GUÍA DE LABORATORIO

Fundamentos de Microbiología y

Bacteriología (QYF-314)

Química y Farmacia

Profesor: TM. Marcelo Guerrero A.

2023
 LABORATORIO 4
CULTIVO DE BACTERIAS

I.- INTRODUCCION
Para cultivar microorganismos en el laboratorio es necesario suministrarles todos
los nutrientes que precisan. Los requisitos nutricionales varían según el tipo de
microorganismo y es necesario conocerlos para el cultivo con éxito de
microorganismos específicos. Las necesidades nutricionales básicas pueden
suministrarse en el laboratorio mediante el uso de medios de cultivo artificiales.
Un medio de cultivo es una solución nutritiva que se utiliza para cultivar
microorganismos. Como los cultivos de laboratorio son necesarios para el estudio
detallado de los microorganismos, la correcta elección y preparación de los medios
es de gran importancia para que los cultivos prosperen.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales: 1) medios
no selectivos enriquecidos, 2) medios selectivos, 3) medios diferenciales y 4)
medios especializados (Tabla 1). A continuación, se resumen algunos ejemplos de
estos medios.

MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS ENRIQUECIDOS

Estos medios están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de
los microorganismos que no necesitan condiciones exigentes. Los siguientes
medios son algunos de los más empleados:
Agar sangre. Los laboratorios clínicos utilizan muchos tipos de medios de cultivo
agar sangre. Los medios contienen dos componentes fundamentales: un medio
basal (ej., soja tripticasa, infusión de cerebro-corazón, base de Brucelid) y sangre
(de oveja, caballo, conejo). Se pueden añadir varios suplementos más para ampliar
el número de microorganismos que se pueden cultivar en estos medios de cultivo.
Agar chocolate. Se trata de un agar modificado. Cuando se añade sangre o
hemoglobina al medio de base calentado, se vuelve marrón (de ahí su nombre).
Este medio permite el crecimiento de la mayor parte de las bacterias, incluidas
algunas que no crecen en el agar sangre (Haemophilus, algunas cepas de Neisseria
patógenas).
Agar Mueller-Hinton. Se trata de un medio recomendado para estudios
convencionales de sensibilidad bacteriana. Su composición está bien definida e
incluye extractos de ternera y caseína, sales, cationes divalentes y almidón soluble
necesario para que los resultados sean reproducibles.
Caldo tioglicolato. Se trata de uno de los medios de cultivo de enriquecimiento
empleados para recuperar cantidades pequeñas de bacterias aerobias y
anaerobias. Se emplean diversos compuestos, pero la mayor parte incluyen
caseína, glucosa, extracto de levadura, cisteína y tioglicolato sódico. El suplemento
de hemina y vitamina K mejora la recuperación de las bacteriasanaerobias.
Agar dextrosa de Sabouraud. Se trata de un medio de cultivo enriquecido que
contiene caseína y tejido animal digeridos suplementados con glucosa que se
emplea para aislar hongos. Se han desarrollado diversas fórmulas, aunque la mayor
parte de los micólogos utilizan la que tiene baja concentración de glucosa y un pH
neutro. Al reducir el pH y añadir antibióticos para inhibir las bacterias, este medio de
cultivo puede ser selectivo de hongos.

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

Los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar microorganismos
específicos que pueden estar presentes en una mezcla de microorganismos (ej., un
patógeno entérico en las heces). Los medios se enriquecen con inhibidores que
suprimen el crecimiento de los microorganismos no deseados. Estos medios se
hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la
identificación del microorganismo en una mezcla (ej., añadiendo lactosa y un
indicador de pH para identificar los microorganismos que fermentan la lactosa). Los
siguientes son ejemplos de medios de cultivos selectivos y diferenciales:
Agar MacConkey. Se trata de un agar selectivo para las bacterias gramnegativas
y diferencial para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa. Este medio
incluye peptonas digeridas, sales biliares, lactosa, rojo neutro y cristal violeta. Las
sales biliares y el cristal violeta inhiben las bacterias grampositivas. Las bacterias
que fermentan la lactosa producen ácidos, que precipitan las sales biliares y
provocan un color rojo del indicador rojo neutro.
Agar sal manitol. Se trata de un medio de cultivo selectivo empleado para el
aislamiento de estafilococos. El medio incluye extractos de caseína y tejidos
animales digeridos, extracto de ternera, manitol, sales y rojo fenol. Los estafilococos
pueden crecer en presencia de una elevada concentración de sal y
S. aureus puede fermentar el manitol, lo que produce colonias de color amarillo en
este agar.
Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). Se trata de un agar selectivo utilizado en
la detección de Salmonella y Shigella en cultivos entéricos. El medio corresponde
a un extracto de levaduras con xilosa, lisina, lactosa, sacarosa, desoxicolato sódico,
tiosulfato sódico, citrato amónico férrico y rojo fenol. El desoxicolato sódico inhibe el
crecimiento de la mayor parte de las bacterias no patógenas. Las bacterias que
crecen típicamente fermentan la lactosa, la sacarosa o la xilosa y dan lugar a
colonias amarillas. Shigella no fermenta estos carbohidratos, de forma que sus
colonias serán rojas. Salmonella fermenta la xilosa, pero también descarboxila la
lisina y genera el producto alcalino diamino cadaverina. Este producto neutraliza los
productos de fermentación de los ácidos, de manera que las colonias serán rojas.
Dado que la mayor parte de Salmonella produce ácido sulfhídrico a partir del
tiosulfato sódico, las colonias se vuelven negras en presencia de citrato amónico
férrico, lo que permite diferenciar Salmonella de Shigella.
Medio de Lowenstein-Jensen (LJ). Este medio, utilizado para aislar micobacterias,
contiene glicerol, harina de patata, sales y huevos coagulados (para solidificar el
medio). Se añade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas.
Agar Middlebrook. Este medio de cultivo se emplea también para aislar
micobacterias. Contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de las
micobacterias (sales, vitaminas, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa)
y verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas. A diferencia del medio
LJ, se solidifica con agar.
CHROM agar. Se trata de un agar selectivo diferencial utilizado para aislar e
identificar algunas especies distintas de la levadura Candida. Este medio contiene
cloranfenicol para inhibir las bacterias y una mezcla de sustratos cromogénicos
especiales. Las distintas especies de Candida cuentan con enzimas que permiten
emplear uno o más de los sustratos liberando el compuesto coloreado y generando
colonias de colores. Por ejemplo, Candida albicans genera colonias verdes, Candida
tropicalis genera colonias moradas y Candida krusei las genera rosadas.
Agar con inhibidor de hongos filamentosos. Este medio de cultivo es un
compuesto selectivo enriquecido que se emplea para el aislamiento de hongos
patógenos distintos de los dermatofitos. Se añade cloranfenicol para suprimir el
crecimiento de las bacterias contaminantes.
La mayoría de los patógenos se pueden cultivar fácilmente en el laboratorio. Para
este propósito, una herramienta importante es el cultivo de enriquecimiento, el uso
de medios de cultivo y condiciones de incubación selectivos, que permiten aislar
diferentes microorganismos a partir de diferentes muestras. La mayoría de los
microorganismos de importancia clínica pueden cultivarse, aislarse e identificarse
con medios de crecimiento especializados. Las muestras clínicas son inoculadas en
medios generales, como agar sangre y agar chocolate que permiten el crecimiento
de muchos patógenos aerobios o aerobios facultativos. El agar chocolate, llamado
así por su color marrón oscuro, contiene sangre lisada por calor. La sangre
calentada interacciona con los otros componentes del medio, absorbiendo
compuestos que son tóxicos para microorganismos exigentes, como
N. gonorrhoeae. También se pueden utilizar medios de cultivo más específicos.
El siguiente paso en la identificación es el uso de medios enriquecidos para el cultivo
de patógenos seleccionados. Los medios enriquecidos contienen factores de
crecimiento específicos que mejoran el crecimiento de patógenos concretos.Por
ejemplo, el medio de Thayer-Martin favorece el crecimiento de bacterias como
N. gonorrhoeae. Otro tipo son los medios selectivos, que permiten el crecimiento de
algunos organismos e inhiben el crecimiento de otros debido a la presencia de
agentes inhibidores. Finalmente, los medios diferenciales son los que permiten
identificar organismos por su crecimiento, color y aspecto en el medio. El agar
eosina-azul de metileno (EMB, del inglés eosin-methylene blue) es un medio
selectivo que inhibe el crecimiento de organismos grampositivos mientras que
permite el de los gramnegativos. Además, es un medio diferencial porque distingue
bacterias fermentadoras de lactosa, como Escherichia coli, de otras bacterias
gramnegativas que no fermentan la lactosa, como Pseudomonas aeruginosa

MÉTODOS PARA EL ESTUDIO MICROBIOLÓGICO

Esterilización: el éxito de los estudios microbiológicos se fundamenta en lograr
un cultivo puro de las diferentes cepas bacterianas y/o fúngicas, por lo que la
esterilización y desinfección juegan un rol esencial.
Siembra: la siembra, es la acción o procedimiento mediante el cual se realiza la
transferencia del material biológico sobre un medio de cultivo, pudiendo ser éste
sólido o líquido, el cual aporta todos los nutrientes requeridos para el desarrollo y
crecimiento de los microorganismos.
Aislamiento: siempre que se inicia el estudio de una muestra, nos encontramos
con una o más colonias bacterianas, lo que dificulta el estudio del microorganismo
de interés, por lo que se hace necesario aislar la cepa bacteriana que nos interesa
para lograr un cultivo puro. Para lo cual se emplean las siguientes formas de
siembra.
Siembra de bacterias
Para realizar la siembra de cepas bacterianas debe considerar los siguientes
procedimientos:

ESTERILIZACIÓN DE ASAS DE SIEMBRA

Siempre que necesite emplear este dispositivo para realizar la siembra, debe
esterilizarlo en la llama del mechero. Para lo cual debe colocar el asa casi
perpendicular a la llama del mechero (Figura 1) hasta que esta tome color rojo vivo.
También es necesario pasar por la llama la parte metálica pero de forma más rápida.
Este procedimiento debe realizarse antes y después de realizar una siembra del
microorganismo.
 Figura 1. Esterilización del asa en la llama.

TUBOS DE ENSAYO
Siempre que utilice el tubo de ensayo, debe proceder a flamear (Figura 2) la boquilla
del tubo, retirando la tapa de éste cerca del mechero, manteniéndola en la mano con
los dedos meñique y anular y pasando la boquilla del tubo por la llama, de igual
forma debemos proceder al concluir, flamear y cerrar el tubo, para evitar la
contaminación de la muestra con otros microorganismos del ambiente.

Figura 2. Modo de flamear el tubo de ensayo, pasando la parte superior del tubo directamente por
la llama del mechero.

PLACAS DE PETRI
Para realizar la siembra en placa, se procede a flamear el asa, como se indicó
anteriormente. Se deja enfriar mientras se abre la placa con microorganismos,
siempre cerca del mechero. Se toma la muestra con el asa y con cuidado se abre la
otra placa (cerca del mechero) evitando exponerla totalmente. Se desplaza el asa
sobre la superficie del medio de cultivo, evitando romperlo (Figura 3).
Figura 3. Método para siembra en placa. Se esteriliza el asa y se toma una colonia de la placa. La
tapa de la placa se debe abrir solo lo necesario para realizar la siembra de las bacterias.

TIPOS DE SIEMBRA EN PLACAS DE PETRI (Figura 4).

a) Siembra en estrías (zigzag).
b) Estrías con movimientos de lateralidad.
c) Estrías en diferentes sectores de la placa.

Figura 4. Tipos de siembra en placas

Durante el trabajo de laboratorio, el estudiante dispondrá de diferentes muestras

bacterianas desconocidas, cultivadas en medio sólido, con ellas, realizará siembras
en medios de cultivo, diferenciales, enriquecidos, selectivos, entre otros, disponibles
tanto en placas de Petri como en tubos de ensayo. Con lo anterior, el estudiante
deberá reconocer de diferentes medios y observar cómo responde la cepa problema
cultivada en cada uno de ellos.

II.- OBJETIVOS
1.- Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de
microorganismos.
2.- Conocer los diferentes tipos de medios de cultivos y su utilización.
3.- Desarrollar las habilidades y conocimientos necesarios para el cultivo de
bacterias en diferentes medios de cultivos, siembra y manipulación de los
microorganismos en el laboratorio, cuidando la esterilidad.
III.- MATERIALES
- Asas de platino
- Placas Petri con diferentes medios de cultivo
- Tubos de agar inclinado
- Placas Petri con cultivos bacterianos
- Mecheros
- Alcohol 70%
- Gradillas para tubos de ensayo

IV.- METODOS
TÉCNICAS DE SIEMBRA
Para realizar la siembra se debe tener en consideración cada uno de los
procedimientos antes mencionados, recordando que se debe prestar mucha
atención a lo que se realiza, ya que una mala manipulación puede contaminar las
muestras.

ACTIVIDAD 1.- SIEMBRA EN PLACAS DE PETRI

Se entregará a cada grupo de trabajo tubos de ensayo con diferentes medios de
cultivo dispuestos como agar extendido, placas de Petri con diferentes medios de
cultivo. A los cuales se sembrará un inoculo de la muestra problema (placa de Petri
con cultivo bacteriano), para ello deberán trabajar siempre cerca del mechero y
realizar la siguiente actividad:

1.- Rotular la parte inferior de la placa de Petri: MO, Fecha, Nombre del
estudiante.
2.- Flamear el asa para su esterilización.
3.- Destapar la placa de Petri con el cultivo bacteriano.
4.- Enfriar el asa, tocando un borde del agar con el asa y comprobando que no
derrita el agar.
5.- Elegir una colonia desde la placa y tomarla con el asa, procurando que quede
una película en ésta (no la retire completamente).
6.- Tape la placa de Petri con colonias y destape la placa que contiene el medio de
cultivo.
7.- Sembrar el inoculo realizando movimientos en zigzag sobre la superficie del
medio de cultivo, evitando romper el agar.
8.- Tapar la placa.
9.- Flamear el asa.
10.- Incubar la placa a 37°C.