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ATENCIÓN EN
Tras el desarrollo de la clonación
molecular y la PCR en las décadas de 1970 y
1980, la manipulación genética se generalizó
La fundación del campo de la biología Estrategias. En este artículo de Timeline, nos en la investigación microbiológica,
sintética cerca del cambio de milenio se basó centramos en los esfuerzos en biología ofreciendo ostensiblemente un medio técnico
en la afirmación transformadora de que los sintética que se ocupan de los sistemas para diseñar la regulación genética artificial.
enfoques de ingeniería, entonces en su microbianos; el trabajo en biología sintética Sin embargo, durante este período
mayoría ajenos a la biología celular y de mamíferos ha sido revisado recientemente pregenómico, los enfoques de investigación
molecular, podían usarse tanto para estudiar en otros lugares2,3. que se clasificaron como ingeniería genética
los sistemas celulares como para facilitar su En este artículo de Timeline, se presenta se restringieron principalmente a la
manipulación con fines productivos. Ahora una breve historia de algunos de los clonación y la expresión génica
con más de una década de antigüedad, la principales eventos que han dado forma a la recombinante. En resumen, la ingeniería
biología sintética ha experimentado un biología sintética desde su inicio. genética aún no estaba equipada con los
crecimiento considerable en alcance, Comenzamos describiendo la dinámica conocimientos o herramientas necesarias
expectativa y producción, y se ha convertido interdisciplinaria única de la década de 1990 para crear sistemas biológicos que mostraran
en una rama ampliamente reconocida de la la diversidad y profundidad del
que, a fines de la década, había atraído a
investigación biológica1. En muchos aspectos, el comportamiento regulador que se encuentra
ingenieros de disciplinas fuera de la biología
en los microorganismos.
trajectorio del campo durante su primera a ingresar al laboratorio húmedo y comenzar
década de existencia ha sido no lineal, con A mediados de la década de 1990, la
a jugar con las redes celulares. Dividimos
secuenciación automatizada del ADN y las
períodos de progreso significativo una cronología del campo en tres períodos
herramientas computacionales mejoradas
acompañados de episodios de inercia a distintos y destacamos los hitos científicos y
permitieron secuenciar genomas microbianos
medida que los esfuerzos de diseño se han culturales para cada período (FIG. 1
completos, y las técnicas de alto rendimiento
visto obligados a reorientarse cuando se (TIMELINE)):primero, un período fundacional,
para medir ARN, proteínas, lípidos y
enfrentan a la complejidad e imprevisibilidad en el que se establecieron muchas de las
metabolitos permitieron a los científicos
de la engineering dentro de las células vivas. características experimentales y culturales
generar un vasto catálogo de componentes
Aunque aún no se ha llegado a un de la consagración del campo; segundo, un celulares y sus interacciones. Esta
consenso sobre una definición precisa de período intermedio, que se caracterizó por "ampliación" de la biología molecular generó
biología sintética, el uso de herramientas y una expansión del campo pero un retraso en el campo de la biología de sistemas, ya que los
técnicas de biología molecular para diseñar el los avances de la ingeniería; y tercero, una biólogos y los informáticos comenzaron a
comportamiento celular se ha convertido en era reciente de innovación acelerada y combinar la experimentación y la
una identidad amplia para el campo, y se ha prácticas de shifting, en la que las nuevas computación para aplicar ingeniería inversa a las
desarrollado un conjunto de enfoques de tecnologías y enfoques de ingeniería nos redes celulares7–9. Lo que surgió de este enorme
ingeniería comunes y prácticas de han permitido avanzar hacia aplicaciones y continuo esfuerzo de investigación básica
laboratorio, junto con una cultura prácticas tanto en biotecnología como en fue la visión de que las redes celulares,
comunitaria vibrante. Gran parte del trabajo medicina. aunque vastas e intrincadas, estaban
fundacional en el campo se llevó a cabo en organizadas como una jerarquía de módulos
las especies microbianas modelo 1961-1999: orígenes del campo funcionales claramente discernibles,
Escherichia coli y Saccharomyces Las raíces de la biología sintética se similares a muchos sistemas diseñados10.
cerevisiae, y estos sistemas microbianos remontan a una publicación histórica de Poco a poco, se recognizó que la
Francois Jacob y Jacques Monod en 1961 manipulación racional de los sistemas
siguen siendo centrales en varias áreas
(REF. 4). Las ideas de su estudio del operón biológicos, ya sea ajustando
focales del campo, incluido el diseño de
lac en E. coli los llevaron a postular la sistemáticamente o reorganizando sus
circuitos complejos, la ingeniería constituyentes moleculares modulares,
metabólica, la construcción mínima del existencia de regulaciones
podría formar la base de una disciplina
genoma y la terapéutica basada en células. formal de ingeniería biológica11. Como
circuitos que sustentan la respuesta de una célula a su entorno. Pronto se previó la capacidad complemento del enfoque de arriba hacia
de ensamblar nuevos sistemas reguladores a partir de componentes moleculares5, pero no fue abajo de la biología de sistemas, se previó un
hasta que se descubrieron los detalles moleculares de la regulación transcripcional en enfoque de abajo hacia arriba, que podría
bacterias6 que una visión más concreta, basada en la expresión génica programada, comenzó basarse en una lista cada vez mayor de
a tomar forma. "partes" moleculares para diseñar redes
reguladoras. Tal enfoque podría ser
utilizado tanto para estudiar la organización migrar a la biología molecular para probar de estos circuitos genéticos simples podría
funcional de los sistemas naturales como suerte en el banco. describirse utilizando modelos matemáticos
para crear redes reguladoras artificiales que correspondientemente simples, lo que
tienen potenciales aplicaciones 2000-2003: los años fundacionales Un permite a los ingenieros de circuitos evaluar
biotecnológicas y sanitarias12. A finales de la punto de partida conveniente para los los méritos de un enfoque de diseño basado
década de 1990, un pequeño grupo de primeros biólogos sintéticos fue la creación en modelos. El workhorse de la biología
ingenieros, físicos e informáticos de circuitos reguladores de genes simples molecular, E. coli, fue un banco de pruebas
reconocieron la oportunidad y se atrevieron a que realizan funciones en un manner análogo ideal para este trabajo debido a nuestra
a los circuitos eléctricos13,14. La dinámica profunda comprensión mecanicista de su

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la línea
de tiempo
celular
Auge de la era 'ómica'
y Monod
molecular ADN
de
de
las cajas
azul); ingeniería del genoma completo (púrpura).
ingeniería; MIT Instituto tecnológico de Massachusetts; SB1.0, Biología Sintética 1.0;
biología, su facilidad de manipulación
genética y el número relativamente grande
de sistemas reguladores de genes bien
estudiados que proporcionaron una fuente
inicial conveniente de "partes" del circuito.
En el primer mes del nuevo milenio
(enero de 2000), se publicaron los primeros
informes de circuitos genéticos que habían
sido diseñados para llevar a cabo funciones
diseñadas. En un ejemplo, Collins y sus
colegas construyeron un interruptor de
palanca genética que contiene promotores
que impulsan la expresión de represores
transcripcionales mutuamente inhibitorios15
(FIG. 2a) . Las células que albergaban el
circuito podían alternar entre dos estados de
expresión estables en respuesta a señales
externas. En otra muestra, Elowitz y Leibler
diseñaron un circuito oscilatorio que
consistía en un triple bucle de
retroalimentación negativa de pares represor-
promotor secuenciales16 (FIG. 2b). La
activación del circuito, denominado represor,
dio lugar a la oscilación ordenada y
periódica de la expresión de la proteína
represora.
Tanto el interruptor como el represor se
construyeron a partir de un conjunto similar
de partes (por ejemplo, sistemas promotores
inducibles) y utilizaron la expresión GFP
como una salida para monitorear el
comportamiento del circuito. En cada caso
se utilizó un diseño basado en modelos,
pero el acuerdo entre los El modelo y la
salida experimental se alcanzaron solo
después de "sintonizar" los circuitos
reemplazando iterativamente las piezas para
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la
25
15 16
represor
Autorregulación negativa- transcripcional
de 21 27 29
retroalimentación
generalizado
30
Escherichia Coli
obtener el comportamiento deseado. El flujo
de trabajo de ingeniería que se estableció
por estos estudios, que incorporó el diseño
cuantitativo, físico la construcción, la
medición experimental y la depuración
basada en hipótesis, siguen siendo un rasgo
característico de sintético construcción de
circuitos17–19.
En el período que siguió inmediatamente
a la publicación de los documentos de
alternancia y represor, varios estudiosos
utilizaron la ingeniería de circuitos para
investigar la relación entre el diseño de redes
y el comportamiento cuantitativo20. Entre los
circuitos de este período se encontraban
módulos simples de retroalimentación
negativa y positiva autorreguladores21-23 (FIG. 2c) y un
oscilador génico basado en la relajación que
presentaba una arquitectura de circuito
diferente a la del represor y exhibía un
comportamiento oscilatorio más estable24.
Leibler y sus colegas utilizaron una pequeña
biblioteca de reguladores transcripcionales
para ensamblar combinatoriamente circuitos
genéticos que alteran diversos
comportamientos de puertas lógicas25. El
trabajo seminal de Weiss y sus colegas
estableció métodos para la ingeniería de
puertas lógicas basadas en la transcripción e
hizo mucho para formalizar el lenguaje y la
práctica de la ingeniería de circuitos26. Los
circuitos simples que exploraron la relación
entre la expresión génica y el ruido
molecular en genes procariotas y eucariotas
proporcionaron una visión temprana del
papel que los sistemas sintéticos podrían
www.nature.com/reviews/micro
más temprana
de ARN
35
40
41
Programables
36
de patrones
tener en aclarar y ampliar nuestra
comprensión de la biología básica27–29.
Aunque se centró principalmente en la
ingeniería de circuitos, los esfuerzos durante
este período temprano comenzaron a ir más
allá de las simples redes reguladoras de
genes. Se desarrollaron los primeros
circuitos de comunicación célula-célula30,
prediciendo un movimiento hacia consorcios
microbianos diseñados en los años para
come. Además, los primeros esfuerzos para
recablear la regulación post-traduccional
utilizando dominios de interacción proteína-
proteína y proteínas de andamio se
demostraron en S. cerevisiae31.
2004-2007: expansión y dolores de
crecimiento El tamaño y el alcance del
campo de la biología sintética comenzaron a
aumentar dramáticamente a mediados de la
década de 2000. La primera conferencia
internacional para el campo, Biología
Sintética 1.0 (SB1.0), se celebró en el verano
de 2004 en el Instituto de Tecnología de
Massachusetts (MIT), Estados Unidos.
Reuniendo a investigadores de biología,
química, física, ingeniería e informática, la
reunión fue ampliamente elogiada por su
impacto positivo en el campo naciente,
ayudando a crear una comunidad
identificable y galvanizar los esfuerzos hacia
el diseño, la construcción y la
caracterización de sistemas biológicos, con
el objetivo a largo plazo de la ingeniería del
genoma completo32,33 . A medida que la
comunidad altamente interdisciplinaria
comenzó a fusionarse, las ideas de la

ARN
66
45 56
90
ácido
80
ingeniería contemporánea se infundieron
ampliamente en la investigación de biología
molecular por primera vez, lo que planteó
preguntas sobre la compatibilidad de los dos
campos. ¿Podría la biología sintética
evolucionar hacia una disciplina de
ingeniería sofisticada a la par con la
ingeniería eléctrica o mecánica? ¿Podrían las
prácticas como la estandarización de piezas y
conceptos como las jerarquías de abstracción ser
mapeados en sistemas biológicos? Por
primera vez, los grupos comenzaron a hacer
intentos explícitos de mejorar la ingeniería
de los sistemas genéticos mediante la
creación de colecciones de piezas modulares
y el desarrollo de métodos para construir y
ajustar diseños de circuitos particulares34.
Avances notables. Durante este período
continuaron surgiendo hitos importantes en
el diseño de piezas y circuitos en E. coli,
incluidos los sistemas basados en ARN que
expandieron el diseño de circuitos sintéticos
desde el control transcripcional
principalmente a los mecanismos de control
post-transcripcional y traslacional35,36
(FIG. 3a) . Nuevas piezas y diseños de
circuitos continuaron apareciendo, como
una puerta lógica AND basada en la
transcripción de un gen para el cual la
traducción depende de la co-transcripción
de un ARNt diseñado37
(FIG. 3b) . Los circuitos de detección de
quórum se diseñaron para permitir el
patterning multicelular38,39, y se desarrolló un
circuito sensorial para convertir la luz en
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95
96
sincronizado
18
acoplado a la población
olas
49
98
de conteo
64
detector
expresión génica en un campo de células40 (FIG.
3c).
Quizás el éxito científico de más alto
perfil durante este período ocurrió en la
ingeniería metabólica, en la que los
principios de ingeniería avanzada de la
biología sintética convergieron con décadas
de investigación básica sobre la biosíntesis
de isoprenoides para encapaz de la
producción heteróloga de precursores de la
artemisinina, un medicamento antipalúdico
ampliamente utilizado que es producido
naturalmente por la planta de ajenjo dulce
Artemisia annua41,42. Junto con un trabajo
prometedor en el diseño racional de
policétidos complejos y péptidos no
ribosómicos43,44, estos esfuerzos condujeron a
una mayor apreciación del alcance de las
posibles aplicaciones comerciales para la
biología sintética. Un circuito sintético que
proLa invasión bacteriana motes de células
tumorales fue un ejemplo temprano de una
estrategia terapéutica basada en células para
mejorar la salud humana45.
Obstáculos formidables. A medida que los
investigadores intentaron incorporar nuevas
piezas y construir circuitos de mayor
complejidad, pronto quedó claro que varios
cuellos de botella importantes estaban
frenando el campo. En primer lugar, no se
habían desarrollado métodos eficientes para
ensamblar partes genéticas individuales en
circuitos complejos, lo que resultó en el
tedioso ensamblaje ad hoc de la mayoría de
los nuevos diseños de circuitos. En segundo
lugar, la falta de métodos establecidos para
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63
múltiple
metabólico 87
de biodiesel
62
colar 88
97
caracterizar la funcionalidad de las partes
genéticas dio lugar a una cantidad
desproporcionada de tiempo y esfuerzo
invertidos en ajustar y rediseñar los circuitos
construidos para permitirles funcionar
correctamente. Por último, debido a la
Ad hoc nature de este proceso de
optimización, los circuitos funcionales a
menudo contenían partes que permanecían
sin caracterizar, lo que resultaba en una
laboriosa recaracterización cuando las piezas
se introducían en nuevos circuitos46.
Un esfuerzo temprano en el campo para
abordar los problemas de almacenamiento y
ensamblaje fue el Registro de Partes
Biológicas Estándar (RSBP; ver más
información), un repositorio público que se
desarrolló para catalogar digitalmente y
almacenar físicamente partes genéticas en un
formato estandarizado 'BioBrick' que facilita
el ensamblaje gradual y metódico de las
piezas en circuitos más grandes47. Aunque el
desarrollo posterior de métodos de
ensamblaje de un solo paso, como Golden
Gate48
y Gibson Assembly49, ha restringido
principalmente el uso de
El ensamblaje de BioBrick a iGEM
(International Genetically Engineered
Machine, que es una competencia de
biología sintética de pregrado; ver más
información), RSBP y otros registros de
partes han demostrado ser bases de datos de
secuencias importantes para la comunidad en
general. La traducción de estos registros al
lenguaje computacional Synthetic Biology
Open Language (SBOL; ver más
información) ha dado a las herramientas de
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software un formato estándar para describir
piezas sintéticas y diseños de circuitos y
facilitar su intercambio50. OpenWetWare (ver
más información), que es un wiki público
desarrollado originalmente en el MIT,
EE.UU., se ha convertido en un recurso
valioso para la comunidad de biología
sintética, sirviendo como un foro para
compartir protocolos y alojar sitios web
laboratorios.
La caracterización de las piezas demostró
ser un obstáculo más confuso. En muchos
casos,

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incluso las partes relativamente bien Como res
caracterizadas no funcionaron de manera continuar
predecible cuando se sacaron del contexto relativam
genético o ambiental específico en el que se A med
caracterizaron originalmente, y con frecuencia biologia s
no funcionaron correctamente cuando se amplio re
colocaron en circuitos con otras partes51. La científica
dificultad de agregar estos problemas de expansión
interoperabilidad de piezas y dependencia del importan
contexto contribuyó a un estancamiento campo de
relativo en el desarrollo de circuitos público e
complejos. financiac
ejemplo,
Science Foundation, que proporcionó fondos
para SynBERC (Synthetic Biology
Engineering Research Project; ver más
información), un consorcio de laboratorios
de biología sintética de varias instituciones
académicas líderes en los Estados Unidos. El
campo también se volvió cada vez más
internacional durante estos años, ya que
conferencias, como SB3.0 en Zurich, Suiza,
y SB4.0 en Hong Kong, China, ayudaron a
globalizar la comunidad de biología
sintética.

2008-2013: aumento en el ritmo y la escala

En contraste con el lento progreso que
caracterizó a la ingeniería de circuitos
durante el período de tiempo anterior, el
campo ha experimentado una maduración
dramática tanto en el ritmo como en la
calidad de la producción en los últimos años.
A partir de 2008, comenzaron a aparecer
Figura 2 | Ejemplos de circuitos genéticos reportados durante los años fundacionales de la informes publicados que describían circuitos
biología sintética (2000-2003 |). El interruptor de palanca. Un par de genes represores (lacI y cI) que exhibían un mayor grado de
están dispuestos para reprimir antagónicamente la transcripción entre sí, lo que resulta en un circuito complejidad, que se construían utilizando
genético biestable en el que solo uno de los dos genes está activo en un momento dado. El interruptor una gama más amplia de partes mejor
se puede "voltear" al estado transcripcional deseado utilizando entradas ambientales para
caracterizadas y que exhibían
desconectar uno de los represores de su operador (por ejemplo, IPTG (isopropil-β-d-tiogalactósido)
se utiliza para desenganchar LacI y el calor se utiliza para desenganchar cI). Una vez que se elimina comportamientos más precisos y variados.
la entrada, el estado transcripcional deseado persiste durante varias generaciones. b | El represor. El Aunque la dependencia del contexto y la
circuito se construye a partir de tres interacciones represor-promotor (entre los represores cI, LacI interoperabilidad de las piezas continuaron
y TetR y sus promotores asociados), que se unen entre sí para formar una red en forma de anillo, en imponiendo un lastre general a la ingeniería
la que TetR regula un nodo reportero GFP. Cuando se analiza a nivel de una sola célula utilizando de circuitos, varias mejoras en las prácticas
la microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo, el circuito exhibe oscilaciones periódicas en la de ingeniería en todo el campo funcionaron
expresión de GFP, que persisten durante varias generaciones; sin embargo, las oscilaciones se como un contrapeso para aumentar la
amortiguan después de unos pocos períodos y generalmente son ruidosas, con células individuales productividad. De hecho, muchos de los
que muestran una alta variabilidad tanto en la amplitud como en el período de sus oscilaciones. c | grupos de investigación que ingresaron al
Circuito autorregulador. En este circuito, la regulación de retroalimentación negativa mediada por
campo en la primera parte de la década
TetR de su propia transcripción da como resultado una distribución de expresión estrecha en toda
la población, medida por el reportero GFP co-transcrito. El circuito demuestra un principio que fue comenzaron a agudizar su oficio a mediados
apreciado durante mucho tiempo en la ingeniería de sistemas de control y la dinámica no lineal: que de la década de 2000, haciendo uso de una
el ruido en un sistema se puede reducir mediante la introducción de retroalimentación negativa. mejor comprensión técnica, enfoques de
diseño y métodos de construcción. Los
métodos de ensamblaje de ADN de alto
rendimiento, junto con la disminución
constante de los costos de síntesis de genes,
aceleraron aún más la fase de construcción
de la ingeniería de circuitos48,49,55.
Un circuito que mostró un
comportamiento oscilatorio robusto y
persistente fue desarrollado por Hasty y sus
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colegas en 2008, y fue una actualización impresionante de una serie de estudios Figura 3 | Ejemplos de circuitos genéticos
experimentales y teóricos sobre el diseño de circuitos oscilatorios56 (FIG. 4a). Los autores reportados durante los años intermedios de la
combinaron el modelado cuantitativo con un diseño de circuito robusto y caracterizaron el biología sintética (2004-2007 |).
rendimiento del circuito utilizando una plataforma de microfluídica. En trabajos posteriores, Riborregulador modular. Se agrega una
secuencia cis-represión al UTR de 5′ de una
se combinó una arquitectura de circuito similar con la detección de quórum para permitir la
transcripción genética para inhibir la traducción
sincronización de las oscilaciones de circuito en toda la población57. La incorporación de un bloqueando la site de unión al ribosoma (RBS).
sistema de señalización redox en fase gaseosa permitió extender el comportamiento La inhibición de la traducción se invierte
oscilatorio a escalas de centímetro de longitud58. mediante la expresión de una secuencia
Un par de circuitos genéticos sintéticos que cuentan eventos, un objetivo declarado desde transactivante inducible que se une
hace mucho tiempo para los ingenieros de circuitos, se informó en 2009 (REF. 59). Para uno estrechamente a la secuencia cis-represión,
de estos contracircuitos, se utilizó el reordenamiento del ADN mediado por la recombinasa exponiendo así el RBS para permitir la
para crear memoria permanente de un traducción de GFP. b | Puerta de dos entradas

b Puerta de dos entradas Y

DiseñoConducto

GFP

multicelulares

Circuito emisor Circuito receptor

Formación de patrones 2D inducidos en el "césped" de las células
Y. Uno de los primeros exámenes de la
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programación exitosa de operaciones lógicas en una celda fue un circuito AND-gate en el que la de paso de banda de AHL, y la expresión génica
exposición simultánea de las células a dos entradas externas se convirtió en una salida del reportero fluorescente se activa solo a
transcripcional. En respuesta a la arabinosa, la inducción mediada por AraC de un promotor da como concentraciones discretas de AHL. El ajuste de
resultado la transcripción de una polimerasa T7 que está diseñada para contener dos codones de la sensibilidad de la activación de LuxR da como
parada TAG (ámbar) en su secuencia codificante. El segundo promotor, que es activado por NahR resultado cepas que tienen capacidades de
en presencia de salicilato, controla la transcripción de SupD, que es un ARNt supresor ámbar que detección de AHL de alta sensibilidad (HS) o
reconoce el codón de parada TAG y agrega un residuo de serina al polipéptido naciente, lo que baja sensibilidad (LS). Las cepas receptoras HS
permite la traducción de lectura de la polimerasa T7. y LS se programan con proteína fluorescente
La transcripción y traducción de T7 puede ocurrir solo en presencia de ambas entradas roja (RFP) y salida GFP, respectivamente, y se
environmentales, lo que conduce a la expresión de GFP del promotor dependiente de T7. c | mezclan en un césped bacteriano en el que las
Formación de patrones multicelulares. El circuito, que fue diseñado para producir un patrón células emisoras se colocan en el medio. Esto
ordenado en un campo bidimensional de células bacterianas, consiste en partes genéticas derivadas resulta en la aparición de un patrón de bandas y
de Vibrio fischeri: LuxI, que es una enzima que produce la molécula de detección de quórum acil ojo de buey de expresión fluorescente-reportera.
homoserina lactona (AHL), se expresa en células "emisoras", mientras que las células "receptoras"
expresan LuxR, que es un activador transcripcional sensible a AHL. Al acoplar la función LuxR a
una arquitectura de circuito de alimentación, las células receptoras se programan para la detección
más tarde se utilizó una estrategia similar    se puede utilizar para regular la transcripción
Para una disciplina de ingeniería, la adopción de un conjunto
para diseñar un conjunto completo de ampliamente utilizado de bloques de construcción que tienen
del gen u operón objetivo.
puertas lógicas basadas en recombinasa60,61 propiedades y modos de conectividad bien definidos. Los sistemas de control post-traduccional
(FIG. 4b).. Se logró una ingeniería integral de comenzaron a aparecer durante este período.
lógica transcripcional robusta en E. coli,   Se utilizaron andamios de proteínas
Examinar los componentes constituyentes de un sistema para
incluyendo las 16 puertas lógicas sintéticas para introducir nuevas conexiones
comprender su función integrada. En biología de sistemas, esto
elementales62, así como la ingeniería de una puede implicar hacer perturbaciones a una red celular y luego de retroalimentación de circuitos con el fin
red lógica de entrada múltiple utilizando una construir un modelo que describa la relación entre el de alterar de manera predecible el
cascada transcripcional de múltiples niveles63. comportamiento de los componentes moleculares y el de todo el comportamiento dinámico de una vía
sistema.
Otro logro notable de este período fue el quinasa de proteína activada por mitógenos
trabajo que amplió la capacidad de los   
de levadura nativa (MAP)73. En estudios
circuitos bacterianos de detección de luz Un enfoque interdisciplinario que intenta desarrollar y probar separados en E. coli, se utilizaron andamios
para programar un circuito genético de modelos holísticos de sistemas vivos. Un enfoque de sistemas "de sintéticos para desviar la señalización de dos
arriba hacia abajo" utiliza modelos cuantitativos para identificar y
detección de bordes64 (FIG. 4c) y circuitos que componentes74
y, en otro estudio, para coubilizar
describir las redes biosintéticas y reguladoras subyacentes de un
utilizaron la motilidad flagelar dependiente sistema, mientras que un enfoque complementario de "abajo las enzimas de la vía biosintética del
de la detección de quórum para permitir la hacia arriba" intenta modelar los fenotipos de todo el sistema que mevalonato, mejorando el rendimiento del
formación de patrones en toda la población surgen de las interacciones de los componentes. ácido glucárico y reduciendo la toxicidad de
en E. coli65. los metabolitos intermedios75. Chau y sus
La ingeniería de circuitos basada en ARN ya que las funciones de biodetección dieron colegas utilizaron circuitos de señalización
también experimentó una expansión durante paso a la computación RNBased. Se de proteínas para producir polarización
este período, construyeron dispositivos de ARN para espacial en levaduras mediante la ingeniería
contrastar la lógica reguladora de la de circuitos a partir de componentes que se
expresión génica66, y se desarrollaron autoorganizan en distribuciones
Glosario herramientas de diseño de ARN para localizadas76. Este estudio fue un paso
  permitir el control preciso y predecible de crucial hacia el control sistemático de
Esquemas organizativos que simplifican el proceso de ingeniería objetivos genéticos heterólogos y fenotipos complejos como la forma y el
describiendo bloques de construcción de acuerdo con propiedades endógenos67,68. El sistema de inmunidad
modulares, permitiendo así la construcción de sistemas cada vez movimiento celular. A corto plazo, tales
más complejos. En biología sintética, los elementos moleculares
CRISPR-Cas (repeticiones palindrómicas circuitos podrían usarse para colocalizar o
que se clasifican como "partes" (que es el nivel más bajo de la cortas agrupadas, regularmente secuestrar componentes de una vía
jerarquía) se pueden usar para construir dispositivos (que son interespaciadas-proteínas asociadas a biosintética. Los diseños de circuitos post-
partes ensambladas juntas para producir una función deseada),
CRISPR) en bacterias y arqueas también se traduccionales permanecen en la etapa de
que pueden, a su vez, combinarse aún más en sistemas.
reutilizó para permitir el control prueba de concepto, y existe la necesidad de
     transcripcional de todo el genoma. Los plataformas robustas para permitir el control
Un enfoque matemático para simular el metabolismo en estado sistemas CRISPR-Cas de tipo II utilizan la post-traduccional de los objetivos de
estacionario en un sistema vivo. unión al ADN dirigido por ARN por la proteínas.
nucleasa Cas9 para detectar y escindir Durante este tiempo, los biólogos
  
Pasar de una descripción abstracta de una función deseada a la bacteriófagos invasores y adn transferido sintéticos comenzaron a utilizar técnicas
implementación física que produce esa función. En el contexto de horizontalmente69, y grupos independientes de ingeniería de redes para abordar
la biología sintética, es la construcción de sistemas genéticos la desarrollaron mutantes de nucleasa Cas9 que preguntas fundamentales sobre la forma,
que produce un comportamiento deseado.
permiten la unión al ADN dirigido por ARN función y plasticidad evolutiva de las
 
por Cas9 sin escisión posterior del ADN70–72. redes naturales. Varios estudios utilizaron
Un dispositivo o sistema que lleva a cabo una operación lógica La especificidad de unión al ADN de Cas9 perturbaciones celulares específicas y
booleana mediante el cálculo de un conjunto de entradas digitales está definida por una secuencia dirigida al controladas sintéticamente para separar los
para generar una salida digital; por ejemplo, un circuito genético
ARN, lo que permite que Cas9 se dirija a principios de diseño de las redes
que activa la expresión génica solo en presencia de un conjunto
específico de señales ambientales constituiría una puerta 'AND'. casi cualquier secuencia genómica o reguladoras naturales. En un estudio
episomal. Al fusionar un activador o notable, el circuito nativo de Bacillus
represor de transcripción a Cas9, el sistema subtilis que regula la competencia se
comparó con una versión cableada
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sintéticamente77. Aunque la dinámica de
los dos circuitos era similar, las diferencias
en las fluctuaciones estocásticas entre las
dos arquitecturas dieron lugar a diferentes
patrones de diferenciación en el estado de
competencia. En otro estudio, el
recableado sintético sistemático de la red
reguladora transcripcional de E. coli
mostró que la introducción de nuevas
conexiones de red tenía costos de aptitud
mínimos y, en algunos casos, podría
proporcionar un beneficio de aptitud física78.
Aplicaciones. La ingeniería metabólica
también avanzó rápidamente durante este
período, a medida que los avances de los
sistemas y la biología sintética se
incorporaron a las prácticas establecidas79.
Aprovechando el aumento dramático en los
datos de secuencia del genoma y la
reducción en los costos de síntesis de ADN,
los grupos desarrollaron modelos de
predicción de vías sintéticas para identificar
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rutas metabólicas favorables basadas no solo
en el sistema metabólico del huésped, sino
también en todas las funciones enzimáticas
conocidas y predichas. Los ingenieros de
circuitos podrían entonces diseñar la vía
modelada utilizando enzimas heterólogas
identificadas por la minería del genoma para
llenar los vacíos en el sistema metabólico del
huésped. Los éxitos recientes de alto perfil
que utilizan este enfoque en E. coli incluyen
el desvío de la vía de biosíntesis de
aminoácidos para producir isobutanol80,81,
biodiesel a base de ácidos grasos82 y gasolina83, así
como el bioplástico 1,4-butanodiol84.
Los grupos también comenzaron a
incorporar la regulación sintética en las
cepas de producción, lo que permitió el
control dinámico de las vías metabólicas en
respuesta a intermediarios metabólicos clave
o condiciones ambientales85. Los ejemplos
incluyen el uso de un interruptor de palanca
sintético y un sistema de detección de
quórum para coordinar la expansión de la
biomasa y la producción de etanol86 y la
creación de un circuito sensorial de ácidos
grasos para regular la biosíntesis
convergente de etanol y las vías de
condensación, lo que resulta en una
producción de biodiesel de alto rendimiento
sin la acumulación de exceso de etanol87.
En un hito práctico importante para la
biología sintética, la producción a gran
escala del medicamento antipalúdico
artemisinina se logró a principios de 2013.
Con fondos de la Fundación Bill y Melinda
Gates a través de OneWorld Health y PATH
(Programa para
Tecnología apropiada en salud), Amyris Inc.
diseñó una vía optimizada de ácido
artemisínico en levadura88 y la licenció a Sanofi
sin roya. A su vez, Sanofi acordó producir y
suministrar el medicamento.
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Figura 4 | Ejemplos de circuitos genéticos reportados durante la era (Rec1 y Rec2), que causan inversión unidireccional de sus secuencias
más reciente de la biología sintética (2008-2013 |). Oscilador de objetivo. Dependiendo del orden y la orientación de las partes genéticas
relajación. El circuito utiliza piezas bien caracterizadas (específicamente, en el circuito no inducido, las entradas de moléculas pequeñas producen
AraC y LacI) que se han utilizado en circuitos anteriores, pero su diseño una señal de salida GFP, según lo especificado por la puerta lógica
es fundamentalmente diferente del diseño de anillo del represor (FIG. 2b) y correspondiente. Por ejemplo, el circuito AND-gate solo produce una
se basa en cambio en bucles de retroalimentación positiva y negativa señal de salida GFP cuando ambas entradas están presentes, lo que hace
superpuestos, en los que AraC y LacI median la regulación positiva y que el promotor constitutivo y el gen GFP se inviertan de forma
negativa, respectivamente. Los componentes del circuito se ensamblaron independiente de modo que estén en la orientación adecuada para permitir
sobre la base de un modelado cuidadosamente parametrizado, y el circuito la expresión constitutiva de GFP. c | Circuito de detección de bordes. Se
se analizó en un dispositivo microfluídico para garantizar un combinó un sistema de detección de quórum con un sensor de luz híbrido
microambiente controlado con precisión. Estos avances clave dieron como de dos componentes para calcular el borde de un área iluminada. En el
resultado un comportamiento oscilatorio robusto, estable y casi circuito, las bacterias unilumminadas funcionan como células mensajeras
poblacional durante varias generaciones. b | Lógica basada en la que producen y secretan la molécula de detección de quórum AHL,
recombinasa. Estos circuitos aprovechan la inversión de ADN mientras que las bacterias iluminadas funcionan como células receptoras
recombinasa y la direccionalidad fundamental de muchas partes que no pueden producir AHL pero pueden responder a ella expresando la
biológicas para generar un comportamiento de puerta lógica en los enzima LacZ para producir un pigmento negro visible. Las celdas
circuitos genéticos. Usando una pequeña biblioteca de partes bien receptoras iluminadas solo pueden detectar el AHL que producen las
caracterizadas, se podrían construir las 16 puertas lógicas posibles. Los celdas emisoras oscuras en regiones en las que los dos tipos de células
módulos de entrada para el sistema permanecen constantes, con pequeñas están muy cerca, en el borde de un área iluminada, generando así un
moléculas utilizadas para la inducción de las recombinasas ortogonales contorno visible de la imagen.
a costa para los pacientes con malaria en el contenían solo el genoma sintetizado. esencialmente como un oficio "artesanal",
mundo en desarrollo, proporcionando un Boeke y sus colegas utilizaron un enfoque incapaz de lograr la previsibilidad y la rápida
medicamento de bajo costo que podría salvar similar de síntesis del genoma en la iteración del diseño que es característica de
muchos miles de vidas en los próximos años. levadura y, en el proceso de síntesis otras disciplinas de ingeniería. Aunque hubo
Los sistemas adicionales basados en química de dos brazos cromosómicos de S. algunos esfuerzos exitosos en el modelado
aplicaciones continuaron madurando cerevisiae, eliminaron todos los biofísico detallado, en particular, una
durante este período89, incluidas las terapias transposones identificados y otros calculadora de fuerza del sitio de unión al
basadas en fagos diseñados90–92 y el desarrollo elementos inestables e incluyeron sitios de ribosoma (RBS) ampliamente utilizada que
de estrategias terapéuticas basadas en recombinasa que flanquean cada gen97. puede predecir las tasas de traducción
células, como el probiótico E. coli relativas de los genes objetivo102, también ha
diseñado para identificar y matar Edición del genoma. Para permitir una habido una aceptación gradual de la
Pseudomonas aeruginosa93 o bloquear la manipulación genómica eficiente, Church y variabilidad que es inherente en la ingeniería
virulencia de Vibrio cholerae mediante la sus colegas desarrollaron una plataforma en un entorno intracelular complejo.
expresión de una señal heteróloga de llamada multiplex automated genome A medida que los grupos buscaban
detección de quórum 94. Las discusiones en engineering (MAGE), que se ha utilizado controlar o eludir esta variabilidad biológica,
curso sobre los riesgos para la salud y la para alterar rápidamente múltiples loci en el un enfoque general ha sido generar grandes
seguridad de la biología sintética, que se genoma de E. coli98, incluido el reemplazo de bibliotecas de piezas y llevar a cabo
resumen en el informe de la Comisión prueba de principio de todos los codones de mediciones detalladas para cuantificar el
Presidencial de Bioética de 2010 sobre parada TAG con el codón sinónimo TAA comportamiento de las piezas. Los circuitos
biología sintética (ver información codon99 . El sistema bacteriano CRISPR- complejos podrían ensamblarse
adicional), condujeron al desarrollo de Cas también se ha reutilizado en bacterias y combinatoriamente a partir de conjuntos
prototipos de tecnologías de salvaguardia, levaduras como una herramienta de edición seleccionados de piezas y luego filtrarse en
como un interruptor de muerte microbiana del genoma, en la que la escisión del ADN paralelo. Aquellos que tienen un
programable para evitar la liberación de dirigida por ARN se utiliza para seleccionar comportamiento deseado pueden ser elegidos
microorganismos sintéticos en el medio células que utilizan la recombinación para su aplicación o mejora adicional103.
ambiente95
. homóloga para reemplazar la secuencia del BIOFAB (International Open Facility
genoma objetivo con una secuencia de ADN Advancing Biotechnology; ver más
Ingeniería del genoma completo. Durante co-transformada100,101. La notable información), que es una instalación de
este período, se dieron varios pasos eficiencia del sistema y su capacidad para diseño y construcción biológica, ha liderado
importantes hacia el objetivo del control generar mutaciones genómicas no marcadas un esfuerzo para construir y caracterizar
integral de la función celular, como se tiene el potencial de transformar la genética extensas bibliotecas de promotores
previó en la conferencia SB1.0. Venter y bacteriana y de levadura en los próximos bacterianos, secuencias RBS y terminadores
de transcripción104,105
sus colegas utilizaron técnicas innovadoras años. . Al medir el comportamiento
de ensamblaje de ADN para crear una de cada pieza en una amplia gama de
célula bacteriana viable que fue controlada Desafíos persistentes. A pesar del progreso contextos genéticos, BIOFAB desarrolló una
por un genoma químicamente sintetizado49,96. acelerado de este período reciente, la "puntuación de fiabilidad" de piezas que
Los casetes de ADN sintetizados se variabilidad contextual del rendimiento de podría ayudar a identificar posibles defectos
ensamblaron mediante recombinación in las piezas y el circuito siguió siendo durante las fases de diseño y depuración
vivo en levadura para recrear el genoma de obstáculos sustanciales para la construcción post hoc de la ingeniería de circuitos106.
Mycoplasma mycoides, que luego se eficiente de circuitos impulsados por Como alternativo a este extenso enfoque
trasplantó a una célula bacteriana receptora, modelos. El diseño de circuitos de caracterización, otros grupos han
lo que resultó en bacterias viables que biomoleculares se ha mantenido desarrollado métodos para centrarse en la

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reducción de la complejidad genética, que es
una fuente importante de variabilidad en las
células. Una estrategia ha sido recodificar
completamente los genes objetivo y los
operones enteros para volver a ensamblar
cualquier elemento regulador no descubierto,
como la estructura secundaria del ARNm y
los ARN pequeños. Este método de
'refactorización' se utilizó para recodificar
bacteriófagos
T7 (REF. 107) y reconstituir el
Sistema de fijación de Klebsiella oxytoca
N2 en E. coli, en el que se utilizó un sistema
regulador sintético para controlar el grupo
de genes refactorizados108. En una
estrategia relacionada para eliminar la
complejidad de los circuitos sintéticos, se
han desarrollado métodos basados en
CRISPR y ribozima para escindir el ARNm
de los circuits transcritos en los sitios
objetivo que flanquean cada gen,
eliminando así el gen de los efectos del 5ʹ
UTR y cualquier gen co-transcrito109,110.
Este sistema de "aislamiento" debería
permitir a los modelos simples predecir con
precisión el comportamiento del circuito,
acortando y eliminando potencialmente el
largo proceso de depuración iterativo que
continúa atormentando el campo.
Perspectivas para el futuro Desde su
creación hace más de una década, el campo
de la biología sintética ha crecido
considerablemente y ha registrado muchos
logros notables (FIG. 1). El ritmo del progreso
en biología sintética continuará acelerándose
a medida que los ciclos de diseño y prueba
dependan menos de las herramientas
tradicionales de clonación molecular que
sostuvieron el campo en sus primeros años y
cada vez más de la síntesis de ADN y los
métodos de ensamblaje de alto rendimiento.
En un futuro próximo, el flujo de trabajo
para un ingeniero de circuitos biológicos ya
no estará limitado por el ritmo de
fabricación, sino por su capacidad para
analizar el comportamiento del circuito e
incorporar los datos en el próximo ciclo de
diseño. A medida que las emisiones de
caracterización de piezas e interoperabilidad
continúen confundiendo la ingeniería de
circuitos, será importante aumentar el
alcance y la diversidad de los diseños que se
prueban en cada iteración. También será
necesario desarrollar nuevas tecnologías y
enfoques experimentales que permitan la
detección de rapid o la selección de las
funciones de circuito deseadas. En general,
la biología sintética se basará menos en
analogías con la teoría y la práctica de otras
disciplinas de ingeniería, y en su lugar
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continuará construyendo su propia identidad
y cultura.
En el desarrollo de métodos sintéticos de
diseño y control, el campo ha trabajado
esencialmente a través del dogma central de
la biología molecular, confinado en los
primeros años a los circuitos reguladores
basados en la transcripción antes de
desarrollar sistemas de control post-
transcripcionales y traslacionales basados en
ARN. Sin embargo, los métodos para la
regulación post-traduccional aún están en su
infancia, ya que aún no se ha reportado un
sistema generalizado para controlar las
proteínas sintéticas y endógenas.
A medida que los sistemas sintéticos se
han vuelto más grandes y complejos, sus
interacciones con los sistemas endógenos se
han vuelto más pronunciadas111. Los ingenieros de
circuitos biológicos tendrán que desarrollar
métodos para dar cuenta de las cargas
fisiológicas dispares y a menudo pesadas que
los sistemas sintéticos imponen a sus
huéspedes microbianos, tal vez tomando
prestadas lecciones de la ingeniería
metabólica, en la que se ha utilizado el
análisis de equilibrio de flujo para superar
obstáculos similares112.
El diseño de circuitos sintéticos pondrá (y
debería) cada vez más énfasis en la
capacidad de usar circuitos para aplicaciones
prácticas. En el contexto de la ingeniería
metabólica, la capacidad de los circuitos
diseñados para interactuar con los sistemas
celulares para controlar dinámicamente el
flujo metabólico es un desafío a corto plazo113.
El desarrollo de estrategias therapéuticas
basadas en células en las que los
microorganismos diseñados interactúan con
la microbiota intestinal humana para
combatir infecciones y enfermedades
crónicas es otro desafío114,115.
La visión a largo plazo de la ingeniería
racional del genoma completo sigue estando
a muchos años de distancia, pero la
ingeniería a escala de todo el genoma
mediante el recableado de redes celulares en
múltiples loci se convertirá cada vez más en
un punto focal del campo. Las nuevas
tecnologías, como crispr – Cas-mediated
genome editing, permitirán a los biólogos
sintéticos adoptar un enfoque de
motorización más holístico, modificando los
circuitos sintéticos y el genoma del huésped
con relativa facilidad116. Las barreras técnicas y
de costos para sintetizar genomas completos
disminuirán en el futuro cercano, pero el
campo todavía está muy atrasado en el
conocimiento biológico y los conocimientos
mecanicistas que se necesitan para construir
arquitecturas reguladoras completamente
nuevas para la creación de un nuevo
organismo sintético.
A pesar de la proliferación de métodos de
diseño y construcción de circuitos, todavía
hay muy poco intercambio de construcciones
de circuitos entre grupos, ya que la mayoría
de las redes sintéticas se desarrollan y luego
nunca se utilizan fuera del laboratorio
doméstico. Hasta cierto punto, esto se
espera, ya que muchos de estos circuitos son
diseños de prueba de principio, pero a
medida que el campo se mueve cada vez más
hacia diseños más complejos y basados en
aplicaciones, será necesario que ocurra un
cambio cultural importante, ya que los
grupos deberán basarse en el trabajo de
otros. Por lo tanto, el fomento continuo de
una comunidad inclusiva y colaborativa será
esencial.
D. Ewen Cameron, Caleb J. Bashor y James J. Collins
están en el Instituto Médico Howard Hughes, el Centro de
Biología Sintética y el Departamento de
Ingeniería Biomédica, Universidad de Boston, Boston,
Massachusetts, EE.UU., y el Instituto Wyss para
Engineering de inspiración biológica, Universidad de
Harvard, Boston, Massachusetts, EE. UU. D.E.C. y C.J.B.
contribuyeron igualmente a este trabajo.
Correspondencia a J.J.C.
e-mail: jcollins@bu.edu
doi:10.1038/nrmicro3239
Publicado en línea el 1 de abril
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Los autores agradecen a T. Lu y J. Dueber para discusiones útiles
durante la preparación de este artículo de Perspectiva. Este
trabajo es apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes.
Declaración de intereses contrapuestos
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
 ©
Informe de la Comisión Presidencial de Bioética 2010
sobre biología sintética: http://bioethics.gov/synthetic-
biology-report la Fundación biobricks: http://biobricks.org
biOFAb: http://biofab.synberc.org igeM: http://igem.org
Nature Reviews Microbiology Focus on Synthetic biology:
http://www.nature.com/nrmicro/focus/synbio
OpenWetWare: http://openwetware.org
Registro de Partes Biologicas Estándar:
http://parts.igem.org SynbeRC: http://synberc.org Biología
Sintética Estándar de lenguaje abierto:
http://www.sbolstandard.org
TODOS LOS ENLACES ESTÁN ACTIVOS EN EL PDF EN
LÍNEA
www.nature.com/reviews/micro