Unidad 3: Bacteriología: técnicas de

cultivo, aislamiento y recuento

3.1 Los medios de cultivo
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos.

Las bacterias son organismos quimioorganoheterótrofos, ya que obtienen la energía necesaria

para su metabolismo a partir de diferentes compuestos mediante reacciones químicas
(quimiótrofos), utilizan compuestos orgánicos para los procesos de biosíntesis (quimiótrofos) y
utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono (heterótrofos).

3.1.1 Composición de los medios de cultivo

Los medios de cultivo contienen una mezcla compleja de nutrientes. Todos los medios deben
contener fuentes de:

֍ Carbono: sirve para la síntesis de todos los compuestos orgánicos y de fuente de

energía.
֍ Nitrógeno: sirve para la síntesis de aminoácidos y bases nitrogenadas.
֍ Azufre: sirve para la síntesis de aminoácidos azufrados.
֍ Fósforo: sirve para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos.
֍ Sales minerales
֍ Factores del crecimiento

3.1.2 Clasificación de los medios de cultivo

Componente Características
Agar Da consistencia al medio
Gelatina Misma función que el agar pero es menos utilizado
Carbohidratos Detecta reacciones de fermentación
Peptona Principal fuente de nitrógeno de los medios de cultivo
Extracto de carne Contiene bases orgánicas solubles
Extracto de Fuente de aminoácidos y vitamina B
levadura
Sangre La más utilizada es sangre de cordero. Permite detectar reacciones hemolíticas y
aporta factor X
Plasma Valora la actividad coagulasa
Suero Aporta hormonas y factores de crecimiento
Bilis El bilis de buey inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas y de bacilos en
forma de esporas
Sales biliares Inhibe el desarrollo de bacterias grampositivas y de bacilos en forma de esporas, sin
afectar a los bacilos entéricos gramnegativos
Indicadores Detectan la formación de ácido, siendo el más común el rojo fenol
Colorantes Son inhibidores del crecimiento, como el violeta de genciana, que inhibe el
crecimiento de bacterias grampositivas
Tipos de medios de cultivo atendiendo a su estado físico
֍ Medios solidos
֍ Medios líquidos
֍ Medios semisólidos

Tipos de medios de cultivo atendiendo a su composición

֍ Medios químicamente definidos: se conoce con exactitud su composición y
concentración
֍ Medios complejos o indefinidos: no se conoce con exactitud la composición ni la
concentración de los nutrientes.

Tipos de medios de cultivo atendiendo a su uso

֍ Medios comunes: contienen los nutrientes mínimos necesarios para el crecimiento de
bacterias que no precisan requerimientos especiales.
֍ Medios enriquecidos: son medios comunes suplementados con sustancias nutritivas y
factores necesarios, como la sangre o aditivos artificiales.
֍ Medios selectivos: incluyen sustancias que inhiben el crecimiento de un tipo de
microrganismos, que favorecen el crecimiento de las bacterias que nos interesan.
֍ Medios diferenciales: incluyen sustancias que permiten diferenciar entre dos tipos de
microorganismos. Se usan en procesos de identificación bacteriana. Un tipo especial
son los medios diferenciales cromogénicas.
֍ Medios de transporte y mantenimiento: se emplean en la recogida, transporte y
conservación. Inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las
células.

3.1.3 Medios de cultivo para bacterias más habituales

Medios de cultivo sólidos para bacterias aerobias
Medios comunes
֍ Agar nutritivo: es el más simple.
֍ Agar tripticasa-soja: se utiliza para la investigación de la hemolisis

Medios enriquecidos
֍ Agar Columbia:
 Agar Columbia + 5% de sangre de cordero: uno de los más rutinarios
 Agar Columbia + 5% de sangre de cordero + CNA: medio selectivo para
bacterias grampositivas, especialmente estreptococos y estafilococos.
֍ Agar chocolate:
 Agar chocolate + factores de crecimiento: es un medio selectivo para el
aislamiento de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis
֍ Agar CLED: es utilizado para el aislamiento y recuento de gérmenes urinarios.
֍ Mueller-Hinton: se utilizan para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.

Medios selectivos y diferenciales

 ֍ Agar Chapman o manitol salado (MSA): inhibe el crecimiento de la mayoría de las
bacterias, excepto las del género Staphylococcus.
֍ Agar DNAsa: distingue entre dos especies de estafilococos, S. aureus (DNAsa positivo) y
S. epidermidis (DNAsa positivo).
֍ Agar Bilis-Esculina: es un medio selectivo para enterococos y estreptococos.
֍ Agar MacConkey: medio selectivo y diferencial para la detección de enterobacterias, y
detecta las lactosa negativas de las lactosa positivas.
֍ Agar Hektoen o entérico: medio selectivo de Salmonella, Shigella y Yersinia.
֍ Agar Salmonella-Shigella o SS: detecta Salmonella spp. y Shigella spp.
֍ Agar de Levine o EMB
֍ Agar TSI
֍ Agar Kligler
֍ Löwenstein-Jensen
֍ Agar BCYE
 Agar BCYE-GVPC
֍ Agar Campylosel
֍ Agar Gardnerella

Medios de cultivo sólidos para bacterias anaerobias

Medios enriquecidos para aislamiento
֍ Agar Schaedler
 Agar Schaedler + Neomicina y vancomicina
֍ Agar bilis-esculina

Medios selectivos
֍ Agar Clostridium difficile: medio para el aislamiento selectivo de Clostridium difficile. Es
una variedad del agar Columbia + 5% de sangre de cordero, suplementado con
antibióticos y antifúngicos que inhiben el crecimiento de la mayor parte de la flora
intestinal.

Medios de cultivo líquidos para bacterias

֍ Caldo tioglicolato: es un medio de enriquecimiento. Es de carga baja.
֍ Caldo peptona: es de carga baja
֍ Caldo selenito: permite el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp.
֍ Caldo 7H9 de Middlebrook: medio de enriquecimiento que favorece el crecimiento de
micobacterias.

3.2 Preparación de los medios de cultivo

Se pueden preparar a partir de los ingredientes que los componen, aunque lo más habitual es
partir un medio deshidratado comercializado.

3.2.1 Procedimiento básico

La preparación de todos los medios deshidratados se desarrolla en 3 fases:
 ֍ Disolución del producto en polvo o mezcla de los ingredientes.
֍ Esterilización del medio.
֍ Distribución del medio en placas o tubos.

Disolución de los ingredientes

Es necesario las concentraciones de cada ingrediente y aplicar los procedimientos
establecidos.

Esterilización
Esta es una fase crítica, ya que si el medio no es estéril no hay garantía de lo que crezca en el
proceda del material sembrado.

֍ El tamaño de los recipientes es un factor que se debe tener en cuenta al seleccionar el

tiempo y la temperatura.
֍ No se recomienda esterilizar juntos recipientes de distintos tamaños, porque el grande
no llegara a la estructura establecida.

En el caso del autoclave, que es el método más habitual de esterilización, se debe tener en
cuenta que el vapor de agua debe poder llegar hasta el producto que se desea esterilizar. Los
recipientes nunca se deben cerrar herméticamente.

Los recipientes vacíos precisan un tiempo de esterilización mayor que los que contienen
líquidos en su interior.

Los indicadores de esterilidad

֍ Indicadores físicos: son los que obtenemos de la lectura de los paneles del equipo o de
los informes que emite.
֍ Indicadores químicos: son cinta adhesiva o de tiras de papel colocadas dentro del
autoclave.
֍ Indicadores biológicos: son preparados comerciales que contienen esporas de Bacillus
stearothermphilus, que se introducen los envases con las esporas junto al material que
se va a esterilizar. Terminado el proceso de esterilización, se incuban durante 24 horas.

3.2.2 Preparación de medios sólidos, líquidos y semisólidos

Medios sólidos
Los medios solidos se pueden disponer en placas de Petri, que es lo más habitual, pero
también en tubos, que contienen un agente gelificante. Este agente tiene consistencia liquida
en caliente, y se solidifica al enfriarse.

Medios sólidos en placa

֍ Disolución
֍ Esterilización
֍ Complementación
֍ Distribución en placa

Medios sólidos en tubo

La dosificación se suele realizar inmediatamente tras la disolución y lo que se esteriliza son los
tubos con el medio.

֍ Con los tubos en posición inclinada

֍ Con los tubos en posición vertical

Medios líquidos
La preparación de los medios líquidos es como la de los medios solidos en tubo, con el
enfriamiento en posición vertical.

En el caso de algunos medios, se los puede esterilizar ene el matraz y practicar la dosificación
posteriormente con la ayuda de dispensadores de líquidos.

Medios semisólidos
Estos medios contienen un agente gelificante, pero en concentración mucho menor que los
medios sólidos.

La preparación se realiza en tubos, y se puede esterilizar antes o después de la dosificación.

Estos medios se utilizan para:

֍ Estudiar el crecimiento bacteriano.

֍ Estudiar la movilidad bacteriana y detectar la presencia de flagelos.

3.2.3 Control de calidad de los medios de cultivo

Los medios de cultivo se deben someter a controles de calidad internos. Se distingue entre los
medios comerciales y los medios preparados en el laboratorio.

Medios de cultivo comerciales

Deben tener un certificado de control que incluya:

֍ Las condiciones de conservación

֍ El control de esterilidad
֍ Los criterios de aceptabilidad
֍ El control del funcionamiento indicando las cepas utilizadas
֍ La fecha de emisión
֍ La firma del responsable del laboratorio fabricante

Tras la recepción, se debe comprobar

֍ Las características físicas

֍ La esterilidad del medio
֍ El adecuado funcionamiento del medio

Con relación a las dos últimas comprobaciones, se distingue entre:

֍ Medios exentos: no requieren que el laboratorio realice estas comprobaciones.

֍ Medios el laboratorio debe efectuar siempre estas comprobaciones.

Problemas en la preparación de medios de cultivo

 Problemas Posibles causas
Falta de solidificación de un medio Sobrecalentamiento del medio durante el
proceso
Cantidad incorrecta de agar
Mala disolución
PH incorrecto Sobrecalentamiento del medio durante el
Color anormal proceso
Formación del precipitado Uso de agua no destilada
Errores en la medición del pH
Contaminación externa
Productividad baja Formulación inadecuada
Selectividad pobre

Medios de cultivo preparados en el laboratorio

Hay que controlar:

֍ Todos los ingredientes y aditivos

֍ Todos los procedimientos
֍ Control de calidad
 Las características físicas
 La esterilidad del medio
 El adecuado funcionamiento del medio

3.3 Siembra e incubación de los medios de cultivo

3.3.1 Preparación de la muestra
Existen varios procedimientos:

֍ Centrifugación de la muestra 15’ a 2500 rpm. Se utiliza para abscesos y LCR.

֍ Trituración de las muestras, como en el caso de las biopsias.
֍ Inspección macroscópica de la muestra para detectar y seleccionar las zonas
purulentas para tomar el material de siembra de ellas, como en el caso de las heces.
֍ Fluidificación y descontaminación de muestras con moco y/o abundante flora
polimicrobiana, como en esputos para investigar micobacterias.
֍ Verificación de la adecuación del medio de transporte. El más habitual es el Stuart-
Ames, para bacterias aerobias.

3.3.2 siembra del medio de cultivo

La siembra consiste en depositar material bacteriológico en el medio de cultivo para
promover su crecimiento y multiplicación. Hay dos tipos de cultivo:

֍ Primarios: se siembra material que procede directamente de una muestra

biológica.
֍ Secundarios: se siembra material procedente de un cultivo primario (resiembra).

Equipos e instrumentos para la siembra

Instrumentos de siembra
 ֍ Asa de siembra o asa de platino: sirve para sembrar muestras liquidas y para
resiembras. También se utiliza para recuentos.
֍ Hilo de siembra: se utiliza para resiembras en medios solidos de tubo. Pueden ser de
plástico y desechables.
֍ Asa o espátula de Drigalsky: es similar al asa de siembra. Sirve para extender muestras
por toda la superficie de un medio de cultivo sólido en placa.
֍ Pipetas automáticas: se utiliza para efectuar recuentos en muestras liquidas.
֍ Hisopos o torundas: se utilizan para exudados y para la siembra primaria.

Fuente de calor
Se utiliza el mechero bunsen.

֍ Genera una zona aséptica libre de partículas de unos 10-15 cm de radio.

֍ Permite esterilizar de forma rápida los instrumentos metálicos de siembra.
֍ En la zona inferior del tubo hay un orificio que permite la entrada de aire, que al
mezclarse con el gas origina la mezcla de combustión. Se regula mediante un aro que
cierra o abre el orificio.
֍ Si se cierra, la llama arde a menor temperatura y se ve de rojizo a amarillento.
֍ Si se abre, la llama adquiere mayor temperatura y se vuelve de color azul. Alcanza una
temperatura más alta y no deja residuos sobre la superficie, pero puede llegar a ser
invisible contra un fondo uniforme, lo cual obliga a adoptar las máximas precauciones.
֍ Se deben seguir ciertas medidas de seguridad.

Se ha sustituido el mechero bunsen por esterilizadores por infrarrojos como fuente de calor.
Son microhornos tubulares.

Técnicas de siembra
Siembra por agotamiento de asa
Se realiza en placa. Se basa en descargar totalmente el inoculo cargado en un asa de siembra a
lo largo de toda la superficie del medio. Quedan varias zonas:

֍ Una zona de crecimiento masivo.

֍ Una zona de crecimiento intermedio.
֍ Una zona en la que se observan colonias aisladas

En zigzag
Se mueve el asa de siembra mediante movimientos de zigzag a lo largo de todo el medio de
cultivo.

En estrías
Es similar a la anterior

Siembra masiva en superficie

Se realiza tanto en placa como en tubo. Se usa un asa de Drigalsky, una pipeta o con un asa
calibrada y se extiende en forma de espiral.

Siembra por inundación

Se realiza sobre medios sólidos en placa. Se vierte una suspensión bacteriana sobre el medio
hasta que lo cubre totalmente. El exceso de suspensión se decanta después. Se utiliza para la
realización de antibiogramas en agar con discos.

Siembra por punción o picadura

Se realiza sobre medios solidos o semisólidos en tubo vertical. Se introduce un hilo de siembra
cargado verticalmente en el medio. Permite observar la movilidad de los microorganismos.

Esta técnica se aplica en combinación con la siembra en superficie en tubo con pico de flauta
con el hilo de siembra. Se utiliza para la detección de enterobacterias.

Siembra por dilución

Se utiliza para sembrar medios de cultivo líquidos. Se introduce en el medio y se agita
suavemente para descargarla.

Procedimiento de siembra
Se debe disponer de todo el material necesario en la zona donde se va a realizar la siembra, y
encender el mechero bunsen. Se debe verificar:

֍ Que la muestra o la preparación de la muestra es la que corresponde y esta

correctamente verificada.
֍ Que los procedimientos que vamos a aplicar son los previstos para la solicitud clínica
que corresponde.
֍ Que los medios están en las condiciones adecuadas y no están caducados. Como la
mayoría.

Procedimiento manual básico

֍ La carga del asa
֍ La siembra

Automatización de la siembra
֍ Brazos robotizados controlados por un procesador.
֍ Siembra en espiral con un dispensador esterilizable montado sobre un brazo.

3.3.3 Incubación de los medios de cultivo

Una vez efectuada la siembra se puede proceder a la incubación, que se lleva a cabo en estufas
y teniendo en cuenta que se lleva a cabo en estufas y teniendo en cuenta una serie de
parámetros físicos.

Estufas de cultivo
Está diseñada para la incubación de microorganismos. Para conseguir un óptimo
funcionamiento de las estufas de cultivos se debe tener en cuenta:

֍ Para un reparto uniforme del calor es necesario dejar un mínimo de 25mm entre las
placas y las paredes de la estufa, y nunca depositarlas directamente en el suelo de la
estufa.
 ֍ Dejar 25mm entre los materiales que se introduzcan en la estufa. Las placas de Petri
no deben de apilarse de más de 6 en 6.
֍ Cuanto más material se introduzca en la estufa más tiempo tardara en llegar a la
temperatura deseada.

Los parámetros de incubación

֍ La temperatura dependiendo de las características de las bacterias que se quieren
aislar.
֍ La atmósfera
 Bacterias aerobias
 Bacterias anaerobias
 Bacterias microaerófilas
֍ La humedad: 70-80%
֍ La luz: prefieren oscuridad
֍ El tiempo: 18-24h

3.4 Finalidad del cultivo bacteriológico

3.4.1 Aislamiento
El aislamiento es la separación de un determinado microorganismo del resto de
microorganismos que lo acompañan.

Para conseguir el aislamiento de realizan siembras por agotamiento en los medios adecuados.
Se puede aislar a una bacteria de una mezcla polimicrobiana o aislar varias bacterias a partir de
una muestra.

3.4.2 Identificación
Se debe realizar un análisis macroscópico de:

֍ Morfología de las bacterias, incluyendo la coloración

֍ Cambio de coloración del medio de cultivo, que se puede deber al viraje de un
indicador.
֍ Precipitación de algún componente
֍ Producción de gas

En algunos casos es necesario añadir reactivos para la obtención de resultados.

3.4.3 Recuento
Los recuentos viables se basan en contar el número de colonias que crecen en un medio solido
en placa.

El resultado se expresa en UFC por volumen de muestra.

Los cultivos deben cumplir unos requisitos:

֍ La densidad de colonias en la placa debe permitir el recuento. Si están amontonadas o

sobrepuestas no se puede realizar.
֍ Se debe sembrar una cantidad conocida de muestra.
Métodos de recuento
Método directo de recuento
Consiste en sembrar un volumen conocido de la muestra, 1ml, en un medio solido en placa
mediante la siembra masiva en superficie. Tras la incubación, se hace un recuento manual.

Método de las diluciones decimales seriadas

Se realizan diluciones seriadas de la muestra y se siembran en placas, y tras la incubación, se
selecciona la placa con la densidad más adecuada.

núm. colonias × dilución

Núm. UFC/ml=
volumen siembra (µm)
Métodos del filtro de membrana
Consiste en hacer pasar un volumen prefijado de la muestra a través de una membrana de
nailon que retiene las bacterias (0,22 µm). Se coloca el filtro sobre un medio de cultivo sólido,
se incuba y se cuentan las colonias que han crecido.

núm. colonias × dilución

Núm. UFC/ml=
volumen siembra (ml)

Métodos de recuento estimativo

Estándares de turbidez de McFarland
Son patrones de turbidez basados en suspensiones de sulfato de bario. La escala consta de 11
patrones, que tienen una turbidez comparable a la de una suspensión bacteriana de una
densidad determinada.

Espectrofotometría
Se basa en la turbidez de una suspensión bacteriana. Se mide la absorbancia a 600 o 625 nm.
Es un método más objetivo que los estándares de McFarland, y la estimación del recuento es
más exacta.

Automatización del recuento

Análisis de imagen
Requiere el cultivo previo de la muestra mediante una técnica adecuada para el recuento. Un
software analiza la imagen y efectúa el recuento de las colonias y lo traduce a UFC/ml.

Recuento celular automatizado

Se puede hacer por dos métodos, por diferencia de conductividad entre las bacterias y el fluido
en el que están suspendidas y por citometría de flujo, que utiliza un fluorocromo especifico de
ácidos nucleicos.

Recuento de orinas
El recuento de orinas permite diagnosticar una infección y determinar su severidad. El rango
de recuento de viables, desde 0 hasta 10 7 UFC/ml, y es suficiente con valores estimativos. El
método de siembra es una siembra masiva en placa con agotamiento de asa, con asas
calibradas de 5 µl.