Tema 3 – Bacteriología: técnicas de cultivo, aislamiento y recuento

1. Los medios de cultivo

> Un medio de cultivo → es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos.
> Las bacterias de interés medico son organismos → quimioorganoheterótrofos, es decir:
 Obtienen la energía necesaria para su metabolismo a partir de diferentes compuestos mediante reacciones
químicas → quimiótrofos.
 Utilizan compuestos orgánicos como fuente reductora, es decir, como donantes de los electrones que
necesitan para los procesos de biosíntesis → organótrofos.
 Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono → heterótrofos.

1.1. Composición de los medios de cultivo

> Todos los medios deben contener fuentes de:

× Carbono → para la síntesis de todos los compuestos orgánicos de la bacteria, sirve también como fuente
de energía.
× Nitrógeno → para la síntesis de aminoácidos y bases nitrogenadas.
× Azufre → para la síntesis de aminoácidos azufrados, como la cisteína y la metionina.
× Fósforo → para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos.
> Además, se complementan con sales minerales para mantener el balance osmótico y factores de crecimiento,
genéricos o específicos, necesarios para el crecimiento de las bacterias.

1.2. Clasificación de los medios de cultivo

a) Tipos de medios de cultivo atendiendo a su estado físico

> Medios sólidos → medios que contienen un agente solidificante (agar) en proporción de 12-15g/l.
> Medios semisólidos → medios que contienen un agente solidificante (agar) en proporción de 2-4g/l.
> Medios líquidos → medios que no contienen ningún agente solidificante.
b) Tipos de medios de cultivo atendiendo a su composición
> Medios químicamente definidos → se conoce con exactitud su composición y la concentración de cada
uno de los nutrientes que contiene.
> Medios complejos o indefinidos → no se conocen con exactitud la composición ni la concentración de
los nutrientes, contienen sustancias como extractos de carne o de levadura cuya composición no está
perfectamente definida y varía entre lotes.
c) Tipos de medios de cultivo atendiendo a su uso
> Medios comunes → contienen nutrientes mínimos necesarios para el crecimiento de la mayor parte de
las especies bacterianas que no presentan requerimientos especiales.
> Medios enriquecidos → son medios comunes suplementados con sustancias nutritivas y factores
necesarios para el crecimiento de bacterias exigentes en general o de un microorganismo concreto. El
suplemento puede ser un producto biológico, como la sangre, o aditivos artificiales.
> Medios selectivos → incluyen sustancias que inhiben el crecimiento de un tipo de microorganismos, a la
vez que favorecen el de las bacterias que nos interesan.
> Medios diferenciales → incluyen sustancias que permiten diferenciar entre dos tipos de
microorganismos, que tienen respuestas distintas ante su presencia. Se usan en procesos de
identificación bacteriana. Un tipo especial son los medios diferenciales cromogénicos, que permiten
identificar especies según el color de la colonia.
> Medios de transporte y mantenimiento → se emplean en la recogida, transporte y conservación de las
muestras biológicas. Son medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas
dentro de las células.

1.3. Medios de cultivo para bacterias más habituales

a) Medios sólidos
 Medios comunes
> Agar nutritivo → medio de cultivo más simple por su composición. Se utiliza para el crecimiento de
bacterias que no tienen requerimientos nutricionales especiales.
> Agar triptacasa-soja:
» Se utiliza en el aislamiento de bacterias no exigentes.
» La adición de un 5%de sangre de cordero (agar sangre) lo transforma en un medio enriquecido que
permite el crecimiento de un mayor número de especies bacterianas y posibilita la investigación de la
hemolisis.

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 Medios enriquecidos
> Agar columbia:
» Es un excelente medio para el crecimiento de bacterias exigentes, ya que es muy rico en nutrientes.
» Existen dos variantes muy utilizadas:
 Agar columbia + 5% de sangre de cordero:
× Es uno de los medios más utilizados en rutina como medio básico de aislamiento para la siembra
inicial de la mayor parte de las muestras, excepto orinas.
× La presencia de la sangre permite además el estudio de la hemolisis.
 Agar columbia + CNA + 5% de sangre de cordero → además de sangre, se suplementa con dos
antibióticos (CNA: colistina y ácido nalidíxico), que lo convierten en un medio selectivo para
bacterias grampositivas, especialmente estreptococos y estafilococos.
> Agar chocolate:
» Es una variación de agar sangre, en el que la sangre se calienta antes de adicionarla para que se
lisen los hematíes y se libere la hemoglobina.
» Algunos preparados en polvo incorporan directamente la cantidad adecuada de hemoglobina.
» La presencia de hemoglobina enriquece el medio con el factor X (hemina), imprescindible para el
crecimiento de algunas bacterias.
» Hay dos variantes muy utilizadas:
 Agar chocolate + factores de crecimiento → estos factores se adicionan en forma de mezcla
químicamente definida, que varía según las casas comerciales, pero todas contienen factor V
(NAD), necesario para el crecimiento de especies muy exigentes, sobre todo del género Neisseria y
Haemophilus y para Streptococcus pneumoniae.
 Agar Thayer-Martin:
× Es un agar chocolate enriquecido (con factores X y V), al que se añaden cuatro antimicrobianos
para que actúen de inhibidores: vancomicina, colistina, trimetoprim y nistatina o anfotericina.
× Es un medio selectivo para aislamiento de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis a
partir de muestras que contengan flora acompañante.
> Agar CLED (Cistina, Lactosa, deficiente en electrolitos):
» Es el medio más utilizado para el aislamiento y recuento de gérmenes urinarios.
» La adición de lactosa y un indicador (azul de bromotimol) permite diferenciar especies capaces de
fermentar la lactosa y la deficiencia en electrolitos impide que las especies de Proteus invadan toda la
placa.
> Mueller-Hinton:
» Es el medio recomendado universalmente para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
» Es también una base excelente para suplementarla con sangre y obtener medios de agar sangre para
cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.
 Medios selectivos y diferenciales
> Agar Chapman o manitol salado (MSA):
» Es un medio selectivo y diferencial para estafilococos.
» Tiene un alto contenido en cloruro sódico (7,5%), que inhibe el crecimiento de la mayoría de las
bacterias habituales, excepto las del género Staphylococcus.
» Además, la presencia de manitol y un indicador (rojo fenol) permite diferenciar entre especies manitol-
positivas (S. aureus) y manitol-negativas (S. epidermidis).
> Agar DNasa:
» Se usa para determinar la actividad de desoxirribonucleasas.
» Una aplicación es como medio diferencial para distinguir entre dos especies de estafilococos:
× S. aureus → DNAsa-positivo.
× S. epidermidis → DNAsa-negativo.
> Agar Bilis-Esculina:
» Es un medio selectivo para enterococos y ciertas especies de estreptococos (grupo D), gracias a la
presencia de sales biliares.
» La diferenciación entre ambos géneros se consigue gracias a la esculina, ya que los enterococos
pueden hidrolizarla, produciendo compuestos que reaccionan con sales de hierro presentes en el
medio y le dan una coloración negruzca.
> Agar MacConkey:
» Es un medio selectivo y diferencial para la detección de enterobacterias en muestras de origen
diverso.
» Contiene sales biliares y cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias grampositivas.
» Incluye además un indicador que permite detectar la fermentación de la lactosa:
× Las colonias de lactosa negativas → son incoloras
× Las colonias lactosa positivas → son de color rojo ladrillo, rodeadas de un halo de sales biliares
precipitadas.

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 > Agar Salmonella-Shigella o SS:
» Medio de aislamiento recomendado para la detección de las especies Salmonella ssp. y Shigella spp.
» Se inocula directamente a partir de heces, de una suspensión de heces o de caldos de
enriquecimiento.
> Agar de Levine o EMB (eosina y azul de metileno) → medio para el aislamiento de enterobacterias.
> Agar Kligler:
» Medio diferencial para la identificación de enterobacterias.
» Gracias a su composición (tres azúcares, un indicador y una sal de hierro), permite detectar especies
fermentadoras de glucosa o lactosa, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico.
> Löwenstein-Jensen:
» Medio selectivo para aislamiento de micobacterias.
» Contiene verde malaquita como agente inhibidor de otras bacterias y huevo como componente
enriquecedor.
> Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):
» Selectivo para el aislamiento de Legionella spp.
» Es un medio tamponado a un pH de 6’9, óptimo para el crecimiento de Legionella, que contienen
carbón y factores de crecimiento específicos para Legionella.
b) Medios líquidos
> Suelen utilizar se en:
» Cultivos primarios → de muestras con baja carga bacteriana o muestras mal conservadas, con el fin de
recuperar y expandir la población bacteriana para su posterior aislamiento e identificación en medios
sólidos.
» Enriquecimiento selectivo → de algunas especies a partir de muestras polimicorbianas. Esto se
consigue inhibiendo el crecimiento de las especies no deseadas y potenciando el crecimiento de las
especies de interés.
> Medios más comunes:
» Caldo tioglicolato (TG) → es un medio de enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos
cualitativos para la prueba de esterilidad, y en el aislamiento y cultivo de aerobios, anaerobios y
microaerófilos poco exigentes.
» Caldo infusión cerebro-corazón (BHI):
× Es un medio de uso general adecuado para el cultivo de una amplia variedad de bacterias, incluidas las
exigentes.
× Con adición de estreptomicina, gentamicina o cloranfenicol, resulta un medio selectivo para hongos.
» Caldo peptona → es un medio que se utiliza para el preenriquecimiento de microorganismos a partir de
diferentes muestras, en particular de productos alimentarios.
» Caldo selenito → es un medio que permite el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de
muestras clínicas, especialmente heces.
» Caldo 7H9 de Middlebrook → es un medio que favorece el crecimiento de micobacterias.

2. Preparación de los medios de cultivo

> Los medios de cultivo se pueden preparar a partir de los ingredientes que los componen, aunque lo más habitual
es a partir de un medio deshidratado comercializado.
> Las etiquetas de estos productos incluyen:
 Información relativa a su composición.
 Instrucciones para la preparación y conservación del medio (tanto en su forma polvo, como una vez
reconstituido).
 Para cada producto, es necesario seguir escrupulosamente las indicaciones del fabricante.

2.1. Procedimiento básico

> La preparación de todos los medios deshidratados se desarrolla en tres fases, aunque no siempre en el
mismo orden:
 Disolución del producto en polvo o mezcla de los ingredientes, para conseguir la composición deseada.
 Esterilización del medio.
 Distribución del medio en placas o en tubos.
a) Disolución de los ingredientes
> Sea a partir de los ingredientes o por disolución de un medio en polvo, para preparar el medio es
necesario controlar las concentraciones de cada ingrediente y aplicar los procedimientos establecidos.
> Es importante ajustar el pH del medio, ya que es un factor que favorecerá o inhibirá el crecimiento.
> La mayoría de las bacterias crecen bien a pH entre 5,5 y 8,5 (son neutrófilas). Aunque hay algunas que
necesitan pH inferiores (acidófilas) o superiores (basófilas).
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 b) Esterilización
> Esta es una fase crítica, ya que si el medio no es estéril no hay garantía de que lo que crezca en él
proceda del material sembrado.
> Para conseguir una correcta esterilización mediante técnicas de calor, la temperatura y el tiempo
seleccionados deben alcanzar a todo el líquido. Esto implica que:
» El tamaño de los recipientes será un factor que se deberá tener en cuenta al seleccionar el tiempo y la
temperatura.
» No se recomienda esterilizar juntos recipientes grandes y pequeños, ya que en este caso o bien el
líquido del recipiente pequeño se calentará demasiado, o bien el líquido más interno del grande no
llegará a la temperatura establecida.
> Se debe tener en cuenta que el vapor de agua debe poder llegar hasta el producto que se desea
esterilizar. Esto quiere decir que los recipientes nunca se deben cerrar herméticamente.
 Los indicadores de esterilidad
> Indicadores físicos → son los que obtenemos de la lectura de los paneles del equipo o de los
informes que emite.
> Indicadores químicos:
× Son sustancias que impregnan un papel especial y que cambian de color al calentarse.
× Suelen presentarse en forma de cinta adhesiva o de tiras de papel que se colocan en los paquetes
que contienen el material que se va a esterilizar.
× El color del papel cambiará si llega a la temperatura que corresponda.
> Indicadores biológicos:
× Son preparados comerciales que contienen esporas de Bacillus stearothermophilus.
× Siempre siguiendo las instrucciones del fabricante, se introducen los envases con las esporas junto
al material que se va a esterilizar.
× Terminado el proceso de esterilización, se incuban durante 24 horas.
× Si no crece nada → se debe considerar que la esterilización ha destruido las esporas, es decir, que
el procedimiento ha tenido un resultado correcto.

2.2. Preparación de medios sólidos, líquidos y semisólidos

a) Medios sólidos en placa

> Las pautas básicas para preparar medios en placa a partir de medios deshidratados es la siguiente:
1. Disolución del producto en polvo:
× Siguiendo las instrucciones de la etiqueta en cuanto a disolvente, concentraciones y ajuste de pH.
× Se disuelven con agua destilada, por agitación y calentando, para conseguir una buena
homogenización.
× Algunos agentes gelificantes necesitan que la mezcla hierva durante un minuto para disolverse
correctamente.
× Habitualmente, la preparación de los medios se realiza en matraces Erlenmeyer del volumen
adecuado
2. Esterilización:
× El procedimiento de esterilización más habitual es el autoclavado, aunque algunos medios que
contienen ingredientes termolábiles no se pueden someter a este proceso; en este caso se recurre a
la tindalización o a la filtración esterilizante.
× Para el autoclavado, se tapa el matraz que contiene la disolución con un tapón de algodón graso, que
se cubre con papel de aluminio. El matraz, así preparado, se introduce en el autoclave.
3. Complementación:
× Algunos ingredientes termosensibles, como ciertos antibióticos, sangre, vitaminas, etc. se incorporan
después de la esterilización.
× En este caso, cuando se saca el medio del autoclave se lleva a una zona estéril y, cuando esté
suficientemente frío (45-50 ºC), se le incorporan los ingredientes que corresponda, de forma aséptica.
× Estos suplementos pueden obtenerse estériles y listos para su uso o liofilizados. En este último caso,
el disolvente utilizado para su reconstitución debe ser estéril (normalmente agua destilada estéril).
4. Distribución:
× Se lleva el matraz a una zona estéril, se deja enfriar el medio hasta 45-50 ºC y se distribuye en placas
de Petri estériles, generalmente de 90 mm de diámetro (grosor de 2-3 mm)
× Seguidamente se deja enfriar; con lo que el medio adquirirá la consistencia sólida.
> Las placas preparadas y ya frías se deben sellar con cinta adhesiva para que no se abran
accidentalmente.
> A continuación, se recomienda colocarlas dentro de bolsas de plástico o envueltas en papel de aluminio en
posición invertida, para prevenir la desecación del medio.

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 > En estas condiciones y debidamente etiquetadas para que se pueda saber qué medio contienen y en qué
fecha se han preparado, se guardan refrigeradas a 2-8 °C; en estas condiciones suelen conservarse en
buen estado hasta 4-6 semanas.
b) Medios sólidos en tubo
> En la preparación en tubo la dosificación se suele realizar inmediatamente tras la disolución y lo que se
esteriliza son los tubos con el medio.
> Si los tubos tienen cierre hermético con tapón de rosca, este no debe estar totalmente enroscado durante
la esterilización en autoclave.
> La solidificación del medio por enfriamiento de los tubos se puede realizar de dos maneras diferentes:
» Con los tubos en posición inclinada → con ello se consigue que el agar quede inclinado y solidifique
en forma de pico de flauta, lo cual proporciona mayor superficie de cultivo.
» Con los tubos en posición vertical → estos medios suelen destinarse al estudio de la movilidad de
bacterias.
> Los tubos con los medios se almacenan cerrados en nevera a 2-8 ºC.
> El cierre ideal es con tapón de rosca, pero si el tipo de tubo no lo permite, se cierran con tapones de
algodón graso o con tapas metálicas del tamaño adecuado para adaptar en la boca del tubo.
c) Medios líquidos
> La preparación de los medios líquidos y semisólidos es como la de los medios sólidos en tubo, con el
enfriamiento en posición vertical.
d) Medios semisólidos
> Se utilizan para:
» Estudiar el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. En estos tubos, los niveles de difusión de oxígeno
en las distintas capas condicionarán el crecimiento de distintos tipos de bacterias (aerobios,
anaerobios).
» Estudiar la movilidad bacteriana, y detectar la presencia de flagelos.

2.3. Control de calidad de los medios de cultivo

a) Medios de cultivo comerciales

> Es recomendable que sean proporcionados por fabricantes certificados.
> Para cada lote de medio, el fabricante debe facilitar un certificado del control de calidad que incluye:
» Las condiciones de conservación.
» El control de esterilidad.
» Los criterios de aceptabilidad.
» El control del funcionamiento indicando las cepas utilizadas.
» La fecha de emisión.
» La firma del responsable del laboratorio fabricante.
> Tras la recepción de los medios procedentes de empresas certificadas y antes de usarlos, hay que
comprobar:
» Las características físicas → color, presencia de precipitados, consistencia incorrecta, placas rotas,
crecimiento de colonias, etc. Se debe documentar cualquier anomalía detectada.
» Esterilidad del medio.
» Adecuado funcionamiento del medio → usando cepas de referencia.
> Con relación a estas dos últimas comprobaciones, se distingue entre:
» Medios exentos → no requieren que el laboratorio realice estas comprobaciones, siempre que el
fabricante aporte las especificaciones de calidad correspondientes.
» Medios no exentos → el laboratorio debe efectuar siempre estas comprobaciones.

b) Medios de cultivo preparados en el laboratorio

> En este caso, hay que controlar:
» Todos los ingredientes y aditivos → el medio deshidratado o los ingredientes que se vayan a usar,
los indicadores u otros aditivos, el agua, etc. Para cada uno, se verifica que cumpla los requisitos de
calidad que le correspondan, que no supere la fecha de caducidad, que se haya conservado de forma
correcta, etc.
» Todos los procedimientos → elaboración, envasado, etiquetado y almacenamiento. El proceso de
elaboración debe quedar registrado, anotando la identidad de los medios, el número de lote, la fecha
de preparación, las condiciones de almacenamiento, la fecha de caducidad y la identidad de la persona
que los ha preparado.
> Para realizar el control de calidad del medio una vez preparado, se aplica el mismo procedimiento que
para los medios comerciales no exentos, comprobando:
» Las características físicas.
» La esterilidad del medio.
» El adecuado funcionamiento del medio → usando cepas de referencia.
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 > Todas las fases del proceso deben estar documentadas en un manual de procedimiento, y debe
mantenerse un registro detallado de ellas.

3. Siembra e incubación de los medios de cultivo

3.1. Siembra del medio de cultivo

> Siembra → consiste en depositar material bacteriológico en el medio de cultivo para promover su crecimiento
y multiplicación.
> Según la procedencia del material que se siembra, dos tipos de cultivo:
 Primarios → cuando se siembra material que procede directamente de una muestra biológica (siembra
primaria).
 Secundarios → cuando se siembra material procedente de un cultivo primario (resiembra).

a) Equipos e instrumentos para la siembra

 Instrumentos de siembra
> Asa de siembra o asa de platino:
» Se utiliza para siembra en estría, en medio líquido, semisólido, sólido y siembra en picadura.
» Tienen la propiedad de calentarse y ponerse al rojo vivo y de enfriarse rápido.
» Esta propiedad se utiliza en el trabajo rutinario para esterilizar el asa por calor con un mechero
antes y después de cada siembra.
» Asa → es el instrumento más utilizado para:
× Sembrar muestras líquidas → el asa esterilizada se sumerge en la muestra líquida y al sacarla
portará una fina película de muestra en el círculo terminal, que se descarga sobre el medio de
cultivo.
× Resiembras → se arrastra una o varias colonias crecidas en el cultivo primario con el círculo
terminal y luego se descarga sobre el nuevo medio de cultivo.
» Se comercializan asas de siembra desechables de plástico, esterilizadas con rayos gamma. Se
usan para recuentos.
» Una variedad son → las asas de siembra calibradas → tienen un círculo terminal de un diámetro
concreto, que cargan un volumen fijo de muestra líquida. Son muy útiles para efectuar recuentos a
partir de una muestra líquida.
> Hilo de siembra
» Termina en punta.
» Se utiliza para hacer resiembras en medios sólidos.
» Pueden ser de plástico y desechables.
> Asa o espátula de Drigalsky
» Termina en un triángulo o formando una L.
» Son útiles para extender muestras por toda la superficie de un medio de cultivo sólido en placa.
» Se utiliza para antibiogramas y recuentos.
> Pipetas pasteur → se utilizan para sembrar líquidos en cualquier medio.
> Pipetas automáticas
» Se utilizan para sembrar volúmenes determinados de muestras líquidas, para efectuar recuentos.
» Es imprescindible que las puntas de pipeta usadas estén estériles.
> Hisopos o torundas
» Bastoncillo con una bola de algodón, dacrón o alginato.
» Se utilizan para la toma de ciertas muestras, fundamentalmente exudados y su siembra primaria.
» Se realiza haciendo rodas o frotando la torunda sobre la superficie del medio de cultivo.
 Fuente de calor
> Más utilizada → mechero bunsen, que cumple doble función:
» Genera una zona aséptica libre de partículas de unos 10-15 cm de radio, en las que se debe
trabajar para minimizar los riesgos de contaminación ambiental.
» Permite esterilizar de forma rápida los instrumentos metálicos de siembra, ya que su llama puede
alcanzar temperaturas de 1300-1500 ºC.
> En la zona inferior hay un orificio que permite la entrada de aire:
» Si se cierra → la llama arde a menor temperatura y se ve de rojizo a amarillento. Se considera
«sucia» porque deja pequeñas partículas de hollín sobre la superficie que está calentando y
«segura» porque es claramente visible.
» Si se abre → la llama adquiere mayor temperatura y se vuelve de color azul. La llama que se
consigue con una abertura total es la que proporciona una temperatura más alta y no deja residuos
sobre la superficie, pero puede llegar a ser invisible contra un fondo uniforme, obliga a adoptar las
máximas precauciones.

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 > Debemos adoptar las siguientes medidas de seguridad:
» Abrir el gas lentamente para evitar que salga de golpe, cuando lo vamos a encender.
» Mantener la llama «invisible» solamente mientras se esté usando, nunca dejar el mechero sin
supervisión con esta llama.
» Verificar siempre que el gas está totalmente cerrado cuando lo apagamos.
» Evitar dejar objetos o productos químicos cerca de la llama.
» No pasar nunca las manos sobre la llama.
> En muchos laboratorios se ha sustituido el clásico mechero bunsen por → esterilizadores por
infrarrojos → son microhornos tubulares con una pequeña abertura circular por la que se introduce el
material que se va a esterilizar. Alcanzan temperaturas que oscilan entre 900 y 1500 ºC, por lo que la
esterilización se realiza en unos pocos segundos. Tienen la ventaja de eliminar las microproyecciones
que se producen en ocasiones al flamear los instrumentos de siembra.

b) Técnicas de siembra
 Siembra por agotamiento de asa
> Se realiza sobre medios sólidos en placas.
> Se basa en descargar totalmente el inóculo carado en un asa de siembra a lo largo de toda la
superficie del medio.
> La concentración de muestra en las distintas zonas de la placa va disminuyendo a medida que se va
agotando el material del asa.
> Así en la misma placa habrá zonas con distinta densidad de crecimiento:
» Zona de crecimiento masivo → correspondiente al área de la placa en la que se inició la descarga
del asa.
» Zona de crecimiento intermedio → densidad de crecimiento menor y colonias confluentes, sin que
se aprecien colonias aisladas.
» Zona en la que se observan colonias aisladas → como para permitir resiembras específicas para
su identificación.
> Siembra en zigzag
» Consiste en agotar el inóculo cargado en el asa de siembra mediante movimientos de zigzag a lo
largo de todo el medio de cultivo.
» Consta de cuatro fases:
1. Se coloca el asa con el inóculo sobre el medio de cultivo en un
punto periférico de la placa y se desplaza suavemente por su
superficie con un movimiento continuo y rápido en forma de Z.
2. Se gira la placa 90º en sentido contrario a las agujas del reloj y se
repite el mismo movimiento con el asa de siembra.
3. Se gira nuevamente y se repite el movimiento.
4. Se gira por última vez la placa y el último movimiento consiste en
realizar un desplazamiento del asa en zigzag por el pasillo central.
» Durante el proceso de siembra, el asa de siembra no se esteriliza entre fase y fase.
 Técnica de los cuatro cuadrantes
> Se dibujan dos líneas perpendiculares en la base de la placa, que se
deben cruzar en el centro, de forma que ésta queda dividida en cuatro
cuadrantes iguales.
> Se toma el asa de siembra con una cantidad de inóculo y se adiciona al
extremo superior de uno de los cuadrantes, extendiéndose en zigzag.
> Se realiza la misma operación en todos los cuadrantes siguiendo un orden,
de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema,
observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o
separadas.
> No se flamea el asa.
 Siembra masiva en superficie
> Se realiza sobre medios sólidos, tanto en placa como en tubo inclinado.
> Se siembra una cantidad determinada de producto, y se reparte de forma uniforme sobre la
superficie del medio.
> Procedimiento:
» Se vierte la cantidad mediad sobre el medio y se entiende de forma uniforme con
un asa de Drigalsky en L.
» Se puede depositar el material con una pipeta o con un asa calibrada y
extenderlo en forma de espiral.
> Útil para efectuar recuentos.

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  Siembra por punción o picadura
> Se realiza sobre medios sólidos o semisólidos (agar horizontal o agar inclinado).
> Consiste en introducir un hilo de siembra o asa de siembra cargado verticalmente en el
medio.
> Permiten observar la movilidad de los microorganismos.
> También se aplica en combinación con una siembra en superficie.
 Siembra por dilución
> Se realiza en medios de cultivo líquidos.
> Se carga el asa con una muestra sólida o líquida.
> Se introduce en el medio y se agita suavemente para descargarla.
> Si el inóculo es una muestra sólida → se puede frotar el asa de siembra, una vez
sumergida, sobre la pared del tubo que contiene el medio para asegurar la perfecta
disgregación y resuspensión de la muestra.

3.2. Parámetros de incubación

a) Temperatura y crecimiento
> Para cada microorganismo existen tres temperaturas cardinales:
» Temperatura mínima → por debajo de la cual no hay crecimiento.
» Temperatura óptima → a la cual el crecimiento es el más rápido posible.
» Temperatura máxima → rebasada, no existe crecimiento.
> Tipos de microorganismos:
» Psicrófilos → con temperaturas óptimas bajas:
× Temperatura mínima → -5 a +5 ºC.
× Temperatura óptima → 12 – 15 ºC.
× Temperatura máxima → alrededor de 15 a 20 ºC.
» Mesófilos → con temperaturas óptimas moderadas:
× Temperatura mínima → 5 a 15 ºC.
× Temperatura óptima → 30 a 45 ºC.
× Temperatura máxima → 35 a 47ºC.
» Termófilos → con altas temperaturas óptimas:
× Temperatura mínima → 40 a 45 ºC.
× Temperatura óptima → 55 a 75 ºC.
× Temperatura máxima → 60 a 90 ºC.
» Hipertermófilos → con temperaturas óptimas muy elevadas:
× Temperatura mínima → 55 ºC.
× Temperatura óptima → 80 a 113 ºC aprox.
b) Oxígeno y crecimiento
> Aerobios → microorganismos que viven en ambientes con tensiones normales de oxígeno (21%).
> Microarófilos → microorganismos que viven en presencia de niveles de oxígeno que están bajo la
concentración presente en el aire (< 21%).
> Anaerobios facultativos → microorganismos que pueden vivir en ausencia de oxígeno o en su presencia.
> Anaerobios → microorganismos incapaces de crecer en presencia de oxígeno.
c) pH y crecimiento
> Acidófilos → 0 – 5’5.
> Neutrófilos → 5’5 – 8.
> Alcalófilos → 8’5 – 11’5.
> Alcalófilos extremos → mayor de 10.
d) Crecimiento
> Crecimiento → incremento en el número de células microbianas en una población.
> Velocidad de crecimiento → es el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo.
> Tiempo de generación o tiempo de duplicación → es el tiempo requerido para que a partir de una
célula se formen dos células. Varía para cada especie. Este modelo en el que el número se duplica por
unidad se denomina crecimiento exponencial.
> Crecimiento exponencial → basado en el concepto que una célula se divide dando dos células hijas, y
éstas a su vez se vuelven a dividir dando dos células cada una de ellas y así sucesivamente.
> Crecimiento bacteriano
» Fase de latencia → se define como el tiempo necesario para la adaptación de las bacterias al medio
donde se siembran. Aumentan de volumen, pero no se dividen. Sufren cambios en su composición
química.

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 » Fase de desarrollo exponencial o logarítmica → las bacterias se multiplican a velocidad constante y
exponencial, la actividad metabólica es máxima y la sensibilidad a los agentes físicos, químicos, agentes
antimicrobianos y fagos es óptima en esta fase.
» Fase estacionaria → se van agotando los nutrientes y acumulando productos tóxicos, en la que algunas
células mueren y otras crecen y se dividen. El número de células viables se mantiene constante o baja.
» Fase de muerte o lisis → mueren más células que las que se producen. La tasa de muerte se acelera,
haciéndose exponencial. Las células mueren todas en cuestión de horas o días dependiendo de la
especie.

4. Finalidad del cultivo bacteriológico

4.1. Aislamiento

> Aislamiento → separación de un determinado microorganismo del resto de los microorganismos que lo
acompañan.
> A partir del aislamiento se puede realizar la identificación, así como resiembras o estudios de sensibilidad a
antibióticos.
> Para conseguir el aislamiento se realizan siembras por agotamiento en los medios adecuados, de manera
que en alguna zona del medio se obtengan colonias separadas y definidas.
> La necesidad de aislar una especie bacteriana puede responder a dos objetivos diferentes:
 Aislar una especie bacteriana concreta a partir de una muestra o mezcla polimicrobiana → la siembra se
efectúa en un medio selectivo que permita el crecimiento de la especie que queremos aislar e impida el
crecimiento de la flora acompañante.
 Aislar las distintas especies bacterianas presentes en una muestra → se suelen sembrar varios medios de
cultivo que cubran los requisitos de los principales tipos de bacterias que se pueden esperar en esa
muestra.

4.2. Identificación

> Cuando el cultivo se ha realizado en medios diferenciales con fines de identificación de una especie
bacteriana, tras la incubación se procede al análisis macroscópico del medio y de las colonias que han
crecido en él.
> Entre otros parámetros, hay que documentar:
 Morfología de las colonias, incluyendo su coloración.
 Cambio de coloración del medio de cultivo, que se puede deber a:
» Viraje de un indicador.
» Producción por la bacteria de una sustancia que reacciona con un componente del medio originando un
producto coloreado.
 Precipitación de algún componente del medio alrededor de las colonias.
 Producción de gas, sobre todo en medios sólidos en tubo. La producción de gas se detecta por la
fragmentación o el desplazamiento (elevación) del medio de cultivo dentro del tubo.

4.3. Recuento

> Antiguamente este recuento se realizaba en cámaras de recuento, como la de Petroff-Hausser, que son
portaobjetos excavados sobre cuya superficie está marcada una rejilla milimetrada con pequeños cuadros de
área conocida. En estas cámaras se contaba, bajo el microscopio, el número de bacterias presentes en un
volumen determinado de la muestra. El inconveniente que presenta este método es que se cuentan todas las
bacterias, tanto vivas como muertas.
> Sin embargo, en microbiología interesa fundamentalmente el número de bacterias viables, es decir, aquellas
que son capaces de multiplicarse.
> Los recuentos de viables → se basan en contar el número de colonias que crecen en un medio sólido en
placa.
> Los recuentos no se expresan como número de colonias, sino como → número de unidades formadoras de
colonias (UFC).
> Los cultivos para recuento deben cumplir dos requisitos:
 La densidad de colonias en la placa debe permitir el recuento → si las colonias están sobrepuestas o
amontonadas, no se podrá realizar.
 Se debe sembrar una cantidad conocida de muestra → ya que el resultado se expresa en UFC por
cantidad o volumen de muestra.

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a) Métodos de recuento
 Método directo de recuento
× Consiste en sembrar un volumen conocido de la muestra en un medio sólido en placa mediante la
técnica de la siembra masiva en superficie, es decir, depositando la muestra sobre el medio de cultivo y
extendiéndola por toda la superficie mediante un asa de Drigalsky en L.
× Tras la incubación, se hace directamente un recuento manual, marcando con un rotulador sobre la
placa las colonias que se han contado.
× En este caso, el número de UFC/ml coincide con el número de colonias contadas (si el volumen de
siembra es distinto a 1 ml, hay que tenerlo en cuenta para efectuar los cálculos).
× Este método es efectivo para recuentos de muestras con una carga bacteriana baja, pero es
sumamente engorroso para muestras con cargas altas.
 Recuento de viables
× El recuento en placa determina el número de células capaz de generar colonias sobre la superficie de
un medio sólido.
× Hay dos formas:
» Por siembra en superficie → se siembra 0’1ml de muestra y se extiende por la superficie con una
barra de vidrio o metal
» Por siembra en profundidad → se siembra de 0’1 a 1 ml en la placa de Petri y se agrega el medio
sólido fundido (40 °C) y se incuba.
× Por este método se pueden usar volúmenes más grandes
× Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista temperaturas de 40 a 45°C
× El número de colonias que puede ser contado oscila entre 30-300 colonias
 Método de las diluciones decimales seriadas
× Se puede realizar una serie de diluciones a partir de la muestra.
× Estas diluciones se siembran en placas, de forma que seguro que en algunas de ellas se consigue una
densidad adecuada.
× Este es el método de elección para el recuento de muestras con una elevada carga bacteriana.
× El sistema que se aplica es el de las diluciones decimales: la primera es la muestra original, la segunda
está diluida a 1:10, la tercera a 1:100, y así sucesivamente.
× Por ejemplo, para realizar una serie de cinco diluciones:
1. Se preparan cinco tubos rotulados en múltiplos de 10 (10, 102, 103,104 y105) y se introducen 9 ml
de diluyente en cada uno de ellos.
2. Se añade 1 ml de la muestra en el primer tubo y se homogeneiza la mezcla (dilución 1/10).
3. Se trasvasa 1 ml del primer tubo al segundo y se homogeneiza la mezcla (dilución 1/100).
4. Se repite el paso anterior hasta el último tubo.
× Una vez hechas las diluciones, se procede a sembrar en seis placas de Petri con un medio de cultivo
adecuado y rotuladas en múltiplos de diez (1, 10, 102, 103,104 y105).
× Se siembra 1 ml de la muestra original en la placa 1, y 1 ml de cada dilución en su correspondiente
placa.
× Tras la incubación, se selecciona la placa que tenga una densidad adecuada de colonias y se cuenta
su número.
× Para dar el resultado se tiene en cuenta la dilución: si, por ejemplo, se ha usado la placa 10 2, el
resultado obtenido en el recuento tendrá que multiplicarse por 100, que es la dilución que se había
aplicado a la muestra.
× El inconveniente de este método es el elevado número de placas que se usan para un único recuento.
 Método de filtro de membrana
× Consiste en hacer pasar un volumen prefijado de muestra a través de una membrana de nailon o
nitrocelulosa con un tamaño de poro adecuado, que retiene las bacterias (0’22 µm).
× Se coloca a continuación el filtro sobre un medio de cultivo sólido, se incuba y se cuentan las colonias
que han crecido.

b) Métodos de recuento estimativo

 Estándares de turbidez de McFarland
× Estándares de McFarland → son patrones de turbidez basados en suspensiones de sulfato de bario.
× La escala consta de 11 patrones (desde 0,5 hasta 10), cada uno de los cuales tiene una turbidez
comparable a la de una suspensión bacteriana con una densidad determinada.
× Cada patrón se prepara mezclando ácido sulfúrico al 1% (0’18 M) con una disolución de cloruro de
bario al 1’175% (0’048 M) en las proporciones adecuadas.
× Para estimar la densidad bacteriana de una suspensión se compara visualmente su turbidez con la de
los patrones de McFarland, colocando los tubos contra un fondo blanco con franjas negras horizontales
de contraste.

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 Espectrofotometría
× El fundamento del método de recuento estimativo espectrofotométrico es similar al anterior, puesto que
también se basa en la turbidez que presenta una suspensión bacteriana.
× Se mide la absorbancia de la suspensión directamente con un espectrofotómetro a 600 o 625 nm.
× La lectura obtenida se traslada a una tabla de calibración previamente obtenida y se traduce a
bacterias/ml.
× Este método es más objetivo que el de los estándares de McFarland, puesto que la comparación visual
subjetiva de dos tubos se sustituye por una lectura espectrofotométrica objetiva de la turbidez.
× Además, la estimación del recuento es más exacta, ya que se puede intercalar el valor de densidad
óptica de la suspensión bacteriana problema en una curva de calibración.

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