Reconocimiento De Carbohidratos

Deisneth Carbonell; Yair Fernndez; Erwing Lpez; Dayana Martnez Programa de Qumica, Facultad de Ciencias Bsicas. Universidad del Atlntico Octubre 2011
Resumen. Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes que existen dentro de la naturaleza, se encuentran presentes en casi todos los seres de la naturaleza, dndole como funcin el almacenamiento de energa y la distribucin de ella entre las clulas. En la prctica de laboratorio se pudo determinar los carbohidratos por medio de reacciones especficas y diferenciar cualitativamente un polisacrido, tambin distinguir e identificar azcares reductores y no reductores. Se llev a cabo la cuantificacin de la glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa en donde posteriormente, se le realiz un anlisis espectrofotomtrico a la muestra. Palabras claves: Carbohidratos, cualificacin, cuantificacin Abstract Carbohydrates are the most abundant organic compounds that exist in nature, are present in almost all living beings in nature, giving as a function of energy storage and distribution of it between the cells. In the lab carbohydrates could be determined through specific reactions and differentiate qualitatively a polysaccharide, also distinguish and identify non-reducing and reducing sugars. Was carried out quantification of glucose by the glucose oxidase method in which subsequently underwent spectrophotometric analysis of the sample. Keywords: Carbohydrates, qualification, quantification.

Introduccin. Carbohidrato es un trmino muy general aplicable a gran nmero de materiales cuya estructura qumica y funciones biolgicas abarcan un amplio espectro. Esta designacin fue sugerida hace casi un siglo para referirse a las sustancias naturales que representan lacomposicin qumica acorde a la formula (C2H2O)n-, es decir, carbohidrato. La principal sustancia alimenticia para la mayora de los organismos son los

carbohidratos, ante todo en su forma de glucosa- azcar simple- los cuales proporcionan la mayor parte de energa y el carbono necesario para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos, lpidos y otros carbohidratos. Muchos de los carbohidratos polimricos pertenecen a una de estas categoras: Carbohidratos con funcin estructural, como la celulosa en las plantas Carbohidratos para el almacenamiento de carbono y energa, como el almidn en las plantas El glucgeno en animales y bacterias.1

La mayora de los carbohidratos naturales estn formados primordialmente por carbono, hidrogeno y oxgeno, pero hay algunos que contiene elementos diferentes a los anteriores mencionados. En particular se encuentran con frecuencia nitrgeno, fosforo, y azufre. Los carbohidratos son polioxialdehdos o polioxicetonas, compuestos que contiene un gran nmero de grupos oxhidrilos (-OH) y una funcin aldehdico o cetnico. Los mtodos para el anlisis cualitativo de los carbohidratos se fundamentan en las propiedades qumicas de estos grupos, tales como: 2 Enolizacin Mutarrotacin Oxidacin Reduccin Deshidratacin

Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. EsteCu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloracin positiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido de cobre y sta a su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloracin.3 Prueba de Seliwanoff

El reconocimiento de carbohidratos se puede analizar por las siguientes pruebas especficas:

Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una funcin cetona, que en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcinol que est contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reaccin positiva). Prueba del lugol

Prueba de Benedict

Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos es la reaccin de Benedict. Esta reaccin es especfica para azcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada.

El lugol contiene una mezcla yodo-yoduro, sirve para reconocer polisacridos, particularmente el almidn. Cuando el resultado de la prueba es positiva, la solucin toma un color azul para el almidn y rojo para el glucgeno, y cuando es negativa es de color amarillo.

Prueba de Fehling

Este reactivo, es la mezcla de dos soluciones: Solucin cristalino A: sulfato de cobre

Solucin B: tartrato de sodio y potasio (o citrato de sodio) + hidrxido de sodio (o hidrxido de potasio o carbonato de sodio).

La primera ocasiona el rompimiento de los azucares, estos fragmentos pueden oxidarse rpidamente, y la segunda solucin evita la precipitacin del hidrxido de cobre. A medida que los cobres se reducen Cu2+ por los fragmentos de azcar iones de cobre Cu+, se combinan con los iones de hidroxilos de cobre. Este ltimo en presencia de calor pierde agua para dar como resultado oxido cuproso insoluble (Cu2O).Esta cuando es positiva presenta un color marrn-rojo y cuando es negativa es de color azul.4

cido clorhdrico concentrado. cido clorhdrico 5N. 2,4 Dinitrofenilhidrazina (2,4DNPH). Nitrato de plata 5% p/v Reactivo de Benedict o Reactivo de Felhing A y B. Solucin de lugol: Yoduro potsico (KI) al 2%; Yodato potsico (KIO3) al 4%. Reactivo enzimtico de glucosa oxidasa Espectrofotmetro con celdas

Procedimiento. 1. Hidrolisis de la sacarosa: En un tubo de ensayo se adicion 3mL de solucin de sacarosa al 10%, en donde se agreg 0.5mL de HCl al 20% y se calent en bao mara por alrededor de 10minutos. Se dej enfriar la disolucin y se neutraliz con NaOH al 2%. Se dividi la disolucin en 6 partes, a las cuales se les realiz las siguientes pruebas: a. Prueba de Fehling. Se mezcl 1mL de disolucin A y 1mL de disolucin B en un tubo de ensayo, se adicion la disolucin de sacarosa invertida y se calent hasta ebullicin. Se efectu el mismo procedimiento para la sacarosa al 10%. b. Prueba de Benedict. En un tubo de ensayo se adicion 1mL de disolucin de Benedict y se agreg 3 gotas de solucin de sacarosa invertida, se calent hasta ebullicin

Materiales y reactivos 8 Tubos de ensayo de 7 mL. 3 Pipetas graduadas de 5, 1 y 0,1 mL 1 Gradilla para tubos de ensayo 1 Bao de agua con termostato. 1 Beacker de 250 mL. Glucosa al 5 %p/v. Almidn 10 %p/v. Lactosa 10 %p/v. Fructosa 10 %p/v. Sacarosa 10 %p/v. Galactosa 10 %p/v. cido sulfrico

y se dej enfriar a temperatura ambiente. Se efectu el mismo procedimiento para la sacarosa al 10%. c. Prueba de Seliwanoff. Se aadi 0,5mL de azcar en un tubo de ensayo y posteriormente, se agreg 1mL de reactivo de Seliwanoff. Se agit y se calent en un bao de agua hasta que se redujo el volumen hasta la mitad. 2. Hidrolisis del almidn a. Se dividi equitativamente 2mL de la solucin de almidn y se efecto el ensayo de Benedict y de yodoyoduro. b. El resto de la disolucin de almidn, se le agreg 3mL de HCl concentrado, seguidamente, se distribuy esta disolucin en 12 tubos de ensayo, 1mL en cada uno, y se calent en bao mara con intervalos de 5 minutos para cada dos tubos de ensayo, realizando la prueba de Benedict y yodo-yoduro. c. Prueba de yodo para almidn: se adicion 3 gotas de lugol a 0.5mL de cada disolucin de azucares. 3. Cuantificacin de glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa. a. Se prepar disoluciones de glucosa al 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312 y 0.015%

b. c. d. e.

a partir de la disolucin patrn de glucosa al 0.5% A 2mL de reactivo enzimtico se agreg 20 L de disolucin patrn. Se calent en bao mara por 10 minutos Se realiz el anlisis espectrofotomtrico a 500nm Hidrolisis cida del almidn: se agreg 1mL de HCl a 8.3mL de disolucin de almidn el cual se calent en bao mara y se extrajo alcuotas de 1mL de la disolucin en intervalos de 5 minutos en donde, posteriormente,se le adicion el reactivo enzimtico y se realiz el anlisis espectrofotomtrico. Se realiz este mismo procedimiento para el almidn.

Discusin y Resultados. Con fines cualitativos, para reconocer rpidamente la presencia de un aldehdo, o para diferenciar un aldehdo de una cetona, se efectan pruebas que permitan determinar los carbohidratos. Los azcares que dan resultados positivos con las soluciones de Tollens, BenedictoFehling se conocen como azcares reductores, y todos los carbohidratos que contienen un grupo hemiacetal dan pruebas positivas. Los carbohidratos que solo contienen grupos acetales no dan pruebas positivas con estas soluciones y se llaman azcares no reductores.

Tabla 1. Resultado de las pruebas de Fehling,Benedict, Tollens,Selliwanoff y lugol con soluciones de glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, lactosa y almidn

Muestra/Prueba Glucosa Fructosa Galactosa Sacarosa Lactosa Almidn

Fehling + + + + -

Benedict + + + + -

Tollens + + + + +

Selliwanoff + + -

Lugol +

Reaccin de Fehling Esta prueba se utiliza para el reconocimiento de azcares reductores. El poder reductor que pueden presentar los azcares proviene de su grupo carbonilo, que puede ser oxidado a grupo carboxilo con agentes oxidantes suaves. Los azcares reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el in Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo carbonilo del azcar se oxida a grupo carboxilo.

Al agregar la sacarosa invertida a la mezcla de las disoluciones A y B del reactivo de Fehling, la solucin restante adquiere un color verde, que luego del calentamiento presenta precipitacin de partculas naranjas. El mismo procedimiento, pero aplicado a la sacarosa al 10%, adquiere un color azul fuerte, que despus del calentamiento se torna mucho ms claro.

Esquema 1. Prueba de Fehling para el reconocimiento de carbohidratos.

CH2OH O Cu2+ OH OH OH OH Complejo cupro-tartrico soluble OH OH OH COOH CH2OH OH

Reaccin De Benedict Esta prueba sirve para el reconocimiento de azcares reductores. Se basa en la reduccin de Cu2+ a Cu+ en medio bsico dbil. Aunque es similar ala reaccin de Fehling, el medio bsico dbil (HNaCO3) y el estabilizante (citrato sdico) usados hacen que este test sea ms sensible y estable.

La disolucin de Benedict adquiere un color rojo-naranja con la sacarosa invertida antes de ser calentada, y de igual forma con la sacarosa al 10%. Luego del calentamiento solo se present cambio en la coloracin con la sacarosa al 10%, sta pas del color adquirido inicialmente a un tono rosa al enfriarse.

Esquema 2. Prueba de Benedictpara el reconocimiento de carbohidratos.

CH2OH O CH2OH OH

Cu2+
OH OH OH OH OH COOH

COMPLEJO CUPRO-CITRICO SOLUBLE

OH OH

Cu0

CH2OH OH CHO

OH OH OH

Prueba de Seliwanoff Esta prueba es especfica para las cetosas. Las cetosas se deshidratan ms rpidamente que las aldosas, dando furfurales. Estos se condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado rojo oscuro. Sin embargo, en la fructosa (cetohexosa)

reaccion con mayor rapidez que con otras azucares; sta es una de las razones por la cuales el reactivo de Seliwanoff se usa para diferenciar cetohexosas de aldohexosas. Esto explica porque la sacarosa da positiva a esta prueba dado que la sacarosa libera fructosa en la hidrolisis cida y dio positiva el ensayo de Seliwanoff.

Esquema 3. Prueba de Seliwanoffpara el reconocimiento de carbohidratos.

O HO HO OH HCl HO O OH 3H2O OH HIDROXIMETIL FURFURAL FRUCTOSA O H 2H2O HO O O O OH

Reaccin de Tollens En cuanto a la prueba Tollens esta dio positivas para la glucosa, fructosa, lactosa y galactosa ya que estas pruebas permiten el reconocimiento de carbohidratos reductores debido a que estos monosacridos se encuentran libres en la estructura de Fischer, y por lo tanto el grupo carbonilo acta como agente reductor, reduciendo la plata (Ag+) a plata metlica (Ag0).

Esquema 4. Reaccin de Tollens para el reconocimiento de carbohidratos.

CH2OH O OH OH OH OH Ag(NH3)2OH OH OH OH CH2OH OH COOH + Ag+

CH2OH OH OH OH OH CHO

En la segunda parte de la experiencia se realiz la hidrolisis del almidn, el cual es el polisacrido que constituye la ms importante fuente de nutricin glicdica para la humanidad. Los almidones estn constituidos

por una mezcla de dos componentes: la amilosa, que es una cadena lineal de 200 unidades de D- glucosa unida por enlaces (14) y por la amilopectina, la cual es una cadena lineal de D- glucosa unida por enlaces

tipo (14) con numerosas ramificaciones (16). Este polmero contiene unas 1000 unidades de glucosa. La prueba para la identificacin de almidn es la prueba de lugol, en donde los grupos hidroxilo que quedan hacia afuera, permite que el yodo, al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la disolucin una coloracin azul violcea intensa caracterstica que permite la identificacin positiva de trazas de almidn, se cree que este color es debido a la formacin de un complejo cuando se retiene la especie I3- en el interior del espiral del poliglucsido, (Esquema 5).6Como esta coloracin no es resultado de ninguna interaccin covalente, el calentamiento origina la desestabilizacin del helicoide y la prdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la disolucin. Con el reactivo de Benedict la solucin es de color azul lo que indica que la prueba es negativa, porque cuando se tiene un azcar reductor la coloracin es roja.5

Para comprobar la hidrolisis de almidn se realiz la prueba de yodo- yoduro y la de Benedict en donde se observ: La desaparicin del color azul caracterstico de la prueba yodoyoduro. La aparicin de D- glucosa, azcar reductor, el cual pudo ser detectado con el reactivo de Benedict.

Esquema 5. Prueba de lugol para el almidn.

Todos los polisacridos son hidrolizados en sus constituyentes monosacridos por la accin de cido diluidos. Como el almidn es un polmero de la - D- glucosa, la hidrolisis completa es de esperarse que obtenga Dglucosa como producto final. Esta hidrolisis se puede llevar a cabo en forma enzimtica, utilizando - amilasa y - amilasa o por la accin de la amilasa presente en la saliva y tambin por medios qumicos. La ebullicin con cidos hidroliza aleatoriamente los enlaces glucosdicos entre unidades de glucosa, dando polisacridos de longitud intermedia denominados dextrinas, cada vez menores hasta la obtencin de unidades de glucosa individuales.6 Al aplicarse la prueba del lugol se obtuvo los siguientes colores a los carbohidratos que se tenan en el laboratorio (Tabla 2):

Tabla 2. Coloracin de carbohidratos con la prueba de lugol.

Solucin Glucosa+ solucin de lugol Almidn + solucin de lugol Lactosa + solucin de lugol Galactosa + solucin de lugol Fructosa + solucin de lugo Sacarosa + solucin de lugol

Color Amarillo Negro- caf mbar mbar mbar mbar

La hidrolisis enzimtica del almidn se pudo determinar por medio de la saliva en donde la protena enzimtica presente es la ptialina.sta enzima ataca al azar los enlaces a (14) del interior de la cadena. As, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. La amilasa no ataca los enlaces a (16), base de las ramificaciones de la amilopectina. Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificadora. Todos los polisacridos son hidrolizados en sus constituyentes monosacridos por la accin de cidos diluidos, as la hidrolisis del almidon sucede en varias etapas; primero se obtienen las dextrinas, luego las maltosa y por ltimo la glucosa. La accin que ejerce sobre su sustrato (almidn) depende de una serie de parmetros: pH, temperatura, concentracin de enzima. Cuando se somete a cambios de pH hay un proceso de desnaturalizacin de la enzima. La prueba de yodo- yoduro permite identificar la presencia de almidn que con estereactivo da un color azul-violeta caracterstico. Cuando se tom una muestra de 1mL de cada uno delos tubos y se aadi

unas gotas de la disolucin de yodoyoduro,por lo cual si la actividad enzimtica de la amilasa no se vioafectada, catalizaria la hidrlisis del almidnpor loque la prueba del yodo dio negativa. Posteriormente, se emple el reactivo de Benedict para la hidrolisis del almidn, ya que esta prueba permite identificar a los azcares reductores, obtenidos porhidrlisis del almidn, que con esta prueba dara una coloracin rojiza (el almidn notiene poder reductor), lo cual no produjo cambios en la coloracin.
Tabla 3. Hidrolisis enzimtica del almidn.

Tubo 1y2 3y4 5y6 7y8 9 y 10

Prueba de Prueba de yodo-yoduro Benedict No hubo cambio en la coloracin Sin cambio de coloracin

Para el anlisis de la hidrolisis cida dela glucosa y el almidn se utiliz el mtodo de la glucosa- oxidasa la cual es una prueba cuantitativa para glucosa, la prueba se basa en el uso de una enzima llamada glucosa oxidasa que reconoce especficamente a una de las formas anomricas de la D-glucosa, la forma -glucopiranosa. Esta enzima, en presencia de glucosa, oxgeno y un amortiguador de pH, genera gluconolactona y perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la cual en presencia de fenol y una amina aromtica genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando el reactivo vira de incoloro a rosado, se demuestra la presencia de glucosa en la muestra. Se conoce que en la hidrolisis los polisacridos como el almidn estn compuestos de monosacridos unidos por enlaces glicosdicos. Como se mencion

anteriormente, el almidn est constituido de un solo monosacrido, la glucosa. Todos los polisacridos son hidrolizados en sus constituyentes monosacridos, por la accin de cidos diluidos, como elHCl. En el estudio espectrofotomtrico se determin los resultados para esta prctica los cuales se ajustaron a una lnea recta y se obtuvo un buen coeficiente de regresin, R2 de 0.9985. El alto coeficiente de regresin en el ajuste de la curva de calibracin permite que se pueda considerar que el coeficiente de extincin molar () es constante en el rango de concentraciones determinados en la experiencia, ste es el que indica cuan fuertemente una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda. El valor del coeficiente de extincin molar se relaciona desde la pendiente 3.0298, (Grfica 1).

Tabla 4. Relacin concentracin de glucosa y absorbancia en la cuantificacin de la glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa.

Concentracin de glucosa (p/v) 0,015 0,0312 0,0625 0,125 0,25 0,5

Absorbancia 0,062 0,075 0,186 0,33 0,757 1,508

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Grafica 1. Relacin concentracin de glucosa y absorbancia en la cuantificacin de la glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa.
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Absorbancia

y = 3.0298x - 0.0104 R = 0.9985

Concentracin de glucosa (p/v)

Se observ que la relacin tiempo absorbancia en la hidrolisis del almidn por glucosa oxidasa present un coeficiente de regresin de 0.7291 el cual no est muy prximo a 1, quiz est discrepancia se deba a errores crasos ocurridos en el momento de realizar la prctica, ya que uno de los factores que afectan la actividad enzimtica es la

temperatura y la concentracin de la enzima y a lo mejor se dej mucho tiempo en el bao mara y se produjo este sesgo (Grfica 2). Pero lo ms importante es que cumple la ley de Lambert- Beerdonde las absorbancias estn ligadas directamente proporcional a la concentracin.

Tabla5. Relacin tiempo y absorbancia en la hidrolisis cida del almidn al 0,5% enzimtico.

utilizando un reactivo

Tiempo (min) 5 10 15 20

Absorbancia 0 0,232 0,255 0,275

11

Grafica 2. Relacin tiempo y absorbancia en la hidrolisis cida del almidn al 0.5% utilizando un reactivo enzimtico. 0.35 0.3

Absorbancia

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 10 15 20 25

y = 0.017x - 0.0215 R = 0.7291

Tiempo (min)

De la ecuacin obtenida en la grafica 1 destacamos la ecuacin, de la cual podemos obtener la concentracin del almidn, tomando a como la absorbancia y a como la concentracin (p/v) de almidn, de esta despejamos, y obtenemos

Para 10 min,

Ahora
Para 15 min,

procedemos a reemplazar los datos obtenidos de absorbancia para hallar las concentraciones (p/v). Para 5 min,

Para 20 min,

12

Tabla6. Relacin tiempo absorbancia y concentracin en la hidrolisis cida del almidn al 0,5% utilizando un reactivo enzimtico.

Tiempo (min) 5 10 15 20

Absorbancia 0 0,232 0,255 0,275

Concentracin (p/v) 0.00330 0.0798 0.0874 0.094

Grafica 3. Relacin tiempo y concentracin en la hidrolisis cida del almidn al 0.5% utilizando un reactivo enzimtico

0.14 Concentracion (p/v) 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 5 10 15 Tiempo (min) 20 25

Debido al gran tamao de la molcula de almidn, es muy difcil saber con exactitud su peso molecular, los valores encontrados en la literatura es de 69000 , y dice que 1 mol de almidn tiene aproximadamente 1000 moles de glucosa. De esta manera, procedemos a convertir la concentracines de almidon que estn en (p/v) a mol; as, 13

1 mol Almidon -----------1000mol Glucosa ------- Xmol Glucosa

1 mol Almidon -----------1000mol Glucosa ------- Xmol Glucosa

Luego la Relacion Glucosa Almidn,

1 mol Almidon -----------1000mol Glucosa ------- Xmol Glucosa

Conclusiones. Los polisacridos y los disacridos se hidrolizan en medio acido para generar monosacridos como la sacarosa y el almidn La prueba de Seliwanoff es para reconocer cetosas, mientras que Fehling y Tollens para azcares reductores y la de lugoles especfica para el almidn. El anlisis cuantitativo de la hidrolisis de la glucosa y el almidn cumplen con la ley de Lambert- Beer, la cual indica la relacin directamente proporcional entre la concentracin y la absorbancia.

1 mol Almidon -----------1000mol Glucosa ------- Xmol Glucosa

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Bibliografia 1. Bohinski R. C.; Bioqumica; Editorial Pearson; Edicin 5; 1991; p 383 2. Wingrove A. S.; Caret R. L.; Qumica Orgnica; Editorial HARLA S. A.; 1984; p 1436 3. Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. FreemanAnd Company, NY. Quinta edicin, 2008. 4. Gua de laboratorio. Practica 1. Reconocimiento d carbohidratos. 2011; p 4 5. Prcticas de Bioqumica; Universidad de Navarra; 2006-2007;p28-30 6. Miller D. D;SanginesM. C.; Rev M.; Covadonga M.; Qumica de Alimentos: Manual de Laboratorio. Editado por la Universidad de Costa Rica;2003 p 7, 10

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