Fluorescencia y fosforescencia

Fotoluminiscencia
La fosforescencia es el fenmeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energa y almacenarla, para emitirla posteriormente en forma de radiacin.

La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin.

Fluorescencia y fosforescencia en las regiones.

La longitud de onda para la fluorescencia ocurre entre 662 y 728 nm. La fosforescencia tiene una duracin de vida media ms prolongada que la fluorescencia, y sta asociada con la intensidad de luz absorbida.

Mecanismo de fluorescencia
Absorcin

Disipacin no radiactiva

Emisin

Diagrama de niveles de energa para las molculas fotoluminiscentes.

Proceso de desactivacin.
Relajacin vibracional. Diversos niveles vibracionales de excitacin. Conversin interna. Procesos intermoleculares. Conversin externa. Transferencia de energa. Cruce entre sistemas. Se invierte el espn de un de un electrn.

Variables que afectan el proceso de fotoluminiscencia.

Rendimiento cuntico: Molculas que emiten luminiscencia Molculas excitadas

Efectos de la temperatura. Efectos del pH. Deteccin de puntos finales.

INSTRUMENTACIN DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotmetros o espectrofotmetros

Los fluorometros son analogos a los fotometros de absorcion , en ambos se utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de los haces de exitacion y emision.

Los espectrofluorimetros son de dos tipos

 Los primeros utilizan un filtro adecuado para seleccionar la radiacin de excitacin y un monocromador de red o de prisma para obtener el espectro de fluorescencia Los verdaderos espectrofluormetros son instrumentos especializados equipados con dos monocromadores; uno de ellos permite variar la longitud de onda de excitacin y el otro permite obtener un espectro de emisin

Componentes de los fluorimetros y de los espectrofluormetros

Los componentes de los fluorometros y de los espectrofluormetros difieren solo en detalles de los que componen los fotometros y los espectrofotometros; solo es necesario considerar estas diferencias

fuentes
En la mayoria de las aplicaciones se necesitan fuentes mas intensa que las lamparas de wolframioo hidrogeno utilizadas en las medidas de absorcion

Lamparas
La lampara mas comun para los fluorometros de filtro es la lampara de arco de mercurio a baja presion equipada con una ventana de silice fundida. Esta fuente emite lineas utiles para producir la exitacion previa a la fluorescencia a 254,302,313,546,578,691 y 773 nm

Para los espectrofluorimetros, en donde se requiere una fuente de radiacion continua, normalmente se utiliza una lampara de arco de xenon de alta presion, de 75 a 450 W. estas lamparas requieren una fuente de alimentacion potente capaz de producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a30 V. el espectro de una lampara de arco de xenon es continuo desde aproximadamente 300 a 1300 nm

Laseres
La mayoria de los espectrofluorimetros comerciales utilizan lamparas como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de laser ofrecen importantes ventajas en determinados casos, por ejemplo:

 Cuando las muestras son muy pequeas como en cromatografia con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor En los sensores de control remoto , como en la deteccion fluorimetrica de radicales hidroxilo en la atmosfera o de clorofila en seres vivos acuaticos, donde la naturaleza colimada de los haces de laser es vital Cuando se requiere una radiacion de exitacion altamente monocromatica para minimizar los efectos de interferencias fluorescentes

Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorcion se han utilizado en los fluorometros para la seleccin de la longitud de onda del haz de exitacion y de la radiacion fluorescente resultante. La mayoria de los espctrofluorimetros estan equpipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red

Detectores
La seal de fluorescencia tipica es de baja intensidad, por ello,para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores mas utilizados en instrumentos de fuorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relacion seal/ruido

Cubetas y compartimentos para las cubetas

Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilindricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con silice. Se debe tener cuidado en el diseo del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiacion dispersada que llega hasta el detector

Fosforimetros
Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseos similares a los fluorometros y a los espectrofluorometros antes considerados,solo difieren en que requieren dos componentes adicionales. El primero es un dispositivo que irradia alternativamente la muestra y, despues de un retraso adecuado, mide la intensidad de fosforesencia . El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la emision fosforecente de larga vida de la emiscion fluorescente de corta vida que podrian originarse en la misma muestra

Normalmente, las medidas de fosforescencia se realizan a la temperatura del nitrogeno liquido para prevenir la degradacion de la sealde salida por desactivacion colisional

APLICACIONES Y METODOS FOTOLUMINISCENTES

METODOS

1.- METODO FLORUMETRICOS: tienen generalmente sensibilidades que son de uno o tres ordenes de magnitud superiores a los correspondientes de adsorcin.

 2.-METODOS INORGANICOS FLORUMETRICOS: los mtodos directos conllevan a al formacin de un quelato fluorescente y la medida de emisin. Un segundo grupo se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la accin amortiguadora de la sustancia que ser determinada.

 Determinacin fluorimetrica de especies orgnicas: mtodo para la determinacin de mas de 200 sustancias, incluyendo compuestos orgnicos, enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, vitaminas etc.

METODO FOSFORIMETRICOS: los mtodos fosforescentes y fluorescentes tienen a ser complementarios ya que los compuestos fluorescentes presentan una dbil fosforescencia viceversa.

 METODO FOSFORIMETRIA: se ha utilizado para determinar una gran variedad de especies orgnicas y bioqumicas que incluyen sustancias tales como cidos nucleicos, aminocidos, pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos de petrleo y pesticidas.

 Medidas de tiempo de vida: en luminiscencia estaba restringida inicialmente a sistemas fosforescentes, donde los tiempos de cada eran suficientes largos permitir una fcil medida de la intensidad emitida en funcin del tiempo.

TRATAMIENTO DE MUESTRAS en sustancias inorgnicas

a) Anlisis directo b) Formacin de quelatos fluorescentes (combinacin de un ion metlico con un ligando orgnico) c) Determinaciones indirectas.

Anlisis directo
Aunque bastantes especies inorgnicas presentas fluorescencia en estado solido pocos son los sistemas de este tipo aplicables analticamente algunos elementos pertenecientes a las tierras raras muestran una intensa emisin fluorescente a 450nm, para Tl se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl

Quelatos fluorescentes
Especie Ag+ Al3+ Al3+ Cu2+ Li+ Sn4+ Reactivo (ligando organico) Butilrodamina S Morina Rojo de alizarina R Luminocupferrn 8-hidroxiquinolena Flavonol Sensibilidad (g/mL) 0.01 0.05 0.007 0.1 0.2 0.1

Determinaciones indirectas
Especie Reactivo Sensibilidad (g/mL) 1.0 0.2 0.05

Cl F (PO4)-3

Nitrato de uranilo Almorina Almorina

TRATAMIENTO DE MUESTRAS EN SUSTANCIAS ORGNICAS

Existe una gran variedad de compuestos orgnicos que pueden determinarse por mtodos fluorimetricos en niveles inferiores a 1 ppm Determinacin de vitaminas Frmacos y drogas

Determinacin fluorimtrica de vitaminas

Vitamina A B1 (Tiamina) B2 (Riboflavina) B6 (Piridoxina) B12 (Cianocobalamina) C D2 D3 E (tocoferol) K Reactivo fluorescencia nativa +Ox. ferricianuro fluorescencia nativa + Ox KMnO4 fluorescencia nativa ac. dehidroascrbico + o-fenilendiamina + ac. tricloroactico + ac. tricloroactico fluorescencia nativa _descomposicin en luz ultravioleta______ ex 340 365 370 350 275 350 em 480 445 440 450 305 430

390 270

480 370

Otras aplicaciones
Quimica clinica Anlisis forense Frmacos y drogas Quimica agroalimentaria Contaminacion ambiental

Quimica clinica
Muchas determinaciones clinicas se realizan por este metodo por alta sensibilidad y bajo costo A) fenilalanina en orina B) estrogenos en orina C)corticosteroides D) catecolaminas E) porfirinas en orina f) nucliotidos en el ADN

Analisis forense
Por este metodo fluorimetrico podemos analizar huellas digitales

0.05 micro gr corresponde a sustancias inorganicas como NaCl otro 0.05 micro gr corresponde a sustacias organicas (aminoacios, lipidos o vitaminas) Para detectar aminoacidos se trata con ninhidrina (1) originando un producto purpura (II) no fluorescente invisible si la cantidad es muy pequea posteriormente con tratamiento de cloruro de zinc se forma un producto fluorescente

Determinacin fluorimtrica de frmacos y drogas

Sustancia Adrenalina Ac. saliclico Ampicilina Aspirina Atropina Codeina Digital Estreptomicina LSD Morfina Pentotal Quinina Condiciones ex (nm) pH 1 pH 11 hidrlisis HAcCHCl3 eosina pH 1 HCl-glicerina pH 13 pH 7 pH 1 pH 13 pH 1 295 310 346 280 365 245,285 350 366 325 285 315 350 em (nm) 335 435 422 335 556 350 465 445 365 350 530 450 Sensibilidad (g/mL) 0.1 0.1 0.05 0.01 1.0 0.1 0.1 0.1 0.002 0.1 0.1 0.002

Quimica agroalimentaria
En los antioxidantes Ejemplo: hidrimetriaroxianisol butilado Puede separarse por destilacion con arrastre en corriente de vapor y determinarla direcamente en el destilado por espectofluorimetia (ex=293nm; em=323nm)

Contaminacin ambiental
Gran parte de la aplicacin de estos metodos a contaminacion atmosferica se referiere a la determinacion de hidrocarburos aromaticos polinucleaares pueden cuantificarse productos no fluorecentes mediante una reaccion de metodos luminiscentes que origina un fluorforo en combinacin con tecnicas de separacion cromatografica