INFORME DE LABORATORIO N4 Fisiomicrobiana

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA - MICROBIOLOGIA
INFORME DE LABORATORIO N°4:

DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES
Carlos Daniel Quispe Chura

cdquispec@unjbg.edu.pe
Grupo de Practicas A – Curso de Fisiología Microbiana – U.N.J.B.G
10 de Julio del 2022
INTRODUCCION
Los carbohidratos son una clase importante de componentes estructurales en las
envolturas de las células bacterianas. Los perfiles de azúcar pueden diferenciar e
identificar bacterias aisladas. Existen diferencias considerables entre los glucanos
bacterianos y de mamíferos. Es así que, a diferencia de la mayoría de los carbohidratos
eucariotas, los glucanos bacterianos a menudo se componen de unidades repetitivas con
diversas funciones que van desde el refuerzo estructural hasta la adhesión, la colonización
y el camuflaje. Por otro lado, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los
componentes vegetales, se incluyen los diferentes azúcares, almidones, celulosa,
hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azúcares como la glucosa, fructosa y
sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los
carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y
pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son
productos de desecho. A esto, su importancia ha permitido el desarrollo de varios métodos
para su determinación, como: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-
Hensen, etc. Todos estos métodos se basan en el principio que todos los azúcares con un
grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se
transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas;
dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno,
por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como
Ag+ , Hg+ , Cu2+ y Fe(CN)6 y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de
ácidos.
OBJETIVO
- Determinar la presencia de azúcares reductores en medios de cultivo
microbiano.
- Conocer el protocolo de los métodos cualitativos y cuantitativos.
- Determinar la concentración de una muestra problema de Abs = 0,154.
MARCO TEORICO
La acción reductora de los azúcares es la que se utiliza tanto en las determinaciones
cualitativas como cuantitativas. En este aspecto, una de las técnicas analíticas más
utilizadas consiste en determinar la cantidad de una sustancia disuelta midiendo la
cantidad de radiación absorbida por la misma, se conoce como Espectrofotometría.
Un azúcar reductor es cualquier azúcar que sea capaz de actuar como agente reductor. En
una solución alcalina, un azúcar reductor forma algún aldehído o cetona, lo que le permite
actuar como un agente reductor. Todos los monosacáridos son azúcares reductores, junto
con algunos disacáridos, algunos oligosacáridos y algunos polisacáridos. Las cetosas
primero deben tautomerizarse a aldosas antes de que puedan actuar como azúcares
reductores
A) Métodos cualitativos
Prueba de Benedict:
Muchos monosacáridos, como la glucosa y la fructosa, y algunos
disacáridos, son azúcares reductores porque poseen un aldehído libre (no
enlazado a los otros grupos en la molécula). La Prueba de Benedict se usa
para detectar la presencia de azúcares reductores porque el reactivo de
Benedict contiene cobre que se reduce en presencia de azúcares reductores.
Durante esta reacción el azúcar se oxida. La reacción antes mencionada se
conoce como una reacción oxidación-reducción (―REDOX‖) porque la
oxidación del azúcar sucede simultáneamente con la reacción de reducción
del cobre.
Figura 1. Reacción de la prueba de Benedict.

Tomado de: https://academic.uprm.edu/~jvelezg/labmoleculas.pdf
Lugol:
Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas
gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color
azul-violeta característico. La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo
se introduce entre las espiras de la molécula de almidón.
No es, por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de
inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la
coloración azul violeta.
B) Métodos cuantitativos:
Determinación de azúcares reductores, método del DNS
Los azucares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando
un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder
reaccionar con otros compuestos. El método de miller o DNS
(ácido dinitrosalicilico como reactivo tiene la capacidad de oxidar
los azucares reductores mostrando un comportamiento diferencial
hacia mono y disacáridos, dando resultados colorimétricos que

se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.
El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el
DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra. El método
del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinación de
azúcares reductores en muestras intensamente coloreadas como
mieles y caldos de fermentación que la contengan.
METODOLOGIA
A) MÉTODOS CUALITATIVOS
• Prueba de Benedict:
o Coloque 2-5 ml de solución de Benedict en un tubo de ensayo y llevar
a baño maría durante 2-3 minutos.
o Añadir 10 gotas de muestra problema, mezclar bien, y colocan de
nuevo a baño maría durante 5 minutos adicionales.
o Un cambio de color de azul a verde a rojo ladrillo amarillo y finalmente
(Cu2O) indica que el hidrato de carbono es un azúcar reductor.
o La velocidad de reacción es muy importante.
o Nota: La fructosa reacciona muy rápidamente, glucosa y galactosa más
lentamente. Incluso el almidón y la celulosa darán resultados débiles si
la solución se calienta ampliamente.
• Lugol:
o Se toman 2 ml de la solución de muestra
o Se colocan en un tubo de ensayo
o Se agrega dos gotas de lugol y 1 ml de agua
Figura 2: Procedimiento de prueba con Lugol

Tomado de: https://japt.es/vida/biomoleculas/luengo/glucidos.html
B) METODOS CUANTITATIVOS
Determinación de azúcares reductores, método del DNS:
• PROTOCOLO: Curva de calibrado de glucosa utilizando el método

del DNS
o Curva de calibrado de glucosa utilizando el método del DNS a
partir de una solución stock de glucosa 40 mM y por dilución con
agua destilada, preparar una gama de soluciones del azúcar de
distinta concentración. Una vez hechas las mezclas, agitar bien
para homogeneizar la solución.
o MATERIALES
- Glucosa 50 mM
- Reactivo DNS
- Tubos de ensayo
- Tubo de vidrio con tapón rosca
- Pipeta
- Cubetas para espectrofotómetro
- Espectrofotómetro
- Incubadora
o PROCEDIMIENTO
- De cada tubo se toman 0,1 ml y se transfieren a un tubo de
vidrio con tapón de rosca.
- Añadir 1 ml del reactivo DNS, incubándose
- Posteriormente la mezcla en el bloque seco a 100 ºC durante 10
minutos
- Enfriar y determinar la absorbancia a 570 nm, utilizando como
blanco la mezcla del tubo 0.
- En el caso de que la absorbancia de alguna muestra resultase
excesiva, diluir convenientemente con agua destilada.
Tabla 1. Preparación de una gama de soluciones de glucosa de

diferente concentración a partir de una solución stock 40Mm.
RESULTADOS
Benedict
Figura 3: La reacción positiva es una coloración que va desde verde, amarillo, naranja
y rojizo, el grado de coloración y el tono radica en la concentración de cobre oxidado
(Cu2O); esta reacción indica que es un azúcar reducido.
Lugol
Figura 4: En los resultados la formación de un complejo azul oscuro, debido a la

adhesión del colorante a la molécula de azúcar.
Método del DNS
Figura 5: Curva de determinación de azucares reductores a partir de una solución

stock 40Mm.
La recta establecida muestra un R² de 0.9987, un valor muy próximo al 1, significando

que el procedimiento fue correcto y que se puede interpolar datos para obtener resultados
confiables.
A) Muestra stock 60 mM, preparar una curva patrón cada 10Mm.
[ ] mM # Tubo ABS
0 0 0
10 1 0.12
20 2 0.232
30 3 0.321
40 4 0.441
50 5 0.55
CURVA PATRON
0.6
y = 0.0109x + 0.0058 0.55
0.5 R² = 0.9987
0.441
ABSORBANCIA
0.4
0.3 0.321
0.232
0.2
0.1 0.12
0 0
0 10 20 30 40 50 60
CONCENTRACIÓN
Figura 6: Curva de determinación de azucares reductores a partir de una solución

stock 50Mm.
DISCUSION
Prueba de Benedict
Cuando se añade el reactivo de Benedict al azúcar reductor, y se aplica calor, el color de
la mezcla cambia a naranja o ladrillo intenso mientras mayor sea la abundancia de
azúcares reductores. Un cambio a color verde indica la presencia de menos azúcares
reductores. Las azúcares que no reducen, como la sacarosa, no producen cambios en color
y la solución se mantiene azul. Los monosacáridos que forman anillos no son azúcares
reductores porque no tienen un grupo aldehído libre, pero pueden reducir si se

convierten en monosacáridos abiertos
DNS
En nuestra práctica se construyó una curva DNS para determinar la producción de
azúcares reductores de una bacteria amilolítica, los resultados de la curva muestran un
valor de R² = 0.998, lo que aprueba su utilización para interpolar otros datos ya que el
valor es muy próximo al 1.
En la Figura 6. La recta establecida muestra un R² de 0.9987, un valor muy próximo al 1,
significando que el procedimiento fue correcto y que se puede interpolar datos para
obtener resultados confiables. La curva nos muestra que el organismo se redujo hasta 50
mM de azúcares reductores, se observa que tienen una producción exponencial.
El reactivo DNS reacciona únicamente con azúcares reductores presentes en la muestra
mediante una reacción redox (Miller, 1959). La importancia de este método radica en su
alta sensibilidad y facilidad de obtención debido a que es una técnica espectrofotométrica
(Rivers et al. 1984).
CONCLUSIONES
Se determino la presencia de azúcares reductores en medios de cultivo microbiano
con una muestra problema con una solución stock 40Mm, además se conoció los
diferentes métodos realizados en clase (cualitativos y cuantitativos) y se determinó
que la producción de azúcares reductores sigue el patrón de la curva de
crecimiento bacteriano pues tienen una relación directamente proporcional.
REFERENCIAS
o Burgos Montañez, L. J. (2020). Cuantificación de azúcares reductores del
sustrato en residuos de piña con el método del ácido 3,5-
dinitrosalicílico. Revista De Investigación, 13(1), 57-66.
https://doi.org/10.29097/23461098.308
o https://academic.uprm.edu/~jvelezg/labmoleculas.pdf
o https://docs.google.com/presentation/d/1QRceocVkli9aewL71bXGV8O4K1Zso
9hkbfpMxKvNR6c/edit#slide=id.gf45dda2463_0_107
o https://japt.es/vida/biomoleculas/luengo/glucidos.html
o Miller, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

reducing sugar. Analitycal Chemistry, 31 (3). pp. 426-428.
https://doi.org/10.1021/ac60147a030
o Rivers, D. B., Gracheck, S. J., Woodford, L. C., y Emert, G. H. (1983).

Limitations of the DNS assay for reducing sugars from saccharified
lignocellulosics. Biotechnology and Bioengineering, 26, pp. 800-802. DOI:
10.1002/bit.260260727
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el reactivo azul de coomassie?
Es un compuesto trifenilmetano disulfonado, une proteínas formando uuuun

complejo-colorante, el colorante interacciona electrostáticamente con la proteína
mediante ácido sulfónico. Este mecanismo, puede explicarse por la existencia de
tres especies absorbentes que se generan por la pérdida sucesiva de protones. De
tal manera que, cuando el azul de Coomassie se une a la proteína, cambia a su
forma desprotonada y cambia la coloración a una azulada.
2. Indique la función del DNS para la determinación de azucares reductores
El reactivo DNS reacciona únicamente con azúcares reductores presentes en la

muestra mediante una reacción redox la importancia de este método radica en su
alta sensibilidad y facilidad de obtención El ácido 3,5-dinitrobenzoico (DNS)
reacciona con azúcares reductores y forman ácido 3- amino-5-nitrosalicílico,
tornando la disolución de amarillo (color del DNS) a un color anaranjado-rojizo.
Este producto tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 540 nm.
3. Explique con propias palabras que es un azúcar reductor.
Los azúcares reductores van a presentar un grupo hidroxilo (OH) libre su carbono
anomérico, y esto determinara si reaccionan como azucares reductores, actuando
como agente reductor.

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INFORME DE LABORATORIO N°4:

Carlos Daniel Quispe Chura

Figura 1. Reacción de la prueba de Benedict.

hacia mono y disacáridos, dando resultados colorimétricos que

Figura 2: Procedimiento de prueba con Lugol

• PROTOCOLO: Curva de calibrado de glucosa utilizando el método

Tabla 1. Preparación de una gama de soluciones de glucosa de

Figura 4: En los resultados la formación de un complejo azul oscuro, debido a la

Método del DNS

Figura 5: Curva de determinación de azucares reductores a partir de una solución

La recta establecida muestra un R² de 0.9987, un valor muy próximo al 1, significando

Figura 6: Curva de determinación de azucares reductores a partir de una solución

reductores porque no tienen un grupo aldehído libre, pero pueden reducir si se

o Miller, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of

o Rivers, D. B., Gracheck, S. J., Woodford, L. C., y Emert, G. H. (1983).

Es un compuesto trifenilmetano disulfonado, une proteínas formando uuuun

2. Indique la función del DNS para la determinación de azucares reductores

El reactivo DNS reacciona únicamente con azúcares reductores presentes en la

3. Explique con propias palabras que es un azúcar reductor.

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