MEDIOS DE CULTIVO

MICROBIANOS

POR: PROF. RITA BETHANCOURT

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

› 1. Comprender las características de los medios

de cultivos microbianos, clasificación y usos.
› 2. Ensayar la preparación de medios de cultivo
microbiano mediante una experiencia práctica.
› 3. Practicar con muestras bacterianas la técnica de
estriado por dilución con la finalidad de aislar
cultivos puros de cultivos mixtos
INFORMACIÓN

En la naturaleza los
microorganismos se
encuentran formando
poblaciones mixtas de una
gran variedad de tipos
diferentes. Sin embargo, el
desarrollo de la microbiología
como ciencia se ha logrado
mediante el estudio de
especies aisladas crecidas en
medios de cultivo
desprovistos de cualquier
otra forma de contaminación.
El material en el que se cultivan
los microorganismos en el
laboratorio se le denomina
medio de cultivo. Los medios
de cultivo microbianos
consisten en una mezcla simple,
a ligeramente compleja, de
varios nutrientes que
favorecerán el crecimiento de
determinados tipos de
microorganismos. Los medios
están compuestos de sales
inorgánicas enriquecidas con
sustancias orgánicas disueltas
en un medio acuoso el cual
generalmente es el agua
. La calidad del agua que
empleara para la preparación
de medios de cultivo resulta
vital para favorecer el
crecimiento de los mismos.
Siempre emplee agua
destilada, el agua del grifo
por lo general presenta una
proporción elevada de ciertos
iones como calcio y magnesio
(fosfatos) los cuales podrían
precipitar presencia de
agentes como la peptona y
extracto de carne.
El crecimiento de los microorganismos depende fundamentalmente de la
disponibilidad de agua y los microorganismos requieren de material
nutritivo para sintetizar material celular.
Según su estado físico los medios de cultivo pueden clasificarse en sólidos, semi sólido y líquidos.

Medios sólidos: estos medios tienen la apariencia de un gel firme. Tienen una concentración de
agente gelificante o solidificante que oscila entre 1.5-2.0%. Se emplean en bacteriología desde que
fueron adoptados por Robert Koch, su importancia radica en que por su consistencia permiten
separar colonias originadas de células individuales.
› Medios Semi-sólidos:
contienen una baja
concentración de agente
solidificante que le permite
una consistencia más ligera,
similar a la gelatina. Estos
medios de cultivo son útiles
para el cultivo de bacterias
microaerofílicas y también
para estudiar aspectos como
la motilidad y la quimiotaxis.
›
Medios Líquidos: al igual
que los medios sólidos y
los semi-sólidos provee
de nutrientes necesarios
para el crecimiento y
multiplicación de los
microorganismos, pero
con la diferencia de que
no se les agrega agente
solidificante. Son útiles
para cultivar y realizar
experiencias rápidas con
bacterias, así como
también para
determinar curvas de
crecimiento bacteriano.
El agente solidificante
empleado con mayor
frecuencia en los medios de
cultivo microbianos es el
Agar-agar. El agar es un
polímero sulfatado
compuesto principalmente de
D-galactosa, 3,6-anhidro-L-
galactosa y ácido glucurónico.
Es considerado un excelente
agente solidificante por varias
razones, la principal es que
una vez que se funde en agua
hirviendo (95-100°C) puede
enfriarse a una temperatura
superior a los 40°C sin que se A temperatura inferior a los 40°C el estado del medio que lo contenga
solidifique, lo que facilita su pasará de líquido a sólido. En general, su uso como agente
manejo en el laboratorio
especialmente cuando se solidificante ha sido exitoso con casi todos los grupos microbianos
necesita servir en platos Petri. debido a que la mayoría de los microorganismos no pueden
degradarlo, es decir, no obtienen energía del mismo para crecer o
desarrollarse.
Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo con
la composición química:
› De acuerdo con la
composición química los
medios de cultivo serán:
Químicamente definidos o
Sintéticos y No Definidos
químicamente o complejos.
› Un medio químicamente
definido se prepara agregando
cantidades precisas de
sustancias químicas
inorgánicas y orgánicas sobre
un solvente (generalmente
agua). En esta clase de medios
se conocen todos los
componentes y las cantidades
exactas que se emplearán.
› Los medios de cultivo no
definidos químicamente o
complejos contienen algunos
ingredientes cuya composición se
desconoce. La lista de estos
productos es larga e incluye,
digeridos crudos, infusiones,
además de extractos vegetales y
animales. Son ejemplo de
sustancias químicamente no
definidas: la peptona, el extracto
de carne, la caseína, extracto de
levadura, la sangre y la infusión
de cerebro entre otros. Gran
parte de estos digeridos están
disponibles comercialmente en
forma de polvo suelto lo cual
facilita que sean agregados a los
medios de cultivo durante su
preparación.
En muchos casos el uso de
ingredientes complejos en un
medio de cultivo anula la
necesidad de emplear
químicos purificados. El
análisis del extracto de
levadura y de carne, así como
el de otra constituyente
usualmente revela niveles
suficientes de tanto
macroelementos como
microelementos esenciales
para el crecimiento, sin
embargo queda sin conocerse
con precisión todo el aporte
nutricional y las cantidades
exactas proporcionadas por
estas sustancias.
Clasificación de los medios de cultivo en base a la
función o aplicación en el laboratorio:
› Se ubican en 4 categorías
generales: Medios Simples,
Selectivos, Diferenciales y
Enriquecidos.
› Medios de cultivo Simples:
su composición favorece el
crecimiento de una gama
amplia de microorganismos,
carece de sustancias
inhibidoras. Ejemplos: Agar
y caldo nutritivo, Agar
extracto de malta.
› Medios de cultivo Selectivos: Estos
medios proveen nutrientes o químicos
específicos que incrementan o
favorecen el crecimiento y
predominancia de un tipo particular
de microorganismo, mientras inhibe a
otros microorganismos que pueden
estar presente en la muestra. Las
sales biliares o colorantes como la
fucsina básica y el violeta cristal
favorecen el crecimiento de bacterias
Gram negativas al inhibir el
crecimiento de las Gram positivas sin
afectar a las primeras. Medios de
cultivo como Agar Eosina Azul de
Metileno (EMB), Agar Mac Conkey
emplean con frecuencia este principio
para aislar microorganismos Gram
negativo presentes en muestras de
agua o muestras ambientales
El cloruro de Sodio también ha sido empleado con éxito que algunos medios
de cultivo para permitir el aislamiento de organismos que toleran altas
concentraciones del compuesto, tal es el caso del Agar Manitol Salado.
Medios de cultivo Diferenciales:
Ciertos reactivos o suplementos que
son incorporados a los medios de
cultivo permiten la diferenciación
entre tipos de colonias bacterianas
desarrolladas después de la
incubación. Por ejemplo si
esparcimos una gota de agua residual
el Agar EMB algunas de las bacterias
que crecen en el medio producirán
colonias con un color verde metálico
en tanto que otras pueden producir
un color rosado, otras podrían
presentar un color rosado o morado
con centro oscuro lo cual evidencia
que podemos distinguir diferentes
tipos de colonias gracias a la
composición del medio.
El agar EMB es considerado
un medio selectivo y
diferencial. La principal
fuente de carbono de este
medio es la lactosa de tal
manera que los
microorganismos que crecen
en este medio son aquellos
capaces de producir la
enzima β galactosidasa la
cual degrada la glucosa,
lactosa y galactosa.
Simultáneamente el medio
contiene los colorantes
eosina y azul de metileno los
cuales inhiben el crecimiento
de bacterias Gram positivas.
› Los medios de cultivo
Enriquecidos: se utiliza para
favorecer el crecimiento de
microorganismos fastidiosos o
complicados que requieren
factores de crecimiento
determinados, como Neisseria
gonorrhoeae (gonorrea) y
Streptococcus, Salmonella y
Listeria entre otros. Son
ejemplos de medios
enriquecidos: Agar y Caldo
Infusión de cerebro-corazón
(BHI) , el Caldo para
Estreptococos y el Agar
Sangre.
›
REVISION DE ETIQUETAS DE ENVASES DE MEDIO DE CULTIVO USADOS EN
EL LABORATORIO
› 1. Revise exhaustivamente las etiquetas de todos los frascos con medio de
› cultivos suministrados por el profesor.
› Ponga especial atención en:
› a. Nombre del medio de cultivo, casa comercial de donde proviene y su uso
› b. Composición del medio
› c. Gramos en el envase
› d. Porción que debe pesar para preparar 1 L o 1000mL del medio
› e. Condiciones de esterilización
› f. Fecha de Vencimiento
› g. Condiciones de almacenamiento
Preparación de un medio de cultivo
› Datos importantes:
› Cantidad de agua destilada
para platos Petri desechables
estándar 20mL esto puede
cambiar si se emplean platos
de otras proporciones (25-30
mL).
› Cantidad de agar para
inclinado 10mL
› Cantidad de caldo en un tubo
5, 6 hasta 10mL, estas
proporciones dependerán de
su necesidad.
› Las proporciones del agua
destilada en los medios
siempre se trabajaran el mL 1L
= 1000 mL
› Los recipientes (matraces,
botellas) en donde se
colocaran los medios de
cultivo para su posterior
esterilización siempre
deberán tener el doble del
tamaño de líquido que se
coloque en ellos en especial
cuando se trate de los agares
porque estos al hervir tienden
a votarse.
› Cada medio de cultivo sólido posee dentro de su composición
de 15 hasta 18 g de agar-agar.
› Únicamente deberá emplear agua destilada en las preparaciones
de los medios de cultivo, esto es debido a que esta agua permite
mantener estable el pH final de los medios de cultivo
› Ejemplo 1 de la preparación de un
medio de cultivo: › Resolución
› Se necesitan preparar 5 platos Petri con 1. 5 platos y cada una posee 20 mL
agar nutritivo, la etiqueta del medio › 5x20mL = 100mL
señala que se deben tomar de este
15g/1L
› Preguntas 2. Tamaño de recipiente 200-250 mL
› Qué cantidad de agua destilada se
necesita en esta preparación.
3. Cuánto se debe pesar del medio
› Qué tamaño debe tener el recipiente
(matraz) en donde colocare el agua 15 g----------1000 mL (1 L)
destilada
X -----------100 mL
› Cuántos gramos del medio debo pesar
para diluirlo en el agua destilada X = 15g x 100 mL/ 1000 ml
X = 1.5 g

Conclusión 1.5 g se deben añadirse a los

100 mL de agua destilada que están
contenidos en el matraz de 200mL para
ser llevados al autoclave.
› Ejemplo 2:
› Prepare 10 tubos con caldo
BHI (infusión cerebro corazón)
cada tubo de contener 6 mL
del caldo. Se deben tomar del
medio de cultivo 50 g/1L
A. Qué cantidad de agua
destilada se necesita en esta
preparación
› 10 tubos X 6 mL = 60 mL
B. Qué tamaño debe tener el
matraz para esta preparación
› 100 mL
C. Qué cantidad del medio debo
pesar?
50 g --------1000 mL (1L)
X --------60 mL
X = 50g x 60 mL / 1000 mL
X=3g
Conclusión
Debo tener un matraz de 100 ml
para agregar 60 mL de agua
destilada y añadirle los 3 g del
medio BHI y finalmente pipetear
6 mL en cada uno de los 10
tubos de ensayo con tapa de
rosca.
› Ejemplo 3 › Conclusión
› Tengo 25 mL caldo nutritivo y › Los 25 mL de caldo deben
ahora lo quiero convertir en estar colocados en un matraz
agar nutritivo. de 100 mL y allí le voy a añadir
› A. Qué cantidad de agar-agar los 0.38 g de agar-agar para
debo añadir al caldo luego llevarlo al autoclave
previamente preparado?
› Recuerde que cada medio
cultivo posee en su
constitución un promedio de
15 g de agar / 1 L
› A. 15g ------1000 mL
› X-------25 mL
› X = 15g x 25 ml/1000 ml
X = 0.375 g de agar-agar