Instituto Politecnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biologicas

Departamento de bioquimica
Laboratorio de Bioquimica general
Precipitación, separacion y punto isoeléctrico de proteinas
Informe. Seccion:3. Grupo: 3FV1.
Alumno: Padilla Navarrete Claudia Alitzel
Santana Reyna Daniel
Introducción.
Las proteínas se encuentran solvatadas en agua debido a las interacciones entre sus grupos polares y
con las moléculas de agua. La precipitación permite eliminar selectivamente la proteína de una
muestra o reducir la interacción de una molécula pequeña con una proteína de unión en el plasma. En
la mayor parte de las proteínas la solubilidad está dada por la interacción hidrofílica de las moléculas
polares del agua y los grupos ionizados de las proteínas.

Los factores principales que afectan la solubilidad de las proteínas son: fuerza iónica, pH, temperatura
y la constante dieléctrica del disolvente. La solubilidad de una proteína a una determinada fuerza
iónica varía con las clases de iones en solución; la solubilidad de una proteína a baja fuerza iónica se
incrementa por lo general con la concentración salina, mientras que, a fuerzas iónicas elevadas se
reduce la solubilidad de las proteínas, como la mayoría de las sustancias. Los solventes orgánicos
suelen ser buenos precipitantes de proteínas porque sus bajas constantes dieléctricas reducen el poder
de solvatación de sus soluciones acuosas hacia los iones disueltos. También denominado punto
isotónico al pH que se obtiene cuando una proteína es disuelta ausente de cualquier ion.

Objetivo.
Conocer y llevar a cabo el método de salting out en las proteínas del huevo.
Observar las precipitaciones de la clara de huevo diluida conforme al diferente pH de cada
compuesto utilizado.
Comparar la precipitación gracias a los diferentes metales pesados, comparándolo con
nuestro blanco de prueba (H2O).
 Observar e identificar el punto isoeléctrico de la insulina mediante el análisis de las
propiedades conforme a los diferentes valores de pH, usando la ecuación de Henderson-
Hasselbach

Resultados
“Salting out”.
Anexo1

Método de separación. Prueba de Biuret Observaciones

Precipitado 1 Positiva Este es la pastilla, que da un
color Violeta intenso
Sobrenadante 1 Positiva Este todavía contiene proteínas
por eso al hacerle la prueba es
de color Violeta
Precipitado 2 Positiva Sale positiva después de
centrifugar con la prueba de un
color violeta
Sobrenadante 2 Negativa Dio negativa ya que el color en
la prueba de Biuret tomo un
color azul.

“Efecto del pH y Solventes”

Anexo2

Clara de Huevo con: Precipitación Observaciones

Ácido Clorhídrico (HCl) 0.1N Si precipita En comparación al regulador
de acetatos este es más turbio
Hidróxido de sodio (NaOH) No precipita No presenta ningún cambio
0.1N visible ya que es transparente
Regulador de acetatos (pH 4.7) Si precipita Es turbio y precipita un poco
0.1M mas lento que el acido
clorhídrico
Para este punto después de agregar el etanol 96°, al tener una solución acuosa de proteínas, se
favoreció la precipitación gracias a que la constante dieléctrica del agua disminuyó, así se aumentó
la interacción proteica

Metales Pesados
Anexo3

Clara de Huevo con: Precipitación Observaciones

Cloruro mercúrico 5% Si precipita La disolución se precipitó y
tomó un color “lechoso”
Nitrato de plata 2% Si precipita La disolución se ve más densa,
se tornó de un color
completamente blanco y se
aprecia un precipitado
aperlado.
Acetato de plomo 5% Si precipita La disolución se tornó de color
blanco por la presencia de
proteínas precipitadas.
Cloruro de sodio 5% No precipita El tubo se ve transparente,
todas las proteínas
solubilizaron.

Punto Isoeléctrico de la Insulina

Anexo4

Tubo Ácido acético Acetato de sodio Insulina Valor de pH Observaciones

(0.2M) (0.2M)
1 0.23 0.02 6U (0.6mL) 3.7 No se observa ningún
cambio
2 0.15 0.10 6U (0.6mL) 4.6 Esta totalmente
trasparente
3 0.05 0.20 6U (0.6mL) 5.4 Se observa la
precipitación de las
proteínas, por lo que
se dice esta
 combinación esta en
el punto isoeléctrico
4 0.01 0.24 6U (0.6mL) 6.2 Se observa muy poco
turbio, casi pasando
desapercibido
5 0.00 0.25 6U (0.6mL) 6.8 Esta trasparente

Para Determinar el valor de pH, se llevo a cabo la ecuación de Henderson-Hasselbach. Recordando

que el valor del pKa del ácido acético es de 4.76

[𝐴− ]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log
[𝐻𝐴]

[(0.2)(0.02)]
𝑝𝐻𝑇𝑢𝑏𝑜 1 = 4.76 + log = 3.7
[(0.2)(0.23)]

[(0.2)(0.1)]
𝑝𝐻𝑇𝑢𝑏𝑜 2 = 4.76 + log = 4.6
[(0.2)(0.15)]

[(0.2)(0.20)]
𝑝𝐻𝑇𝑢𝑏𝑜 3 = 4.76 + log = 5.4
[(0.2)(0.05)]

[(0.2)(0.24)]
𝑝𝐻𝑇𝑢𝑏𝑜 4 = 4.76 + log = 6.2
[(0.2)(0.01)]

Discusión
El pH es un factor importante en la solubilidad de una proteína ya que de él depende la magnitud de
la carga eléctrica neta de la molécula. Como se observó por medio de la práctica de efecto del pH y
la de punto isoeléctrico de la insulina, ya que cuando la carga de las proteínas es positiva, estas tienden
a precipitar, ya que se encuentran en medio ácido, mientras que cuando su carga neta es negativa, lo
que significa que esta en medio básico; las proteínas se solubilizan con mayor facilidad. Si tomamos
en cuenta que en el punto isoeléctrico es cuando la carga eléctrica total de la proteína es cero, podemos
asegurar que en este valor las proteínas tienen una solubilidad mínima, por lo tanto precipitan. En el
caso de la insulina el punto isoeléctrico está en un rango de 5.4 a 6.7. Sobre la adición de solventes
poco polares como el etanol, este produce precipitación cuando la concentración de solvente alcanza
ciertos valores, y en el experimento pudimos comprobar que la adición de etanol si precipitó a las
proteínas cuando el medio era ácido. Quizá para precipitar las en medio básico, la concentración de
etanol debió ser mucho mayor, Al agregar el etanol se esperaba que las proteínas se solubilizaran
menos, conforme a la teoría, lo cual fue cierto ya que, al añadir etanol a una solución acuosa de
proteínas, disminuye la constante dieléctrica del agua, así como la interacción proteína-agua, y
aumentando la interacción proteína-proteína favoreciendo así la precipitación. Sobre la experiencia
de Salting out comprobamos que los sulfatos de amonio son sales muy buenas para la separación de
proteínas, pues a concentraciones diferentes precipitan proteínas diferentes, y la ventaja de este
método es que las proteínas no se alteran y pueden naturalizarse fácilmente. Sobre la adición de sales;
son ligeras y se agrega una poca concentración, ayuda a solubilizar a las proteínas, cosa que
comprobamos al añadir NaCl.

Por otro lado, la precipitación con metales dio positivo para las sales de Hg, Ag y Pbpresencia de
iones + y – que interactúen con las moléculas de agua, se pierde la interacción proteínaagua, por lo
que precipita, sin embargo, la sal de Na solubilizó la proteína, pues se presentó el fenómeno de
“salting in”.

Conclusión.
La solubilidad que tienen las proteínas es un factor que puede ser modificado dependiendo de las
condiciones en las que se encuentra. Las técnicas examinadas permiten el aislamiento e
identificación de proteínas. Esto puede ser aprovechado para separar distintas proteínas de interés
alterando las propiedades fisicoquímicas del medio (cómo el pH) o mediante el uso de técnicas cómo
la de salting out-saltin in. De igual manera comprobamos que la precipitación de las proteínas es un
indicio de que estamos acercándonos al punto isoeléctrico

Bibliografía.
Treijón J., P. Garrido, G. Blanco. 2009. Fundamentos de Bioquímica estructural. 2°
Edición. Tébar, Madrid. ISBN 978-84-7360- 458-1 386 pp.
Zumdahl S., DeCoste D. 2012. Chemical Principles. Cengage Learning, EUA. 1200 pp.
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Edición. Tébar, Madrid. ISBN 978-84-7360- 458-1 386 pp
Blanco,A y Blanco, G (2006). “Propiedades generales de las proteínas”. De Química
Biológica, 8va edición, El ateneo, pág. 33. [LIBRO ELECTRÓNICO]
McKee T. (2005) Bioquímica General (3ra edición) Mc Graw Hill. pp-126
 Anexos.
Anexo 1

Prueba Negativa
del segundo
sobrenadante
Prueba postiva del
segundo
Separacion de la precipitado
Prueba postiva del
pastilla y el Prueba postiva
primer
delprimer
sobrenadante sobrenadante
precipitado

Anexo 2

Precipitado
con HCl Precipitado
con
Regulador

Precipitado
con Agua Y
Etanol

Precipitado al
agregar etanol
al NaOH

Anexo 3
 Precipitado con Este sirve para
ClAcetato de comparar (H2O)
plomo 5%
Precipitado con
Sin Precipitacion
Cloruro mercúrico
con Cloruro de
5%
sodio 5%

Precipitado con
Nitrato de plata 2%

Anexo 4

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 4 Tubo 5

Tubo 3

Punto
isoelectrico