Espectro de Absorción de Clorofila

Ramı́rez Arvı́dez Roxette

Facultad de Ciencias, UNAM
Correo: roxet@ciencias.unam.mx

28 abril 2023

Resumen
Se extrajo el pigmento de clorofila en hojas de espinaca y perejil empleando solvente tipo
etanol al 80 % y un baño marı́a. A las soluciones de clorofila se les aplicó una prueba rápida de
fluorescencia empleando una fuente de luz UV se apreció la fluorescencia en los 670nm -700 nm.
Usando un espectrofotómetro, Spectronic 21-DUV, se obtuvo el espectro de absorción para cada
planta, para ello se midió la transmitancia de las soluciones obtenidas en relación a una solución
de etanol al 80 %. Se encontró la presencia de clorofilas tipo a y tipo b en ambas muestras.
Particularmente para el perejil se hallo el pico en los 662nm ± 1nm indicando la presencia de
mayor cantidad de clorofila tipo a.

Keywords— Espectro de absorción, clorofila, espectrofotómetro, fluorescencia, Fotosistema II

Introducción
Las plantas absorben la energı́a lumı́nica a través de sus pigmentos, moléculas orgánicas que se encuentran
en la membrana de los tilacoides dentro de los cloropastos de sus células, para crear azúcares a través del
proceso de fotosı́ntesis.
Durante la fotosı́ntesis los pigmentos se encargan de absorber ciertas longitud de onda, λ, mientras que
reflejan otras. El conjunto de λ’s que absorben se conoce como espectro de absorción.
Hay cinco tipos principales de clorofila, en las plantas los más importantes son la clorofila a, clorofila b y
β-caroteno. En la Figura 1b se muestra el espectro de absorción de las primeras dos.
La estructura molecular de la clorofila se observa en la Figura 1a. Se componen de un tetrapirrol formado
por cuatro unidades de pirrol, enlazados por átomos de Ni, que rodean un átomo de ion Mg. El átomo de Mg
se conforma de dobles enlaces cuyos e− son responsables de la absorción de la radiación del espectro visible.
Además, contiene un fitol en el anillo IV que es hidrófobo. Las clorofilas tipo a y b se diferencian en función
del sustituyente R que se encuentra en el ciclo II del anillo tetrapirrólico. [1]

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 (a) (b)

Figura 1: En a) Estructura de la molécula de clorofila [4]. En b) Espectro de absorción de la

clorofila a y b. [4]

0.1. Absorción de la luz

Cuando la radiación incide en las moléculas de pigmento, estas absorberan un fotón en función de su es-
tructura molecular, aquellas con e− en compuestos aromáticos absorberan en el espectro visible y UV. La
radiación emitida después de la absorción se conoce como luminiscencia y se distingue entre fosforescencia y
fluorescencia.
Los estados excitados depende de los orbitales excitados y se agrupan en singletes y tripletes. El singlete
ocurre cuando un e− excitado en un orbital superior está apareado con un e− en el estado basal. Por otro
lado, en el triplete los e− están desapareados. Dado que el primer caso está permitido, la des-excitación
ocurrirá en un lapso de 108 s−1 ; en el segundo la transición al estado basal está prohibida por lo que las
velocidades de emisión son lentas de 103 a 10 s−1 . La fluorescencia se presenta cuando hay una excitación
tipo singlete, y la fosforescencia cuando son triplete. Para el caso de un extracto de clorofila el fenómeno que
se aprecia es el de fluorescencia. [1]
Este fenómeno ocurre en el fotosistema II (FSII). El centro de reacción de la clorofila, al que llega la energı́a,
se conoce como P680 . Recibe este nombre porque absorbe la luz con longitud de onda de 680 nm. Cuando el
fotón absorbido por la clorofila es azul o ultravioleta (altamente energético) parte de la energı́a es disipada en
forma de calor del segundo al primer estado excitado. Un paquete de energı́a con el equivalente al fotón rojo
es contenido dentro del pigmento. Al alcanzar el centro de reacción P680 el electrón excitado será absorbido
y parte de ellos se anclará a la cadena de transporte comenzando la fotosı́ntesis, otra parte serán re-emitidos
como luz produciendo un pico en el espectro de emisión en torno a los 690 y 730 nm. [3] En la Figura 2 se
muestra este proceso.

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 Figura 2: Diagrama de los caminos de des-excitación de la molécula de clorofila en el FSII [3]

0.2. Ley de Lambert-Beer

Los métodos fotométricos se basan en la ley de Lambert. Expresión que relaciona la absorbancia de luz
monocromática (λ fija) y la concentración de cromóforo 1 en la solución.

Io
A = log = ϵcl (1)
I
Donde l es la distancia que recorre la luz por la muestra, ϵ coeficiente molar de absorción por unidad de
volumen y c su concentración. Tambiéns se define I/Io como la transmitancia, con I la intensidad de la luz
transmitida e Io la incidente. [1]

Desarrollo
0.3. Extracción de clorofila
Se separaron las hojas en mejor estado de espinaca y se rebanaron en pedazos del tamaño del tubo de ensayo.
Se pesaron 0.5331 ± 0.0025 g con una báscula de precisión (SCIENTECH).
Empleando una probeta y una pipeta se diluyo 4.8 ± 0.2 ml de alcohol al 99 % con 1.2 ml de agua destilada.
Las hojas fueron sumergidas en esta solución, el tubo de ensayo se colocó a baño Marı́a usando un vaso de
precipitado. La temperatura fue monitoreada con una termopar y un multı́metro (STEREN) como se ve en
la Figura 4. Después de 20 minutos la temperatura del baño ascendı́a a los 86◦ C por lo que se retiró. Además,
se preparó otra solución de 5 ml de etanol al 80 % que se uso para diluir 0.5 ml del extracto de clorofila. Se
apartó una solución de etanol al 80 % en un vaso de precipitado.
Mientras se preparaba la solución se encendió el espectofotómetro para estabilizar la lámpara de Tungsteno
y el sensor interno, durante un tiempo aproximado de 20 minutos.
Usando una lámpara de UV se hizo la prueba rápida de fluorescencia de la solución final ya diluida.

Obtención del espectro

Para el espectofótometro (Spectronic 21-DUV) se verificó que estuviera encendida la lámpara de Tungsteno,
ajustado el espejo y midiendo en modo de transmitancia. En la figura 3 se muestra el modelo ocupado y sus
componentes.
El selector de longitud de onda se ubicó en los 400nm ± 1nm nm y de se avanzó hasta los 700nm ± 1nm, se
midió con resolución de 6 nm. Para cada λ seleccionada se midió primero la muestra de etanol, como medida
de referencia, y luego la transmitancia de la solución de clorofila final.
1
El cromóforo se refiere a la región molecular donde la diferencia de energı́a entre dos orbitales cae dentro del rango
del espectro visible.

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 Figura 3: Diagrama del espectofótometro usado. [1]

Figura 4: Montaje de extracción de clorofila. Espinaca en baño Marı́a con una solución de etanol
al 80 %. El termopar se encuentra sumergido y conectado al multı́metro.

Resultados y Análisis
En la Figura 5 se presentan pruebas visuales de la solución ante la incidencia de luz UV, la del lado derecho
corresponde a la espinaca y la izquierda al perejil. Se observó que el perejil presentaba una tonalidad rojiza
más intensa respecto a la espinaca.

0.4. Prueba de fluorescencia

Figura 5: Prueba rápida de fluorescencia

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0.5. Espectros de absorción
En la figura 6 se presenta el espectro de el perejil obtenido con las mediciones de transmitancia convertidas a
absorbancia según la relación 1 de la Introducción, donde se tomo como referencia la medición de la solución
de etanol. En este espectro de observan dos picos máximos en 664nm ± 1nm nm y 666nm ± 1nm.

Figura 6: Espectro de absorción de perejil

En la figura 7 se muestra el espectro obtenido para la espinaca. En este espectro de observa el pico en
646nm ± 1nm y 664nm ± 1nm.

Figura 7: Espectro de absorción de espinaca

Para ambas se considero una incertidumbre de 1nm para λ dado que era la variación que presentaba el espec-
trofotómetro. Para la absorbancia se utilizó la propagación de la ecuación (1) de la Introducción considerando
una incertidumbre de transmitancia de 0.1.

Discusión y Conclusión
La prueba rápida nos permitió verificar el fenómeno de fluorescencia el cual sabı́amos que se presenta en
la clorofila lo que nos indica una extracción adecuada de la misma. Hubo una diferencia en el modo de
extracción, para el caso de la espinaca la muestra se colocó a baño Marı́a desde la temperatura ambiente
y llego a los 86◦ C después de 20 min, en el caso de la espinaca la solución se ingreso al baño cuando el
multı́metro marcaba 47◦ C y se extrajo después de 16 min a una temperatura de 77◦ lo que pudo afectar la

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concentracción extraı́da en cada muestra.
Del espectro obtenido para el perejil observamos que hay mayor presencia de clorofila tipo a al tener mayor
absorbancia en los 662 nm, como la literatura sugiere. [5] Por otro lado, para la espinaca vemos dos picos
bien diferenciados, que corresponden a 646nm ± 1nm y 664nm ± 1nm que se pueden asociar a la clorofila
tipo a y b respectivamente, por lo que deducimos que tiene presencia de ambas en la misma cantidad.

Referencias
[1] Espectro de Absorción de la Clorofila, Laboratorio de Fı́sica Contemporánea II, Facultad de Ciencias,
UNAM, Abril 2023.
[2] Dyer, H., (1965). Aplicaciones de espectroscopı́a de absorción de compuestos orgánicos. Prentice-Hall
International.
[3] Red fluorescence of chlorophyll, Garcia-Pomar, ÓPTICA PURA Y APLICADA, DOI: 10.7149,
30/05/2016
[4] File:Chlorophyll ab spectra-es.svg - Wikimedia Commons. (2012, 2 agosto). https://commons.
wikimedia.org/wiki/File:Chlorophyll_ab_spectra-es.svg
[5] Extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos, Geraldo Jonathan, Autonomous University of
Baja California, 11/11/2021.