UNIDAD DIDÁCTICA 3: PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS Y

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN, AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

Objetivos:

• Clasificar los medios de cultivo más utilizados en microbiología clínica.

• Conocer los componentes de un medio de cultivo.
• Seleccionar el material y preparar los medios de cultivo sólidos y líquidos.
• Realizar la esterilización y la comprobación de la esterilidad de los medios de cultivo, así como
su correcto almacenamiento.
• Aplicar las diferentes técnicas de aislamiento, siembra, incubación y recuento de m.o.

Introducción al cultivo de m.o: crecimiento microbiano.

De forma general, para la determinación de la presencia de un m.o en una muestra es necesario su

cultivo. Es decir, se debe proporcionar al m.o las condiciones ideales para su multiplicación
(crecimiento). De esta forma se obtiene un número suficiente de células que permite:

- Determinar la presencia/ausencia de m.o y hacer un recuento de los mismos.

- Identificar m.o.
- Determinar la sensibilidad a antibióticos.

El elemento principal para el cultivo de m.o es la placa Petri, las cuales se rellenan con el medio de
cultivo de tipo sólido, se siembran y se incuban.

También se pueden realizar cultivos en medio líquido. Para ello, se pueden emplear diversos
materiales de laboratorio como tubos de ensayo o matraces. Para cada m.o es necesario la adecuación
del medio de cultivo y de las condiciones de incubación.

Diseño y tipos de medios de cultivo.

En la actualidad, existe una gran variedad de medios de cultivo disponibles en el mercado, por lo que
su diseño no suele ser habitual. Esta función suele darse en mayor medida en los laboratorios de
investigación. Un medio de cultivo se diseña en base al m.o que se quiere cultivar y de la
determinación que se vaya a llevar a cabo.

En términos generales, todos los medios de cultivo están compuestos por:

• Una base mineral en la que se encuentran los nutrientes inorgánicos que pueda necesitar el
m.o:
o Macronutrientes: suelen ir incluidos en la composición (K, Mg, Ca o Fe).
o Micronutrientes: aparecen como elementos traza (Mn, Co, Cu o Zn).
• Una suplementación de la base mineral con:
o Fuente de C.
o Fuente de N.
o Fuente de S.
 o Factores de crecimiento.

Además, en los medios de cultivo se utilizan una serie de constituyentes para su diseño:

• Un agente gelificante para dar solidez al medio:

o Agar: polisacárido que licúa cuando alcanza los 100 ºC y se gelifica sobre los 40 ºC. Es
el gelificante más empleado debido a su propiedad de histéresis térmica. Gelifica
cuando baja a los 40ºC aproximadamente. Pero una vez ha gelificado, debe alcanzar
una Tª de entre 75-80ºC para volver a un estado líquido (permite incubaciones).
o Gelatina: tiene naturaleza proteica (colágeno de animales).

• Extractos: de origen animal, vegetal o fúngico. Se emplean como fuente de alimento rica en
carbohidratos, proteínas, vitaminas y minerales.
• Carbohidratos: se utilizan como fuente principal de C y energía.
• Sangre, suero o plasma: aportan hormonas y factores de crecimiento. Se emplean para la
detección de reacciones hemolíticas (sangre) y de la actividad coagulasa (plasma).
• Peptonas: son el producto de la digestión de las proteínas. Ricas en aa y péptidos (fuente de
N).
• Amortiguadores e indicadores de pH: permiten el crecimiento óptimo del m.o de interés y
detectar variaciones de pH en el medio.
• Bilis y sales biliares: se utilizan para inhibir el crecimiento de Gram +.
• Agentes reductores: se emplean para el crecimiento de m.o microaerófilos o anaerobios
(cisteína).
• Colorantes: se emplean como inhibidores de crecimiento de un determinado grupo de m.o.

Los medios de cultivo se pueden clasificar en función de:

- Su consistencia física:
o Caldos o medios líquidos.
o Medios sólidos: misma composición que los líquidos, y se añade un gelificante.
o Medios semisólidos: consistencia intermedia. Se emplean para observar movilidad.

- Su composición química:
o Medios definidos/sintéticos: se conoce exactamente la composición y proporción.
o Medios complejos: no se conocen con exactitud la proporción de cada nutriente, ya
que es una mezcla que generalmente posee extractos.
o Medios enriquecidos: medios complejos que se les añaden nutrientes
complementarios como sangre o albúmina.

- Su función:
o Medios generales: permiten el crecimiento de una gran variedad de m.o.
o Medios diferenciales: contienen reactivos que permiten distinguir unos m.o de otros
en función de su crecimiento en dicho medio (Agar McConkey).
 o Medios selectivos: permiten el crecimiento de un determinado grupo de m.o pero no
de otros (Agar Manitol Salado).
o Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado grupo de
m.o, pero sin inhibir completamente el crecimiento de otros. Poseen algún
componente que favorece el crecimiento del m.o deseado, aumentando su
proporción.

Medios de cultivo según consistencia relacionados con el recipiente de uso y su utilidad.

• Agar McConkey: medio selectivo y diferencial para enterobacterias. Contiene sales biliares y
cristal violeta, que inhibe el crecimiento de Gram + y muchas Gram – no entéricas. Permite
diferenciar las bacterias que fermentan lactosa (único carbohidrato en el medio) de las que
no, ya que también contiene un indicador de pH. Las bacterias fermentadoras acidifican el
medio y forman colonias de diferentes tonos de rojo. Las que no fermentan aparecen como
colonias transparentes.

Medio de cultivo McConkey con inoculaciones de diferentes enterobacterias.

• Brain Heart infusión: medio complejo utilizado para el crecimiento de numerosos m.o
(bacterias y levaduras).
• Agar Mueller-Hinton: medio utilizado para determinar la sensibilidad a antibióticos.

• Agar Hektoen entérico: medio utilizado para el aislamiento de enterobacterias, especialmente

Salmonella y Shigella spp. Contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de las bacterias
Gram + y Gram – no entéricas. Posee azul de bromotinol y fucsina ácida como indicadores de
la fermentación y citrato de hierro como un indicador de la formación de dihidróxido de azufre
a partir del tiosulfato.

Cultivo de Salmonella thyphimurium en medio Hektoen entérico.

• Agar Levine: medio utilizado para el aislamiento de enterobacterias (inhibe crecimiento de

Gram +). Se utiliza para la diferenciación de Scherichia coli (E.coli) que, en este medio,
adquiere un color verde-negruzco metálico.

Cultivo de E.coli en agar Levine.

 • Agar CLED: medio de cultivo utilizado para el crecimiento de m.o patógenos en muestras de
orina. Este medio impide el desarrollo indebido de Proteus spp.

Cultivo de E.coli en agar CLED.

• Agar Luria-Bertani: medio de enriquecimiento ampliamente utilizado para el cultivo

bacteriano, especialmente de E.coli.

• Bilis esculina: es un medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento y diferenciación

de enterococos. Posee bilis (inhibición Gram +) y esculina, que es hidrolizada por las enzimas
producidas por los enterococos y reacciona con el citrato férrico del medio, produciendo un
compuesto negro/marrón oscuro.

Cultivo de enterococos en medio Bilis esculina (izq.) y comprobación de hidrolisis de esculina en

medio líquido (der.).

• Manitol salado (MSA): medio selectivo utilizado para la detección y aislamiento de

estafilococos y diferenciación entre especies de coagulasa + y coagulasa -. Posee una alta
concentración de sal que evita el crecimiento de la mayoría de las bacterias de otros géneros,
y un indicador de pH (rojo fenol). Los estafilococos coagulasa + pueden utilizar el manitol,
variando así el pH del medio (las colonias cambian a un color amarillo). Los estafilococos
coagulasa – permanecen de color rojo.
 Cultivo de estafilococos coagulasa + (amarillo) y coagulasa - (rojo) en medio MSA.

• Agar DNasa: es un agar con alto contenido en ADN. Debido a la relación entre la presencia de
coagulasa y DNasa, este medio es selectivo de m.o coagulasa + como Staphylococcus aureus
(S.aureus). S. aureus rompe las cadenas de DNA por la acción de la enzima DNasa. Tras haber
cultivado la placa esta se inunda con ácido clorhídrico, provocando que el ADN todavía intacto
se vuelva opaco, por lo que se aprecia una zona transparente alrededor de las colonias DNasa
+ (S.aureus).

Cultivo de estafilococos DNasa + como S.aureus (der.) y DNasa - (izq.).

• Agar Granada: agar diferencial y selectivo para estreptococos del grupo B. Es muy utilizado
para aislar Streptococcus agalactiae procedente de muestras clínicas. En este medio S.
agalactiae crece de color amarillo-naranja.
 Cultivo de estreptococos del grupo B (S. Agalactiae) en medio agar Granada.

• Agar Columbia: es un medio de uso general. Se puede suministrar con un 5% de sangre de

carnero que permite detectar reacciones de hemólisis (rotura de los glóbulos rojos), además
de suministrar factores de crecimiento de algunas especies patógenas, por lo que se suele
utilizar como medio de siembra inicial (no para muestras de orina). También se le puede
añadir antibióticos para hacerlo un medio selectivo para estreptococos, estafilococos y
enterococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias.

Crecimiento de S. agalactiae y E. fecalis en agar Columbia CNA con 5% de sangre de carnero (región
roja) y agar Granada (región blanco-amarillenta). Las colonias de S. agalactiae se aprecian amarillas a
la derecha y rojas en la izquierda, mientras que las colonias de E. fecalis se observan blancas en
ambas partes.

• Agar Digalsky: medio selectivo para el aislamiento de enterobacterias y otras Gram -.

 Cultivo de enterobacterias en agar Digalsky.

• Agar Saboraud: medio diferencial específico para el crecimiento de hongos y levaduras, ya que
posee una elevada concentración de glucosa que no es tolerable por la mayoría de bacterias.
Se suele combinar con antibióticos.

• Medio Diamond modificado: cultivo de Trichomonas vaginalis (parasitología).

• Medio Novy-McNeal-Nicolle: cultivo de lesihmanias (parasitología).

• Agares cromogénicos: medios de cultivo específicos que permiten la identificación de

diferentes especies debido a su creciiento en diferentes colores en una misma placa.

Esterilización y almacenamiento de medios de cultivo.

Tras su preparación, los medios de cultivo deben ser esterilizados para evitar que sean contaminados
durante su manipulación. El autoclave es el método de esterilización más común para los medios de
cultivo dentro del laboratorio (121ºC/15min/1 atm).

En ocasiones, es necesario añadir al medio alguna sustancia termolábil. Entonces, se prepara el medio
sin dicha sustancia, la cual se esteriliza por filtración y se añade al medio cuando este está atemperado.
Tanto para la preparación como para la esterilización se debe consultar las
indicaciones/recomendaciones del fabricante.
Los medios de cultivo preparados se almacenan en frío (2 – 8 ºC), y los medios de cultivo deshidratados
(sin preparar) se almacenan a Tª ambiente. No obstante, el almacenamiento puede variar según las
indicaciones del fabricante (siempre leer la etiqueta de cada medio de cultivo antes de preparar). En
el caso de los medios preparados, se deben respetar las fechas de caducidad indicadas por el
fabricante. Se debe descartar un medio ya preparado si supera dicha fecha o si existe alguna sospecha
de que pueda estar contaminado.

Para mejorar la conservación de los medios preparados, se recomienda guardar las placas invertidas
y dentro de bolsas de plástico. Aquellos medios que posean sustancias fotosensibles deben ser
almacenados en condiciones de oscuridad. Una de las principales labores del técnico de laboratorio
es asegurarse de la existencia de stock de todo el material necesario para el trabajo rutinario de
laboratorio. Es imprescindible llevar un control de las cantidades de medio de cultivo disponibles, y
un registro de la recepción y consumo de los materiales.

Siembra de microorganismos.

Tras la preparación del medio, se procede a la siembra para su posterior incubación. El tipo de siembra
se determina en base a las características del m.o y el tipo de prueba que se está realizando.

En los medios líquidos y semisólidos, la siembra se realiza directamente inoculando un trozo de la

muestra biológica o recogiendo una porción del cultivo puro, para después inocularlo en el medio
(asas de siembra). En medios sólidos se pueden utilizar diferentes técnicas en función del objetivo
final y de la muestra de las que se parta. Las técnicas más comunes son el agotamiento por estría, por
extensión en superficie y en profundidad.

Los métodos de siembra se caracterizarán con más detalle en las prácticas relativas a la UD.3.

Condiciones de incubación.

La incubación consiste en generar y mantener unas condiciones ambientales que permitan el

crecimiento óptimo del m.o, y comprende desde la siembra del m.o y el análisis de los resultados. Las
condiciones de incubación dependen del tipo de m.o y de la determinación que se quiere llevar a cabo.
Como normal general, se deben tener en cuenta:

• Tª: cada m.o posee una Tª óptima de crecimiento (dividirse a mayor velocidad). La mayoría de
m.o patógenos pertenecen al grupo de los mesófilos, y su Tª óptima de crecimiento suele ser
cercana a la del organismo del cuerpo humano (37ºC).
• Agitación: en algunas ocasiones será necesario realizar el cultivo en agitación.
• Humedad: se necesita un ambiente húmedo controlado para el correcto crecimiento de m.o.
Las estufas de incubación poseen una doble puerta de cristal para evitar la pérdida de
humedad y Tª.
• Luz: la mayoría de las bacterias crecen mejor en ausencia de luz.
• Presencia/ausencia de oxígeno: en función de si los m.o de interés utilizan oxígeno o no para
sobrevivir. Según los requerimientos de oxígeno, los m.o crecen de la siguiente forma:
 Tubo 1: m.o aerobios. Tubo 2: m.o anaerobios. Tubo 3: m.o anaerobios facultativos. Tubo 4: m.o
microaerófilos. Tubo 5: m.o aerotolerantes.

Para realizar el cultivo en condiciones anaeróbicas, existen recipientes o jarras. Estos consisten en una
cubeta que cierra de manera hermética con un soporte en el que introducir las placas. Después, se
introduce en la jarra un sobre que provoca la eliminación de oxígeno empleando agua o un catalizador
para que comience la reacción química responsable de desplazar el oxígeno. Además, se introduce un
papel indicador que vira de color en función de si queda o no oxígeno en el interior.

También existen cámaras de anaerobiosis para trabajar en su interior, y que contienen una mezcla de
gases que modifican la atmósfera de trabajo, y medios con componentes que absorben el oxígeno y
medios reductores que ayudan a mantener las concentraciones de oxígeno bajas.

Los principales equipos empleados en el laboratorio microbiológico son las estufas o cámaras de
incubación y los incubadores con agitación.

Aislamiento y recuento de microorganismos.

Una colonia bacteriana es un conjunto de células bacterianas que pueden observarse

macroscópicamente y que proceden de una misma célula. Esa primera célula se establece en un lugar
y se divide sucesivamente formando un grupo observable a simple vista. A esa célula se le conoce
como Unidad Formadora de Colonias (UFC) y es la unidad de medida empleada para la cuantificación
de m.o.

El aislamiento consiste a la obtención de colonias de un m.o que se encuentran perfectamente

separadas de otras colonias, de forma que todas las bacterias presentes en dicha colonia proceden de
una misma bacteria inicial (mismo género y subgénero).
Una de las técnicas de aislamiento más empleadas es la siembra por estría. Sin embargo, este método
se realiza generalmente tras la siembra de una muestra líquida. Al recibir una muestra biológica, no
se conoce la cantidad de m.o presentes, por lo que se deben preparar diferentes diluciones de la
muestra inicial y realizar varias siembras para obtener colonias aisladas.

La determinación del número de m.o o recuento, presentes en un volumen de muestra determinado,

nos permite determinar el volumen de muestra si se conoce la dilución utilizada. Para realizar el
recuento existen numerosas técnicas y equipos, como contadores de colonias, espectrometría,
contadores electrónicos automatizados o el uso de cámaras de recuento como la cámara de Neubauer
(portaobjetos especial, con una cavidad de un volumen conocido, que permite el fácil recuento de m.o
empleando el microscopio óptico.

Estos conceptos se detallan más ampliamente en las prácticas relativas a la UD.3.

Contador de colonias.

Cámara de Neubauer (izq.) y recuento de colonias empleando una cámara de Neubauer al

microscopio óptico (der.).