ESPECTROFOTOMETRA

ULTRAVIOLETA VISIBLE
Curso: Fermentaciones
Industriales
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite
determinar la concentracin de un compuesto. Se basa en que las
molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin.
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el
que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por
una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

En la regin visible (400-700 nm) apreciamos el color visible de una

solucin y que corresponde a las longitudes de onda de luz que
transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario
del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorcin es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe
luz la solucin coloreada.
1. Transmitancia
La transmitancia ptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa
un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de
luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esa luz es
absorbida por el mismo, y otra fraccin de ese haz de luz atravesar
el cuerpo.

2. Absorbancia
Se refiere al haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte
de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante
atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor
ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser
transmitida por dicho cuerpo.

Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del

mismo fenmeno.
 El mtodo espectrofotomtrico se rige por dos leyes
fundamentales : Ley de Lambert y Ley de Beer.
1. LEY DE LAMBERT

Esta ley establece que cuando pasa

luz monocromtica por un medio
homogneo, la disminucin de la
intensidad del haz de luz incidente
es proporcional al espesor del
medio, lo que equivale a decir que
la intensidad de la luz transmitida
disminuye exponencialmente al
aumentar aritmticamente el espesor
del medio absorbente.
La siguiente relacin matemtica da cuenta de esta ley:
P / P0 = e kb
Po : Intensidad de la luz incidente
P : Intensidad de la luz transmitida
b : Espesor del medio absorbente
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del
soluto, de la longitud de onda de la luz incidente, del
espesor del medio absorbente y de la naturaleza del
medio.
2. Ley de Beer :

La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al

aumentar aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando
este haz pasa a travs de un medio homogneo.
La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra
a continuacin :
P / P0 = e -kc
donde :
Po : Intensidad de la luz incidente
P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentracin de la solucin
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto,
de la longitud de onda de la luz incidente, de la
concentracin de la solucin, y frecuentemente, de la
naturaleza del medio.
 Los instrumentos que miden la absorbancia o la transmitancia de una disolucin se
componen de cinco elementos bsicos:
1. Fuente estable de energa radiante.
2. Selector de longitudes de onda (para aislar una determinada regin de longitudes
de onda de la fuente)
3. Cubetas transparentes para la muestra.
4. Detector de radiaciones o transductor para convertir la energa radiante en
elctrica.
5. Dispositivo de lectura.
1. Encendido de lmparas : Lmpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340
nm), encendido instantneo. Lmpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200
nm aprox.), necesita un calentamiento previo.
2. Adaptacin del espejo a la lmpara adecuada, atendiendo al rango de
longitud de onda de trabajo (slo en los espectrofotmetros no automticos).
3. Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente.
4. Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando
Ajuste del cero, hasta que aparezca CERO en la pantalla.
5. Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que
normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando
A-T.
6. Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.
La espectrofotometra UV/Vis se utiliza habitualmente en la
determinacin cuantitativa de soluciones de iones metlicos de
transicin y compuestos orgnicos muy conjugados.

Soluciones de iones metlicos de transicin:

Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser
coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los
electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un estado
electrnico a otro. El color de las soluciones de iones metlicos se
ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos
aniones. Por ejemplo, el color de una solucin diluida de sulfato de
cobre es muy azul; agregando amonaco se intensifica el color y
cambia la longitud de onda de absorcin mxima.
Compuestos orgnicos:
Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un
alto grado de conjugacin, tambin absorben luz en las
regiones del espectro electromagntico visible o
ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones
son a menudo el agua para los compuestos solubles en
agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles.

La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la

absorcin del espectro de un compuesto orgnico. La
tirosina, por ejemplo, aumenta su mximo de absorcin
cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la
polaridad de los disolventes.
El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para
la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR). La
presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional
a la concentracin. Para resultados precisos, la respuesta del
instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un
estndar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibracin.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una

solucin es directamente proporcional a la concentracin de la
solucin. Por tanto, la espectrofotometra UV/VIS puede usarse para
determinar la concentracin de una solucin. Es necesario saber con
qu rapidez cambia la absorbancia con la concentracin. Esto puede
ser obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de
extincin molar) o, con ms exactitud, determinndolo a partir de
una curva de calibracin.
 Espectrofotometra UV/Visible.Recuperado de:
http://www.espectrometria.com/espectrometra_ultravioleta-visible
Prctica de Espectrofotometra. Recuperado de:
http://campus.usal.es/~quimfis/apoyo/Carmen/Practicas/Espectrofotome
tria.PDF
Uso del Espectrofotometro Uv/Visible. Recuperado de:
https://es.slideshare.net/juliogonzalez33046736/espectrofotometra-uv
Fundamentos de la Espectrofotometra Moderna
https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/5980-1397ES.pdf
Espectrofotometra Uv/Visible. Recuperado de:
www.ugr.es/~clinares/webexp/fundamentos/SEMINARIO%202.doc