Unidad 2 Bacteriología: técnicas de

tinción y observación de bacterias

2.1 Taxonomía bacteriana
La taxonomía bacteriana clasifica las bacterias teniendo en cuenta sus características
fenotípicas y genotípicas.

2.1.1 Clasificación de las bacterias

Las bacterias se clasifican en rangos taxonómicos, atendiendo a criterios morfológicos,
genéticos, metabólicos y ecológicos.

Se clasifican en dominio, filo, clase, orden, familia, género y especie.

Una cepa bacteriana es una población de bacterias que descienden de una única célula o de un
aislamiento en cultivo axénico (cultivo puro).

Una especie bacteriana está integrada por una colección de cepas que comparten muchas
características morfológicas, metabólicas, genéticas y ecológicas entre sí, y diferentes de las
que presentan otras especies del mismo género.

2.1.2 Nomenclatura de las bacterias

2.2 Morfología de las bacterias
2.2.1 Morfología microscópica
Morfología individual
֍ Cocos: bacterias esféricas o prácticamente esféricas
֍ Bacilos: bacterias alargadas, con forma de bastón de bordes romos o fusiformes con
extremos afilados.
֍ Bacilococos: bacterias con formas ovaladas cortas.
֍ Vibrios: bacterias alargadas ligeramente curvadas en forma de coma.
֍ Espirilos: bacterias alargadas en forma de espiral con una o más vueltas de hélice

Agrupaciones
Agrupamientos de cocos
֍ Diplococos: dos cocos unidos. Género Neisseria.
֍ Tétradas: cuatro cocos Unidos formando un cuadrado. Género Micrococcus.
֍ Cadenas: múltiples cocos Unidos formando una cadena. Género Streptococcus.
֍ Sarcinas: cocos agrupados formando paquetes cúbicos tridimensionales.
Staphylococcus.
֍ Racimos: cocos agrupados en masas de forma irregular. Género Staphylococcus.
Agrupamientos de bacilos
֍ Cadenas en caña de bambú: múltiples bacilos Unidos por los extremos. Género
Bacilius.
֍ Empalizadas: múltiples bacilos colocados lateralmente. Tras la división se produce un
giro de 180º. Género Corynebacterium.
֍ Letras chinas: múltiples bacilos colocados lateralmente, con un giro inferior a 180º.
Género Corynebacterium.
֍ Ramificados: múltiples bacilos formando cadenas ramificadas. Género Nocardia.

2.2.2 Morfología macroscópica

La colonia bacteriana se define como un conjunto o agrupación de bacterias crecida sobre un
medio de cultivo sólido, procedentes de una unidad formadora de colonias (UFC).

La unidad formadora de colonias (UFC) se define como una bacteria o agrupamiento de

bacterias inoculadas sobre un medio de cultivo sólido son capaces de producir una colonia.

PARÁMETRO TIPOS
TAMAÑO 0,5 mm hasta varios mm
FORMA (PLANO TRANSVERSAL) Puntiforme
Circular
Fusiforme
Irregular
Rizoide
Filamentosa
FORMA (PLANO SAGITAL) Plana
Convexa
Planoconvexa
Umbilicada
Papilar
BORDE Liso
Ondulado
Lobulado
Rugoso
SUPERFICIE Lisa
Estriada
Amorfa
Granular
Brillante
Mate
COLORACIÓN Variada
CONSISTENCIA Dura
Mucosa
Cremosa
Pegajosa

2.3 Estructura bacteriana

Estructuralmente podemos diferenciar entre:
 ֍ Componentes comunes, presentes en todas las bacterias: pared, membrana
citoplasmática, material genético y ribosomas.
֍ Componentes específicos, presentes solamente en algunos tipos de bacterias: cápsula,
flagelos, fimbrias, pili, endosporas, etc.

2.3.1 La pared bacteriana

La pared bacteriana es una estructura rígida presente en todas las bacterias, excepto en los
microplasmas.

La pared protege a la bacteria de fenómenos osmóticos y funciona como una barrera contra
sustancias tóxicas químicas y biológicas. Posee poros que facilitan el intercambio de moléculas.

El componente principal de la pared bacteriana es el peptidoglucano o mureína.

Dependiendo del resto de los componentes y de cómo se estructuren todos ellos, se pueden
distinguir 3 tipos principales de pared bacteriana.

Pared de bacterias grampositivas

Las bacterias grampositivas tienen una pared gruesa y compacta constituida por hasta 40
capas de peptidoglicano. Los tetrapéptidos ligados a los residuos de NAM se conectan entre sí
estabilizando la estructura. La pared contiene también ácidos teicoicos, que sirven para dotar
de carga negativa a la pared bacteriana y para anclar la pared a la membrana plasmática.

Pared de bacterias gramnegativas

Las bacterias gran negativas tienen una pared más fina y rugosa, constituida por una capa de
peptidoglucano y sin ácidos teicoicos. Los lipopolisacáridos dotan a la pared de carga negativa.
La membrana externa contiene unas proteínas denominadas porinas que forman canales para
el transporte pasivo de iones y moléculas pequeñas.

Pared de bacterias ácido-alcohol resistentes

El peptidoglucano se une a lípidos y ceras, por lo que la pared tiene un aspecto céreo y un
carácter hidrófobo, además de elevada resistencia a la desecación y a agentes químicos
bacterianos.

2.3.2 La membrana citoplasmática

La membrana citoplasmática de las bacterias estructura según el modelo de mosaico fluido,
como una bicapa fosfolipídica en la que se integran proteínas. La membrana bacteriana tiene
una proporción mayor de proteínas que las eucariotas. Las funciones de la membrana
citoplasmática son:

֍ Barrera osmótica y selectiva: es impermeable a moléculas cargadas y a iones, y

permeable a compuestos orgánicos y moléculas neutras.
֍ Biosíntesis de componentes
֍ Metabolismo energético
֍ Recepción de señales
֍ Sistemas de transporte
֍ Anclaje del cromosoma bacteriano
 ֍ Anclaje de los flagelos

2.3.3 El genoma bacteriano

Cromosoma bacteriano
Es una gran molécula circular de ADN bicatenario. No tiene núcleo, Por lo que se encuentra en
el seno del citoplasma formando una estructura denominada nucleoide. Contiene toda la
información genética necesaria para el ciclo vital de la bacteria.

Plásmidos
Son moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de pocos pares de bases. No
están asociados a proteínas y su replicación es independiente de la del cromosoma bacteriano.
Confieren ventajas adaptativas a las bacterias que lo posean. Su concentración es variable. Se
pueden distinguir 3 tipos principales de plásmidos:

֍ Plásmidos de resistencia a antibióticos

֍ Plásmidos de virulencia
֍ Plásmidos degradativos

Algunos plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra de la misma especie mediante
conjugación.

2.3.4 Ribosomas
Son las estructuras de donde se sintetizan las proteínas. Se encuentran libres en el citoplasma.
El componente principal es ARN ribosómico asociado a proteínas. Consta de 2 subunidades:

֍ Subunidad grande
֍ Subunidad pequeña

2.3.5 Otros componentes estructurales

Cápsula
Es una capa externa que recubre la pared, que les sirve de protección frente a la desecación y
a la fagocitosis, y les facilita la colonización, ya que les permite adherirse a las superficies.
Suelen formar colonias de aspecto mucoso y liso.

Flagelos
Son apéndices filamentosos extracelulares responsables del movimiento en los medios líquidos
de la mayor parte de las bacterias móviles. Según su número y disposición pueden ser:

֍ Monotricos: flagelo único en disposición polar.

֍ Lofotricos: dos o más flagelos en disposición polar en el mismo extremo.
֍ Anfitricos: varios flagelos en disposición polar en ambos extremos.
֍ Peritricos: múltiples flagelos distribuidos por toda la superficie bacteriana.

Los flagelos constan de 3 partes:

֍ Filamento
 ֍ Cuerpo
֍ Codo

Fimbrias y pili
Las fimbrias son estructuras filamentosas proteicas más cortas y finas que los flagelos. Se
distribuyen por toda la superficie de la bacteria, y su función es de adhesión.

Los pili o pelos sexuales son un poco más gruesos pero mucho menos numerosos. Están
codificados por plásmidos y toman parte en el intercambio genético entre bacterias, la
conjugación bacteriana.

Endosporas
Son formas de resistencia que se producen en el interior de algunas bacterias grampositivas en
condiciones medioambientales desfavorables. Son células en reposo, con su metabolismo
reducido al mínimo y muy resistentes.

Están formadas por varias cubiertas concéntricas impermeables que encierran un protoplasto.
La forma de la espora y su posición en el interior de sus células madre son características de
cada especie y sirven de criterios taxonómicos para identificación.

Cuando las condiciones medioambientales son favorables la espora germina y se transforma

en una célula vegetativa viable.

2.4 Técnicas de observación bacteriana con microscopía óptica

La observación microscópica de las bacterias puede realizarse en fresco pero la información
obtenida es escasa. Esto es debido a que la mayoría de las bacterias son incoloras, por lo que
no presentan gran contraste con el medio que las rodea. Por ello, Para su observación
microscópica se requieren tinciones que aumenten se contraste o coloreen determinadas
estructuras.

2.4.1 Observación en fresco

Permite visualizar microorganismos vivos sin el uso de colorantes. Sirve para observar si existe
movimiento de las bacterias.

Se coloca una gota del medio de cultivo crecido entre porta y cubre y se visualiza al
microscopio óptico. También se pueden utilizar colorantes vitales que no pueden entran en las
bacterias y ofrecen imágenes microscópicas y en negativo de las bacterias y de sus estructuras
externas. La más utilizada es la tinta china.

2.4.2 Preparaciones fijadas

Se obtienen a partir de cultivos crecidos en medio líquido, de colonia sobre el medio de cultivo
sólido o de la muestra biológica. Son las más utilizadas en la práctica clínica. Un ejemplo son
los frotis.

2.5 Tinciones cromogénicas

2.5.1 Colorantes
Son compuestos químicos orgánicos, generalmente sales. Los más utilizados son las anilinas.

֍ Ácido o aniónico: tiene carga negativa, por lo que se unen a compuestos con carga
positiva, como el citoplasma. Algunos ejemplos son rosa de bengala, eosina y fucsina
ácida.
֍ Básicos o catiónicos: tienen carga positiva, por lo que se unen a estructuras de carga
negativa, como el ADN. Algunos ejemplos son cristal violeta, azul de metileno, fucsina
básica, verde malaquita y safranina.
֍ Neutros o anfóteros: de colorantes ácidos y básicos, que tiñen todo tipo de
estructuras. Un ejemplo es eosinato de azul de metileno.

En algunas tinciones se utilizan mordientes. Estos no son colorantes, pero favorecen La Unión
del colorante a una estructura concreta.

2.5.2 Tinciones simples

Se basan en el uso de un solo colorante, y se puede usar un mordiente. Son tinciones
inespecíficas. Algunos ejemplos son la tinción azul de metileno y la tinción con nigrosina.

2.5.3 Tinciones diferenciales

Utilizan dos colorantes que contrastan en intensidad o color, por lo que permite diferenciar
bacterias con igual morfología por sus propiedades tintoriales. Algunos ejemplos son la tinción
de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.

Tinción de Gram
Se realiza a temperatura ambiente. Es un colorante catiónico. Las bacterias grampositivas se
tiñen de violeta o azul y las bacterias gramnegativas se tiñen de rosa.
Tinción de Ziehl-Neelsen
Distingue bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). Se realiza en caliente. Es un colorante
básico. Las Ziehl negativas se tiñen de azul o violeta y las Ziehl positivas de color rosa.

2.4.5 Tinciones estructurales

Están diseñadas para teñir estructuras concretas, presentes sólo en algunas especies.

֍ Tinción de cápsulas:
 Tinción con nigrosina o tinta china
 Tinción de Hiss
֍ Tinción de flagelos:
 Tinción de Leifson
 Tinción de Rhodes
֍ Tinción de esporas:
 Tinción de Wirtz-Conklin

2.6 Tinciones fluorescentes

Tienen mayor sensibilidad, requieren un microscopio de fluorescencia y puede ser de dos
tipos:

֍ Directas: utilizan colorantes capaces de emitir luz visible de una determinada longitud
de onda al ser excitados con luz UV. Algunos ejemplos son el naranja de acridina y el
auramina-rodamina.
֍ Indirectas: se basan en el uso de anticuerpos marcados con fluorocromos. Permiten
detectar antígenos concretos.

2.6.1 Tinción de naranja de acridina

Se une inespecíficamente al ADN y ARN de bacterias y células. El ácido nucleico de cadena
doble tiene fluorescencia de color verde, y el ácido nucleico de cadena simple tiene
fluorescencia de color rojo.

2.6.2 Tinción de auramina-rodamina

Es similar a la tinción Ziehl-Neelsen. Sirve para observar bacterias BAAR, y no se necesita
calentar la muestra.

2.7 Técnicas de observación bacteriana con microscopía

electrónica
Se utiliza en investigación generalmente, y las tinciones utilizadas en microscopía electrónica
son la tinción negativa, la tinción con tetróxido de osmio y acetato de uranilo y la tinción para
microscopía de barrido. La tinción negativa se utiliza para estudiar la morfología externa de las
bacterias y es especialmente útil para visualizar estructuras como flagelos, fimbrias y pili.