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MANUAL DE PRCTICA DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL ING.

AMBIENTAL
Docente: Mg. Magda Rubi Rodriguez Yupanqui



PRCTICA N4

MEDIOS DE CULTIVOS: CLASIFICACIN Y
PREPARACIN


I. OBJETIVOS

Discriminar los tipos de medio de cultivo en microbiologa.

Preparar medios de cultivo y conocer su utilidad.

Conocer la composicin de los medios de cultivo.

II. MATERIALES

01 Balanza
04 Esptulas
1 lt. Agua destilada
Agua peptonada
Agar nutritivo
Mac Conkey
Agar cerebro corazn
01 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
01 Probeta de 100 o 250 mL
01 Varilla de vidrio
01 Gradilla
01 Pipeta estriles de 10 mL
01 Pipetas estriles de 1.0 mL
06 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
10 Hisopos estriles
04 Mechero de alcohol
04 Piseta
01Plumones indelebles
Autoclave
Horno
Cocina elctrica
Pinzas para matraz

III. FUNDAMENTO

Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con
material y medios de cultivo estriles. En Microbiologa la esterilizacin se define como el
proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de
resistencia) de un objeto, medio o superficie y su aplicacin garantiza la ausencia de
microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados.

Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias orgnicas e
inorgnicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el
desarrollo de los microorganismos. La composicin de los medios de cultivo vara en
funcin de: a) grupo microbiano que se pretende estudiar, b) complejidad qumica, c)
estado fsico, y d) aplicacin.
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Algunos microorganismos necesitan de ciertas condiciones para poder crecer en los medios de
cultivo, entre ellos destacan:

Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene
determinada por el rendimiento de un producto determinado, adems de los requerimientos
nutricionales del microorganismo.
pH: el ph puede seleccionar el tipo de microorganismo que debiera crecer en el medio de
cultivo.
Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el
O2 y CO2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O2 libre
clasificndose en 4 grupos:
Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre.
Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre.
Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia
de O2 libre.
Micro-aerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de
O2 libre.
Suministro de luz: Los organismos fotosintticos debern ser expuestos a una fuente de
iluminacin, la cual no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que
suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor.
Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y
la velocidad con que se efectan, las cuales estn influidas por la temperatura, por lo cual
la temperatura puede, en parte, determinar el crecimiento de los microorganismos en
estudio. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento
clasificndose en:

Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima
es alrededor de los 15 C.
Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C.
Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C.
Presin osmtica: generalmente se trabaja en condiciones de isotona (300 miliosmoles),
aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotnicas e
hipertnicas.
Esterilidad: el medio de cultivo tiene que estar en completa esterilidad, con esto evitamos
el desplazamiento del microorganismo que deseamos estudiar por un agente extrao.
Proteccin: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminacin microbiana
ambiental.
3.1 CARACTERIZACIN DE LOS TIPOS DE MEDIOS:
ESTADO:
1. Medios slidos: Su proporcin de agar es siempre por encima del 15% con respecto a la
solucin total.
2. Medios semislidos: Son medios intermedios entre los medios lquidos y slidos, su
proporcin de agar suele ser suele ser inferior al 5%, pero siempre suele presentar cierta
cantidad que le proporcione una consistencia semislida.
3. Medios lquidos o caldos: No contiene agar y su composicin (adems de agua) suele
contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y a veces segn las
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caractersticas de medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminocidos, entre
otros.

3.2 CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Medios sintticos o qumicamente definidos: Llevan fuentes de carbono, nitrgeno,
sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementos como estimuladores de
crecimiento pero siempre a concentraciones conocidas.

2. Medios complejos o de composicin indefinida: Estos medios llevan ingredientes como
extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen
nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni
cuantitativa de estos nutrientes.

3. Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente hetertrofos exigentes). Tales como: adicin de sangre, suero o extractos
de tejidos de animales y plantas.

4. Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de
un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el
aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO2
como fuente de carbono es selectivo para auttrofos, adicionando cristal violeta se inhibe
el crecimiento de los Gram Positivos (G+), utilizando maltosa como nica fuente de
carbono slo crecern los que usen maltosa.

5. Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de
microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en
dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemoltico de no hemolticos; McConkey
diferencia lactosa (+) de lactosa (-), TSI, LIA.

6. Medios de transporte: un medio de cultivo que es capaz de mantener viva una muestra o
cepa de microorganismos por un periodo prolongado, manteniendo a los microorganismos
vivos y sobre todo sin alterar su concentracin. Ejemplo: caldo de Tioglicolato de
anaerobios estrictos, Venkat-Ramakrishnan (VR) medio para el V. cholerae, medio de
Carry Blair para el transporte de muestras fecales.

3.3 MEDIO DE CULTIVO DE USO COMN
Agar Nutritivo: Medio para fines generales que promueve el crecimiento de la mayora de
los microorganismos.
Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y enumeracin de levaduras y moho a partir de
alimentos y otros materiales. Los hidratos de carbono y la infusin de papa favorecen el
crecimiento de levaduras y hongos, en tanto que por el bajo rango de pH, la flora
acompaante se reduce significativamente.
Agar Salmonella-Shigella: Medio para el aislamiento de Salmonella sp. y de Shigella sp.
Agar Sabouraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de
hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de levaduras.
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Caldo Nutritivo: Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que
constituyen la fuente de carbono y nitrgeno necesarias para el adecuado desarrollo
bacteriano. Puede ser utilizado adems, como pre-enriquecimiento en la bsqueda de
Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar clulas daadas, diluir
metabolitos txicos y sustancias inhibitorias.
Agar McConkey: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de
fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la
familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las peptonas,
aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por
fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje
del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin
de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias
incoloras.
Agar Levine: Medio para el aislamiento y la diferenciacin de los Escherichia coli y
enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para la
identificacin rpida de Candida albicans.
Agar Chapman: Medio para la deteccin de estafilococos patgenos en muestras de
alimentos y otros materiales mediante la tcnica de filtracin por membrana.

Cuadro N1Crecimiento de microorganismos y su relacin con el medios de cultivo


Microorganismos

Agar
nutriente
Agar
Mac
Conkey

Agar
Levine

Agar
Chapman
Agar
Papa
dextrosa

Agar
Sabouraud

Agar
Sangre

Caldo
nutritivo
Staphylococcus
aureus

Si

No

No

Si

No

No

Si

Si
Escherichia Coli Si Si Si No No No Si Si


IV. PROCEDIMIENTO

Desinfectar la mesa, delimitar el rea de trabajo y encender el mechero para crear una
zona asptica.

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

A. Medio de cultivo lquido
1. Leer cuidadosamente la etiqueta o indicaciones de preparacin del medio de cultivo
deshidratado.
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar aproximadamente 100 mL de Caldo nutritivo.
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operacin debe ser rpida para
evitar que la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Disolver el medio en 50 mL de agua destilada en un matraz de 250 mL, y una vez disuelto
completar el volumen a la cantidad indicada.
5. Colocar 10 mL de caldo en 5 tubos de 13 x100mm.
6. Esterilizar este material en autoclave a temperatura de 121C y 15 libras de presin
durante 20 minutos.
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7. Antes de abrir el autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presin durante
20 minutos.
8. Esquematizar los resultados.



Esquema de la preparacin para el Medio de Cultivo Liquido

Paso 1:






Paso 2:

X g de medio deshidratado
+
50 mL agua destilada

Disolver

Agregar los 50 mL agua destilada

Disolver






Paso 3: Los clculos y Resultados:


















B. Medio de cultivo semislido


1. Con los 50 mL restantes del trabajo anterior, calcular la cantidad necesaria de agar-agar
para obtener un medio semislido (2 g agar / 1 L medio)*.
2. Tapar el matraz y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar repetidamente.
3. Una vez fundido el medio de cultivo semislido, colocar 10 mL en los 5 tubos de 13 x 100
mm.

Esquema de la preparacin para el Medio de Cultivo Semislido



Paso 1:

50 mL agua destilada
+
X g de medio deshidratado

Disolver
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Paso 2:









Paso 3: Presentar los clculos y resultados:
Enfriar a temperatura ambiente



















*NOTA: si el medio de cultivo est deshidratado, hacer los clculos y disolver con calentamiento.


A. Medio de cultivo slido


1. Leer cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo deshidratado.
2. Pesar la cantidad necesaria para preparar 100 mL de medio de cultivo slido deshidratado.
3. Tapar el matraz y calentar hasta disolucin total, para ello agitar repetidamente y evitar que el
medio de cultivo hierva y no se derrame.
4. Distribuir el medio de cultivo en el siguiente material:
2 tubos de 13x100 mm con 5 mL
2 placas de Petri (15 a 20 mL)
5. Tapar cada uno de los tubos con algodn, rotular y esterilizar en autoclave a 121C y 15 lbs.
de presin durante 20 minutos.

NOTA 1. No pipetear el agar fundido pues se tapar la pipeta. Para ello medir el volumen
con agua y marcar los tubos, posteriormente agregar el medio hasta dicha marca.
NOTA 2. Un medio de cultivo slido (agar) se puede preparar a partir del medio de cultivo
lquido (caldo), agregando a ste la cantidad necesaria de agar-agar (15 a 20 g agar/ 1 L
medio) para el volumen de medio de deseado.
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:

Esquema de la preparacin para el Medio de Cultivo Slidos



Paso 1






Paso 2:

X g de medio deshidratado
+
100 mL agua destilada

Disolver

Agregar los 50 mL agua destilada

Disolver











Paso 3: Presentar los clculos y resultados:
























PRECAUCIONES GENERALES
Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el fondo del matraz y que
se queme. Asimismo evitar que hierva para evitar su derrame.
Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de verter los
medios de cultivo en ellos.
Los cestos o las latas metlicas deben estar debidamente forradas con papel kraft o de
estraza.
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El material donde se prepar el medio de cultivo slido (agar-agar) debe ser lavado con
agua y jabn inmediatamente despus de su uso. As evitars que el agar-agar se pegue
al vidrio.
Antes de mandar a incubar el material con los medios de cultivo, verifica la manera cmo
hay que prepararlo para que sean recibidos (Reglamento del rea de Esterilizacin e
Incubacin).

INVESTIGAR

1. Cul es el punto crtico para preparar un medio de cultivo slido?
2. De que est compuesto el agar-agar y qu caractersticas presenta?
3. Qu otros medios de cultivo existen y qu finalidad cada uno tiene? Presentarlo en un
cuadro de comparativo.
4. Qu importancia tiene esterilizar la zona de trabajo ensayo? Fundamentar.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

TORTORA.FUNKE.CASE. Introduccin a la microbiologa. 9 ed., Editorial Medico
Panamericana. 2007. Colombia. ISBN:978-950-06-0740-7

MADIGAN, M., Martinko, J. y J. PARKER. Biologa de los microorganismos.
Editorial Pearson educacin, S. A. 2006. ISBN: 0-13-066271-2.

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