UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES ZARAGOZA

ANÁLISIS DE FÁRMACOS Y
MATERIAS PRIMAS II
Tema: FLUOROMETRÍA
Nombre: Hernández Buitrón Monserrath
Grupo: 1552

Fecha de entrega: 7 de septiembre del 2022

Fluorometría
Fundamento
Técnica espectrofotométrica que se basa en la absorción de radiación por parte del
analito a medir en una muestra y su posterior emisión. Su fundamento es la fluorescencia
que es la emisión de radiación por electrones excitados.
En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética y
debido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación.

La espectrometría de fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagnética que

analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general
luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no
necesariamente). Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o
fluorímetros.
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la
absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado
fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Una de las
características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad
inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de
la Espectroscopía de absorción. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican
mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de
sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer.
Teoría de la fluorescencia
Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría
de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En
general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de
baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de
cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales.

En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción

de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan
que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional más bajo del estado electrónico excitado.

La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado
electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a
cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos
tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de
las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con
sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de
vibración.

En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida

por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. A
esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide mediante el
registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de
onda.

La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los átomos o moléculas

son excitados por absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se
relajan posteriormente hacia el estado basal, cediendo el exceso de energía en forma de
fotones.
La fluorescencia molecular se mide excitando una muestra a una longitud de onda de
absorción, también llamada longitud de onda de excitación, y midiendo la emisión a una
longitud de onda mayor llamada longitud de onda de emisión o de fluorescencia. 
Generalmente, la emisión de fotoluminiscencia se mide en ángulo recto con relación al
haz incidente para evitar medir la radiación incidente. 
La emisión de vida corta que ocurre se llama fluorescencia, mientras que la luminiscencia
que dura más tiempo se denomina fosforescencia. 
La figura 1 muestra un diagrama parcial de niveles de energía para una especie molecular
hipotética. Se muestran tres estados de energía electrónica, E0, E1 y E2; el estado basal
E0, y los estados excitados E1 y E2. Cada uno de los estados electrónicos se muestra
como cuatro niveles vibracionales excitados. Cuando estas especies son irradiadas con
una banda de longitudes de onda 1 a 5 los cinco niveles vibracionales del primer estado
electrónico excitado, E1, son ocupados de forma momentánea. De manera similar,
cuando las moléculas se irradian con una banda más energética formada de longitudes de
onda menores, l1’ a l5’, los cinco niveles vibracionales del estado electrónico de energía
más alto E2 son ocupados brevemente.
Figura 1. Diagrama de niveles de energía que muestra algunos de los procesos que
ocurren durante a) la absorción de radiación incidente, b) la relajación no radiativa y c) la
emisión de fluorescencia por una especie molecular. La absorción típicamente ocurre en
10215 s, mientras que la relajación vibracional ocurre en 10211 a 10210 s. La conversión
interna entre los diferentes estados electrónicos también es muy rápida (10212 s),
mientras que los tiempos de vida de la fluorescencia están entre 10210 y 1025 s.

Características instrumentales

En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:

* Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz
incidente y la luz fluorescente.

Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema:

La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide

sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de
las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en
todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con
respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o
transmitida llegue al detector.

Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo el
láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un láser
sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por
lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación o el filtro. La
desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar
mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que
emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un
espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y
una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm.

En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador

transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de
monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una
rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El
monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para
permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después del
monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o filtro.

La fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de 90° en relación a la luz de

excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de
excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación
transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitirá la luz con otras longitudes de
onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal sólo transmite luz en el rango
especificado y tiene una transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un
ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una
mejor relación señal-ruido, y reduce el límite de detección a un factor de
aproximadamente 10000, si se compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la
fluorescencia también puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se
utiliza a menudo para las muestras turbias.

El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único

canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento,
mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda
simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es innecesario. Los
diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas.

El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de

excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro
de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de
excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta
absorción, y el
monocromador de emisión
escanea el espectro. Para
medir los espectros de
excitación, la longitud de
onda que pasa a través del
filtro o monocromador de
emisión se mantiene
constante y el monocromador
de excitación va escaneando.
El espectro de excitación
generalmente es idéntico al
espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la
absorción.
Factores que lo afectan

1. Rendimiento cuántico: o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente la

relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total
de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la
fluoresceina, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la
unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero.
2. Estructura: La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los
compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos. Los compuestos que
contienen estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces
muy conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los
hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la eficacia
cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación. La sustitución
en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción
máxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Además, la
sustitución afecta frecuentemente la eficiencia de la fluorescencia.
3. Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está
particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las
eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2,
respectivamente, bajo condiciones similares de medida. La influencia de la rigidez
también tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes
orgánicos cuando están formando un complejo con un ion metálico.
4. Temperatura y disolvente: La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en
muchas moléculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia
de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación
no radiante ( conversión externa ). Una disminución en la viscosidad del disolvente
también aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el mismo resultado.
5. Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o
básicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la
intensidad de emisión son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada
del compuesto. Por lo tanto, será muy frecuente en los métodos fluorimétricos el control
estricto del pH.
6. Efecto de la concentración: La potencia de la radiación fluorescente es proporcional a la
potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema.
Hay una serie de factores que pueden influir, de manera muy notable, en la intensidad de
fluorescencia de los compuestos, como es el caso de la estructura molecular, el entorno
químico, del disolvente, el pH de la disolución o la temperatura, entre otros. 
Estructura molecular: La primera condición para que una molécula pueda presentar
fluorescencia es que absorba radiación UV o VIS. En general, cuanto más radiación
absorba más intensa será su luminiscencia. Esta condición hace que los compuestos
orgánicos cíclicos saturados y los alifáticos no sean luminiscentes (ya que no son capaces
de absorber radiación de esa energía). Por otra parte, las moléculas con dobles enlaces
conjugados, especialmente las que tienen gran energía de resonancia, sí suelen ser
fluorescentes; concretamente, los hidrocarburos aromáticos, especialmente los de
estructura multicíclica rígidos y planos son los compuestos ideales. La luminiscencia de
las moléculas también está muy influenciada por los sustituyentes, especialmente, por los
heteroátomos; Los átomos pesados tienden a favorecer el cruce intersistemas,
potenciando la fosforescencia en detrimento de la fluorescencia.
Efecto de la temperatura: La fluorescencia disminuye, en la mayoría de las moléculas, al
aumentar la temperatura ya que así aumenta la frecuencia de las colisiones y, con ello, la
probabilidad de desactivación por fenómenos no radiantes. 
Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto con grupos ácidos o básicos depende,
normalmente, del pH. Tanto la λ como la intensidad de emisión son, por lo general,
diferentes para la forma ionizada y no-ionizada del compuesto. Cuanto mayor es el
número de formas resonantes mayor es la estabilidad del primer estado excitado y, como
consecuencia, más probable será observar fluorescencia. Los procedimientos analíticos
basados en la medida de fluorescencia requieren habitualmente un control minucioso del
pH, pudiendo llegar a utilizarse las moléculas fluorescentes como indicadores del punto
final en valoraciones ácido-base. 
Efecto del oxígeno disuelto: La presencia de oxígeno disuelto tiende a disminuir la
intensidad de fluorescencia de una disolución. Aunque en algunas ocasiones este efecto
pueda ser el resultado de una oxidación fotoquímica de las especies fluorescentes sin
embargo, lo más habitual es que la amortiguación de la fluorescencia (quenching) tenga
lugar como consecuencia de las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular, que
favorece el cruce intersistemas y la conversión de las moléculas excitadas al estado
triplete. 
Efecto de la concentración: La intensidad de emisión de fluorescencia (IF) es proporcional
a la intensidad de la radiación del haz absorbido por el sistema:

Siendo I0 la intensidad de radiación del haz que incide sobre la disolución, I la intensidad
después de atravesar una longitud b del medio, IF la intensidad de fluorescencia y K’ una
constante que depende de la eficacia cuántica del proceso de fluorescencia. Con el objeto
de relacionar IF con la concentración c de la especie fluorescente se considera la ley de
Beer como: 

Donde ε es la absortividad molar de las moléculas fluorescentes y Sustituyendo Ecuación

2 en Ecuación 1 se obtiene:

El término exponencial puede desarrollarse como una serie de McLaurin de tal forma que
absorbancias suficientemente bajas Ecuación 3 se puede reescribir como:

Considerando que I0 es constante, la expresión anterior puede simplificarse a:

Así, la representación gráfica de la intensidad de fluorescencia frente a la concentración

de la especie emisora debe ser lineal a bajas concentraciones.
Otros factores responsables de las desviaciones de la linealidad a elevadas
concentraciones son la autoamortiguación y la autoabsorción. El primero es el resultado
de colisiones entre las moléculas excitadas siendo dichas colisiones no radiantes (se cree
que su mecanismo puede ser similar a la conversión externa). Por su parte, la
autoabsorción tiene lugar cuando la emisión se solapa con el pico de absorción. Esto
implica una disminución de la fluorescencia porque la radiación emitida por unas
moléculas es reabsorbida por otras moléculas que también son fluorescentes.

Referencias bibliográficas
Pérez G. Espectrometría de fluorescencia [Internet]. Espectrometria.com. [citado el 7 de
septiembre de 2022]. Disponible en:
https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_fluorescencia.
Castilla PJF. 2. fluorometría [Internet]. Slideshare.net. [citado el 7 de septiembre de 2022].
Disponible en: https://es.slideshare.net/PedroJoseFragosoCastilla/2-fluorometria.
Espectroscopía de Fluorescencia de Tiempos de Vida Media (FTVM) [Internet]. Ubu.es.
[citado el 7 de septiembre de 2022]. Disponible en: https://www.ubu.es/parque-cientifico-
tecnologico/servicios-cientifico-tecnicos/espectrometria/espectroscopia-de-fluorescencia-
de-tiempos-de-vida-media-ftvm