Universidad Nacional de La Plata

Licenciatura en Química
Química Analítica III TP 6

Espectrofotometría de Fluorescencia
Fundamento
La fluorescencia es uno de los fenómenos luminiscentes que tienen lugar con ciertos átomos y
moléculas capaces de absorber radiación de cierta longitud de onda para, posteriormente, emitir
radiación a una longitud de onda mayor. Cuando el analito absorbe radiación experimenta una
“transición” a un estado electrónico de mayor energía o estado excitado. Desde ese estado las
moléculas vuelven a su estado fundamental y pueden hacerlo de diversas maneras. Dos de las posibles
formas de hacerlo implican emisión de fotones: fluorescencia y fosforescencia. La primera se lleva a
cabo desde un estado excitado singlete, mientras que la fosforescencia lo hace desde un estado triplete.
El resto de los procesos de desactivación son no radiativos: relajación vibracional, conversión interna,
conversión externa, cruce entre sistemas.
La fluorescencia permite realizar determinaciones analíticas con cierto grado de selectividad y
límites de detección bastante mas bajos que los métodos basados en absorción. Sus límites de
detección, dependiendo de la sustancia que se trate y la potencia de la fuente empleada, puede ir desde
algunos ppm hasta ppb y en algunos casos hasta ppt. La potencia de la emisión fluorescente es
directamente proporcional a la concentración de analito, lo cual permite que su utilización con fines
analíticos; pero también depende del tipo de analito y de factores instrumentales. La naturaleza
química del analito determina que éste tenga mayor o menor capacidad (eficiencia) para absorber
radiación de determinada longitud de onda y emitirla como radiación fluorescente. Respecto de los
factores instrumentales, para una misma eficiencia de fluorescencia, a mayor potencia de luz incidente
mayor será la potencia de fluorescencia. Por esta razón los avances tecnológicos que mejoraron los
límites de detección se basaron en mejorar las intensidades de las fuentes de luz. Las lamparas de
mercurio y tungsteno se reemplazaron por lamparas de xenón de descarga continua y actualmente se
utilizan lamparas de xenón de descarga pulsada (flash). Estas lamparas emiten luz policromática o
“blanca” y se debe utilizar un monocromador (de excitación) para que permite seleccionar la longitud
de onda incidente desperdiciando la potencia que se emite a otras longitudes de onda. En casos
especiales se están empleando fuentes de luz láser las cuales que generan radiación de alta intensidad y
monocromática (Laser Induced Fluorescence, LIF).

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Quinina
La quinina es un alcaloide derivado de la corteza del árbol de la quina (género cinchona):

Es un antipirético eficaz y se usa para reducir la fiebre en muchas enfermedades. Fue el único remedio
conocido para la malaria hasta el desarrollo, en los últimos años, de fármacos sintéticos. Se cree que la
eficacia de la quinina fue probada en Perú por los misioneros jesuitas, quienes la introdujeron en
Europa alrededor de 1640. Desde hace mas de dos siglos se utiliza disuelta en agua carbonatada,
originalmente con fines medicinales, pero su consumo persistió como ingrediente amargo de las
bebidas de agua tónica. En dichos refrescos la quinina se encuentra presente en concentraciones de
entre 25 y 80 ppm. La cantidad de quinina presente en este tipo de muestras puede cuantificarse
empleando un método de fluorescencia debido a que presenta un elevado rendimiento cuántico de
emisión. Por esta misma razón la quinina se emplea como patrón en espectroscopia de fluorescencia.
Presenta dos máximos de excitación, una en torno a los 250nm y otra alrededor de 350 nm. El máximo
de emisión es por los 450nm, independientemente de la longitud de onda a la que se excite.
Los espectrofluorímetros (o espectrofluorómetros) se componen de una fuente de alta
intensidad, normalmente de lámpara de xenón; dos monocromadores, uno para seleccionar la longitud
de onda de excitación y otra para seleccionar la de emisión; y un compartimento para la celda. La
radiación fluorescente se emite en todas direcciones, pero se detecta sobre un eje a 90ºC al haz
incidente para evitar la detección de luz dispersada proveniente de la fuente . La cubeta utilizada suele
ser de sílice o cuarzo dado que el vidrio absorbe la luz UV requerida para excitar. Además, a
diferencia de las cubetas de empleadas en espectrofotometría de absorción, éstas cuentan con cuatro
caras ópticamente transparentes.
El procedimiento para realizar una determinación cuantitativa requiere, primeramente,
determinar los máximos de excitación y emisión.

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Procedimiento
1.- Preparación de la serie de soluciones

Utilizando matraces y pipetas de doble aforo preparar como mínimo 6 soluciones de calibración que
contengan entre 0 y 1000 PPB de sulfato de quinina a partir de la solución madre disponible. Antes de
llevar a volumen con A.D. a cada una agregarle un 10% v/v de H2SO4 1M.

2.- Determinación de los espectros y máximos de excitación y emisión.

Se tomará la solución mas concentrada de la serie utilizada para establecer la recta de calibración.
Fijando una longitud de onda de emisión a 450nm, ranuras de entrada y salida de 5 nm y filtro de
atenuación al 1%, barrer el espectro de excitación. Una vez determinada la longitud de onda máxima
para el monocromador de excitación fijar la misma en ese valor y barrer el espectro de emisión para
obtener el espectro y el máximo de emisión. Seleccionando los valores óptimos de excitación y
emisión se procede a realizar la cuantificación.

3.- Preparación de la muestra

Eliminar el CO2 de una cantidad suficiente de muestra, ya sea por vacío, ultrasonido, hirviendo o
mediante burbujeo de gas inerte. Realizar una dilución 1:100 a la muestra agregando un 10%v/v de
H2SO4 1M antes de llevar a volumen con A.D..

4.- Calibración del sistema y medida

Medir la intensidad de fluorescencia de todas las soluciones utilizando las longitudes de onda
seleccionadas en el punto -3-. Trazar la recta de calibración y con la intensidad de fluorescencia de la
solución conteniendo la muestra calcular la concentración de dicha solución.

5.- Calcular la concentración en la muestra original.

A partir de la concentración de la solución conteniendo la muestra calcular la concentración de quinina

en la bebida sin diluir en mg/l.