento gradual en
TGF-β induce una fuerte respuesta de señal adaptativa, como se informó
anteriormente (Strasen et al., 2018; Vizán et al., 2013; Warmflash et al., 2012).
También surgieron dos comportamientos interesantes. En primer lugar,
descubrieron que el tratamiento de las células con un "tren de pulsos" de
TGF-β (es decir, pulsos de 1 h separados por 6 h) bloquea la diferenciación de
manera más eficiente en comparación con la exposición continua (15 h) al
DESARROLLO
mismo ligando a la misma concentración (Fig. 5A) (Sorre et al., 2014). Un
aspecto crucial es la duración del intervalo entre pulsos sucesivos, que debe
ser mayor que un tiempo mínimo de recuperación para producir el efecto
elevado. Se ha observado un efecto similar de los intervalos de entrada en
las respuestas celulares en células PC12 tratadas con EGF/NGF pulsátil y en
células de neuroblastoma tratadas con TNF-α pulsátil (Ashall et al., 2009; Ryu
et al., 2016). Aunque los mecanismos moleculares
6
REVISIÓN
A Paso Pulsos
TGF-β
mioblastos
Tiempo Tiempo
Bajo
suero TGF-β
Nuclear
Smad4
miotubos
Tiempo Tiempo
(diferenciación) Más Menos
diferenciación diferenciación
B Rampa rápida rampa lenta
TGF-β
Tiempo Tiempo
Nuclear
Smad4
Tiempo Tiempo
Fig. 5. Percepción de tasas de cambio en la concentración de ligando. (A) El tratamiento con TGF-β
escalonado pero sostenido conduce a una dinámica adaptativa de la actividad de señalización
intracelular, que se mide por el nivel de Smad4 nuclear. La exposición sostenida a TGF-β es menos
eficaz que la exposición pulsátil a TGF-β para inhibir la diferenciación de mioblastos en miotubos,
que es inducida por un bajo nivel de suero en el cultivo. (B) En el mismo sistema experimental, el
aumento gradual de la concentración de TGF-β activa la señal con menos fuerza que un aumento
escalonado repentino en la concentración del ligando. La tasa de cambio en la concentración de
ligando se correlaciona con la amplitud de la respuesta.
el control de la duración de los períodos refractarios sigue sin estar claro, es
probable que estén involucrados bucles de retroalimentación negativa que operan
en escalas de tiempo específicas. En segundo lugar, los autores encontraron que el
aumento gradual de la concentración de ligando genera diferentes resultados en
comparación con un aumento repentino a la misma concentración final de ligando
(Fig. 5B). De hecho, la amplitud de la respuesta se correlaciona con la tasa de
aumento en la concentración del ligando, con un aumento más lento que conduce
a respuestas amortiguadas, similar a la tasa de detección de cambios en bacterias
(Shimizu et al., 2010; Young et al., 2013). Esto podría tener implicaciones
interesantes en los gradientes de morfógenos, en los que las células en diferentes
posiciones podrían experimentar no solo diferentes concentraciones de ligando
sino también diferentes tasas de cambio en la concentración de ligando. Por
último, es interesante contrastar TGF-β con BMP4. Ambos ligandos pertenecen a la
misma superfamilia de ligandos de señalización, pero BMP4 induce una actividad
de señalización sostenida mientras que la adaptación temporal parece estar
integrada en la vía del TGF-β (Nemashkalo et al., 2017; Yoney et al., 2018). No está
claro cómo y por qué las vías exhiben comportamientos dinámicos tan distintos.
Códigos de señalización espacio-temporales para patrones multicelulares
Uno de los objetivos clave de los estudios de los códigos de comunicación
intercelular es comprender, predecir y diseñar el comportamiento a nivel de tejido.
Para comprender cómo surge el comportamiento multicelular de los que pudimos demostrar que las oscilaciones de Notch podrían impulsar el procesamiento de
información correspondiente en células individuales, es necesario primero
saque las células de sus contextos espaciales, controle con precisión la entrada del
ligando y mida cuantitativamente las salidas de la señal y el destino celular, como
en los ejemplos discutidos anteriormente. Sin embargo, el estudio de las células de
forma aislada descuida las funciones de la geometría y la polaridad del tejido, así
como la secreción de ligandos y la expresión de receptores espacialmente
organizados, en el comportamiento general de señalización y patrones de un
tejido multicelular (Butler y Wallingford, 2017; Chan et al., 2017). ). Por lo tanto, es
esencial estudiar los roles de las vías de señalización en contextos multicelulares
organizados espacio-temporalmente.
Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977
Uno de los tipos de información más importantes que codifican los ligandos es
la posición espacial dentro de un tejido en desarrollo. En los modelos clásicos más
simples de patrones morfogenéticos, las concentraciones de ligandos disminuyen
lejos de una fuente, de modo que las células receptoras de señales pueden inferir
su posición a partir de la concentración local de ligandos (Rogers y Schier, 2011).
Sin embargo, las vías de señalización en las células receptoras emplean bucles de
retroalimentación complejos (Fig. 1A), que de hecho pueden modular activamente
la distribución espacial de los ligandos extracelulares y la actividad de señalización
intracelular (Freeman, 2000; Perrimon y McMahon, 1999). Aunque estos sistemas
son inherentemente difíciles de analizar dentro de contextos de desarrollo
complejos, un trabajo reciente ha demostrado que muchos comportamientos de
patrones espaciales complejos se pueden analizar en sistemas reconstituidos fuera
del embrión. Dichos estudios arrojan luz sobre los principios básicos de cómo las
actividades de las vías dentro de las células individuales impactan en la formación
de patrones a escala multicelular. Aquí, destacamos ejemplos de formación de
patrones tanto espontáneos como sintéticos en células cultivadas.
Reconstituyendo la formación de patrones espontáneos
Uno de los ejemplos más fascinantes de patrones de tejidos es la
somitogénesis (Hubaud y Pourquié, 2014; Oates et al., 2012). El tejido del
mesodermo presomítico indiferenciado (PSM) se diferencia progresivamente
en una serie de somitas a través de un proceso que involucra oscilaciones
estrechamente coordinadas y gradientes espaciales de múltiples vías de
señalización que producen ondas cinemáticas de actividad (Soroldoni et al.,
2014). Aunque la somitogénesis se ha representado con un detalle
espectacular dentro de los embriones, desentrañar las funciones dinámicas
de las diferentes vías de señalización durante la somitogénesis a nivel de una
sola célula sigue siendo un desafío en los embriones. Sin embargo, el cultivo
de células PSM individualesin vitroha permitido la observación directa de las
actividades de la vía de señalización, por ejemplo, la actividad de la vía
Notch.
A diferencia de susen vivocontrapartes, las células PSM aisladas no
mantienen oscilaciones en los objetivos de la vía Notch (Masamizu et
al., 2006; Palmeirim et al., 1997; Webb et al., 2016). Sin embargo, la
reagregación de células PSM no sincronizadas en cultivos 2D hace que
las células se autoorganicen en el espacio y el tiempo para crear ondas
de señalización Notch sincronizadas que se mueven a través de campos
de células, lo que recuerda al reloj de segmentación.en vivo (Hubaud et
al., 2017; Lauschke et al., 2012; Tsiairis y Aulehla, 2016). Más
recientemente, Hubaud y sus colegas utilizaron 2Din vitro-PSM
cultivado para estudiar si las oscilaciones autosostenidas pueden
ocurrir de manera autónoma celular o si surgen de interacciones entre
células (Hubaud et al., 2017). Al disociar, reagregar y sembrar células
PSM en diferentes densidades, los autores demostraron que las
oscilaciones son una propiedad colectiva de las células que requiere
señalización intercelular activa a través de las vías de señalización Yap y
Notch (Fig. 6A). En un estudio separado, Sonnen y sus colegas usaron
PSM cultivado junto con microfluidos para investigar el papel del
tiempo relativo de las oscilaciones de Notch y Wnt (Sonnen et al., 2018).
Al forzar oscilaciones directamente en una vía, en la otra o en ambas,
Wnt oscilaciones y viceversa. Usando este sistema, investigaron el papel
funcional del tiempo relativo observado, o la fase, en el patrón. Se sabe
que la diferencia de fase entre las vías cambia naturalmente de antifase
DESARROLLO
a en fase a lo largo del eje posterior-anterior del PSM. Al impulsar las
oscilaciones de las dos vías dentro o fuera de fase, demostraron
directamente que el tiempo relativo de estas oscilaciones controla la
segmentación (Fig. 6B). Por lo tanto, las células pueden codificar
información posicional en el momento relativo de las actividades de la
vía oscilatoria. Es interesante comparar estos hallazgos con trabajos
recientes en levadura que muestran de manera similar que
7
REVISIÓN Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977

Una dinámica emergente B Modulación de fase en el espacio Se han aplicado enfoques de reconstitución similares a las células madre
Células individuales Población embrionarias para permitir la diferenciación organizada espacialmente en
A

Actividad
Segmento 2D y 3D. Algunos de los modelos 2D son especialmente compatibles con
imágenes cuantitativas de lapso de tiempo y perturbaciones controladas
Tiempo

espacio-temporalmente y, por lo tanto, son particularmente adecuados para

estudiar actividades de señalización en el espacio y el tiempo a nivel de una

Actividad
Muesca
Actividad

Actividad

PAGS Wnt sola célula (Martyn et al., 2018; Morgani et al. ., 2018; Thorne et al., 2018;
Tiempo
Tiempo Tiempo
Warmflash et al., 2014; Yoney et al., 2018). Juntos, estos sistemas están
preparados para abordar cuestiones fundamentales sobre cómo se codifica
C Reconstitución de abajo hacia arriba D
la información de señalización del desarrollo en el espacio y el tiempo
remitentes
SHH durante el desarrollo embrionario temprano.
fibroblastos
2
PTCH Formación de patrones de ingeniería sintética de abajo hacia arriba
Señal

Tiempo

1 3 A pesar de nuestra capacidad mejorada de analizar circuitos genéticos naturales, todavía es difícil identificar qué
receptores
Distancia Objetivo circuitos mínimos son suficientes para permitir el patrón espacial, qué parámetros clave controlan el rendimiento del
Ingeniería genética Imágenes cuantitativas sistema y qué compensaciones existen entre los diseños de circuitos alternativos. Para abordar estos problemas, lo

ideal sería volver a cablear sistemáticamente la arquitectura del circuito, ajustar los parámetros clave y medir

E Arquitectura que controla la robustez del gradiente cuantitativamente los comportamientos multicelulares resultantes. A este respecto, los enfoques genéticos

Respuesta de la señal
Precio normal tradicionales de perturbar uno o unos pocos componentes a la vez dentro de un embrión son limitados. Un enfoque
de SHH alternativo es diseñar circuitos genéticos en células que normalmente no los expresan y probar si los circuitos
producción
reconstituidos son suficientes para permitir los comportamientos deseados. Con base en este razonamiento,
Sin realimentación
(mínimo) recientemente hemos reconstituido los gradientes de señalización de SHH en una placa de Petri utilizando fibroblastos

de ratón diseñados que pueden secretar y responder a SHH (Fig. 6C) (Li et al., 2018). En este sistema, los gradientes se
Aumentó PTCH
tasa de SHH retroalimentación forman principalmente a través del movimiento de ligandos dentro de la capa celular, similar a lo que sucede dentro de
producción (natural)
un embrión. Este sistema reconstituido evita la interferencia de los procesos de desarrollo anteriores o paralelos,
intracelular permite el recableado genético de la vía y es compatible con el análisis cuantitativo de la dinámica del gradiente
retroalimentación

(recableado) espacio-temporal. Por lo tanto, brinda una oportunidad única para estudiar cómo los circuitos genéticos permiten

comportamientos multicelulares. similar a lo que sucede dentro de un embrión. Este sistema reconstituido evita la
Fig. 6. Los sistemas reconstituidos permiten el análisis cuantitativo de los códigos de comunicación en el espacio y el
interferencia de los procesos de desarrollo anteriores o paralelos, permite el recableado genético de la vía y es
tiempo. (A,B) Se puede utilizar un sistema de cultivo 2D de células PSM comoin vitromodelo de somitogénesis. Las
compatible con el análisis cuantitativo de la dinámica del gradiente espacio-temporal. Por lo tanto, brinda una
actividades de múltiples vías, incluidas Notch, Wnt y FGF, oscilan en el PSM. Mientras que las células PSM individuales

aisladas exhiben pulsos de activación de señalizaciónen vitro,las poblaciones de células PSM densamente oportunidad única para estudiar cómo los circuitos genéticos permiten comportamientos multicelulares. similar a lo

empaquetadas muestran oscilaciones sincronizadas de una manera dependiente de la densidad (A). Las fases relativas que sucede dentro de un embrión. Este sistema reconstituido evita la interferencia de los procesos de desarrollo

entre la oscilación de la señal Notch y Wnt difieren en diferentes ubicaciones dentro del PSM, con una relación de anteriores o paralelos, permite el recableado genético de la vía y es compatible con el análisis cuantitativo de la
antifase en la parte posterior y una relación en fase en la parte anterior, lo que desencadena la segmentación (B). Por lo
dinámica del gradiente espacio-temporal. Por lo tanto, brinda una oportunidad única para estudiar cómo los circuitos
tanto, la fase entre dos señales oscilatorias puede codificar información espacial. (C) Un sistema de reconstitución de
genéticos permiten comportamientos multicelulares.
gradiente de morfógeno de abajo hacia arriba permite el análisis cuantitativo de la relación causal entre la arquitectura

de la vía y el patrón del tejido. Mediante la ingeniería de fibroblastos de ratón en células que envían y reciben
La vía SHH tiene varias características arquitectónicas únicas (Fig.
morfógenos y colocando en placas las dos poblaciones en arreglos espaciales definidos, se pueden formar gradientes 6D). En primer lugar, la vía tiene una lógica negativa doble, en la que el
dentro de la capa celular en una placa de Petri. La dinámica espacio-temporal se puede medir cuantitativamente receptor PTCH libre inhibe la señal intracelular, y la interacción SHH-
utilizando imágenes de lapso de tiempo. (D) Características arquitectónicas únicas de la vía SHH. El receptor PTCH PTCH conduce a la inactivación mutua y la internalización del complejo,
(púrpura) inhibe la señal descendente y los objetivos transcripcionales (amarillo) en ausencia de SHH (azul) (1). La unión
eliminando efectivamente la inhibición para permitir la activación de la
de SHH-PTCH conduce a la inactivación de PTCH y SHH (2) y, por lo tanto, a la activación de los objetivos aguas abajo. La
vía (Briscoe y Thérond, 2013). ). En segundo lugar, la activación de la vía
activación de la señal induce una retroalimentación negativa conservada evolutivamente a través de la regulación
aumenta la expresión de PTCH, formando un circuito de
positiva de PTCH (3), que secuestra el ligando extracelularmente e inhibe la señal intracelularmente y, por lo tanto, es

bifuncional (flechas rojas). y por lo tanto la activación de los objetivos aguas abajo. La activación de la señal induce una
retroalimentación negativa conservada evolutivamente a través de la regulación positiva de PTCH (3), que secuestra el
ligando extracelularmente e inhibe la señal intracelularmente y, por lo tanto, es bifuncional (flechas rojas). y por lo
tanto la activación de los objetivos aguas abajo. La activación de la señal induce una retroalimentación negativa
conservada evolutivamente a través de la regulación positiva de PTCH (3), que secuestra el ligando extracelularmente e
inhibe la señal intracelularmente y, por lo tanto, es bifuncional (flechas rojas).
(E) Reconectar la vía SHH para explorar diferentes arquitecturas y medir los gradientes
resultantes reveló diferentes grados de solidez a las variaciones en la tasa de producción
de SHH: sin retroalimentación (mínima), la amplitud (la respuesta en la primera celda
junto a la fuente) y longitud del gradiente de señalización son sensibles a un aumento en
la tasa de producción de ligandos (segunda fila versus primera fila); con la
retroalimentación PTCH conservada evolutivamente (natural), tanto la amplitud como la
longitud del gradiente se vuelven más sólidas (segunda fila versus tercera fila); con
retroalimentación negativa intracelular (reconectada) de un PTCH mutante (naranja) que
no se une a SHH pero suprime la señal intracelular (Briscoe et al., 2001), la amplitud del
retroalimentación conservado evolutivamente (Goodrich et al., 1996;
Jeong y McMahon, 2005). En tercer lugar, este circuito de
retroalimentación secuestra ligandos extracelularmente y suprime la
señal intracelularmente (Chen y Struhl, 1996) y, por lo tanto, actúa
como una retroalimentación negativa bifuncional. Para comprender
cómo estas características arquitectónicas impactan en la formación de
gradientes, reconfiguramos la vía SHH para implementar variantes de
vías alternativas que existen y no existen en la naturaleza, y analizamos
sistemáticamente la dinámica espaciotemporal de los gradientes
resultantes (Li et al., 2018) (Fig. 6E). Este análisis reveló que sin la
retroalimentación negativa (diseño mínimo), los gradientes de
señalización son sensibles a las variaciones en la tasa de producción de
ligandos. La retroalimentación de PTCH (diseño natural) hace que el
DESARROLLO

gradiente, pero no la escala de longitud, se vuelve más robusta en comparación con la
ausencia de retroalimentación (última fila versus segunda). fila).
las identidades de diferentes estreses ambientales están codificadas en el
tiempo relativo con el que se activan diferentes factores de transcripción (Lin
et al., 2015).
gradiente de señalización sea más resistente a las variaciones en la tasa
de producción del ligando y también acelera el acercamiento de los
gradientes a los estados estables. Finalmente, la retroalimentación de
PTCH supera a otros diseños alternativos, como una retroalimentación
negativa intracelular que solo inhibe la señal dentro de las células sin
afectar la distribución del ligando extracelular (diseño recableado). El
desempeño de la retroalimentación PTCH requiere su doble función,

8
REVISIÓN
Estos resultados demuestran directamente que el cableado de una
vía puede determinar la dinámica espacio-temporal y la solidez de los
gradientes de señalización. También plantean nuevas preguntas: ¿cómo
logran otras vías la solidez de los patrones (Eldar y Barkai, 2005; Eldar et
al., 2003, 2004)? O, alternativamente, ¿han evolucionado otras vías para
proporcionar capacidades distintas? El examen de otros sistemas de
patrones espaciales revela un rico conjunto de fenómenos de patrones
y arquitecturas de vías que podrían analizarse de manera similar. Por
ejemplo, el trabajo en embriones ha demostrado que los ligandos de
BMP se pueden "transportar" activamente desde el lugar en el que se
producen para generar patrones de desarrollo específicos (Shilo et al.,
2013). Similarmente, la capacidad de escalar proporcionalmente un
patrón con el tamaño del tejido puede surgir de la represión de un
'expansor' de morfógeno rápidamente difusible o de un mecanismo
distinto (Ben-Zvi et al., 2011; Gregor et al., 2005; Inomata et al., 2013 ),
que ha sido revisado exhaustivamente (Umulis y Othmer, 2013). Será
interesante ver si tales comportamientos multiproteicos complejos
pueden entenderse a través de enfoques de reconstitución similares.
Los enfoques sintéticos para el desarrollo ahora están ganando terreno. Los
circuitos de ingeniería que utilizan componentes de señalización endógenos u
ortogonales han demostrado que los circuitos relativamente simples son
suficientes para producir comportamientos no triviales a nivel de población, como
la formación de anillos concéntricos y patrones periódicos (Matsuda et al., 2015;
Sekine et al., 2018; Toda et al., 2018). Estos sistemas sintéticos pueden generar
patrones en formas más o menos predecibles, y será interesante averiguar hasta
qué punto es necesario o útil importar principios de diseño de sistemas de
patrones naturales para aumentar su precisión al nivel de los sistemas de
desarrollo natural. Juntos, estos sistemas reconstituidos brindan una excelente
oportunidad para estudiar los procesos de desarrollo con una alta resolución
espacio-temporal.
Conclusiones y direcciones futuras
Como se describió anteriormente, los sistemas de señalización del desarrollo no
son transmisores pasivos de información de un ligando extracelular a un efector
intracelular. La información que perciben se representa de diversas maneras,
muchas de las cuales no podrían deducirse únicamente del conocimiento de las
interacciones moleculares. Experimentalmente, descifrar estos códigos requerirá
un control cuantitativo sistemático de las concentraciones de múltiples ligandos en
el espacio y el tiempo y un seguimiento simultáneo de las salidas de las vías en
diversos contextos celulares. También implicará volver a cablear las vías para
comprender cuáles de sus características arquitectónicas son necesarias o
suficientes para el procesamiento de señales. Una fuerte prueba de nuestra
comprensión será la capacidad de usar enfoques de biología sintética para
programar comportamientos de desarrollo multicelulares sintéticos que usan
estas vías.
Alcanzar estos objetivos también requiere que lidiemos con cuestiones
espinosas, como si una sola 'vía' puede aislarse significativamente de
cualquier otra, y cómo el 'contexto celular' afecta la interpretación de las
señales. Sin embargo, es probable que la recompensa de aprender estos
códigos sea inmensa. Las vías de señalización del desarrollo proporcionan
las palancas biológicamente más relevantes y poderosas que tenemos para
controlar las células, lo que explica su papel frecuente como objetivos del
desarrollo de fármacos y su importancia fundamental para la medicina
regenerativa. Comprender cómo estas vías 'esperan' que se codifiquen sus
entradas, ya sea en concentraciones de ligando, dinámica temporal,
combinaciones de múltiples ligandos o de otras maneras, podría permitir un
control más específico del destino celular y otras respuestas, y proporcionar
una visión crucial de la lógica de los diversos procesos de desarrollo que
permiten. Un beneficio adicional de este enfoque podría ser conceptual.
Actualmente, representamos vías predominantemente en términos
moleculares. Pero una comprensión complementaria vendrá de la capacidad
de representarlos como programas que abordan mensajes.
Desarrollo (2019) 146, dev170977. doi:10.1242/dev.170977
1 Dirección 2 Contenido 3 Entrega
X
X
Ernie epitelio
san francisco
Frances Fibroblasto
Los Ancellos
Fig. 7. El procesamiento activo de señales permite especificidad y precisión en la
comunicación celular.Las vías de señalización del desarrollo pueden verse como
programas que controlan el direccionamiento del mensaje ("quién puede hablar con
quién"; 1), el contenido del mensaje ("qué programa objetivo activar"; 2) y la entrega del
mensaje ('cuándo y dónde debe recibirse la información»; 3). Los diversos esquemas de
procesamiento de señales utilizados por diferentes vías no solo transducen señales, sino
que las modulan activamente de manera que permiten la especificidad y la precisión en el
desarrollo multicelular.
a tipos de células específicos, controlar el 'contenido' (programa objetivo) de
un mensaje y especificar la distribución espacial precisa de los mensajes
intercelulares (Fig. 7). Parece que los enfoques descritos anteriormente,
junto con las revoluciones en curso en el análisis de células individuales,
están abriendo nuevas y poderosas oportunidades para comprender y
controlar la comunicación celular en los próximos años.
Agradecimientos
Agradecemos a L. Goentoro, J. Briscoe, A. Kicheva, S. Megason, A. Aulehla y E. Siggia por
su útil debate. También agradecemos a CL Frick, N. Nandagopal, JM Linton,
H. Klumpe, R. Kuintzle, L. Santat, R. Zhu y otros miembros del laboratorio de Elowitz por la
lectura crítica del manuscrito.
Conflicto de intereses
Los autores no declaran intereses competitivos o financieros.
Fondos
Los autores cuentan con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes (MBE) y el Premio
Camino a la Carrera de Independencia del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo
Humano Eunice Kennedy Shriver (R00HD087532 a PL). Depositado en PMC para liberación
después de 12 meses.
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