FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

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LABORATORIO MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

PRÁCTICA No. 6
CINÉTICA DE LEVADURAS

OBJETIVOS
 Realizar la producción de biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae
 Observar las diferentes fases de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante un cultivo
discontinuo
 Relacionar la producción de biomasa con el consumo de azúcares.
 Evaluar el comportamiento de la viabilidad y pH durante el cultivo de Saccharomyces cerevisiae.

1. INTRODUCCIÓN
La biomasa microbiana es una fuente de proteína suplementaria adecuada obtenida de procesos en
los que se cultivan bacterias, levaduras, hongos o algas en grandes cantidades. La biomasa de
levadura se utiliza ampliamente como suplemento de proteína humana o animal. Las cepas
comunmente utilizadas como fuente de proteína incluyen cepas de Saccharomyces cerevisiae y
Candida utilis. Los productos típicos de biomasa microbiana incluyen levadura de panadería y
extractos de levadura en los que las cepas de Saccharomyces cerevisiae son el huésped para la
producción de proteínas heterólogas, así mismo, la fase de producción de biomasa es importante para
dar paso a etapas posteriores como lo es la fermentación alcohólica.

2. CONSULTAS PRELIMINARES

1. ¿Qué aplicaciones tiene la producción de biomasa?

2. ¿Cuál es la diferencia en viabilidad y vitalidad en levaduras?
3. Durante un proceso de producción de biomasa, ¿Qué factores operacionales y ambientales pueden
afectar la viabilidad de las levaduras?
4. Mencione algunos procesos de separación y purificación de levaduras.
5. Mencione y explique algunos mecanismos que emplean las levaduras para el estrés metabólico
durante su cultivo.

Lectura Obligatoria. Jinjing W, Huajian D, Feiyun Z, Yongxian L, Chunfeng L, Chengtuo N & Qi Li.
(2019). Physiological Changes of Beer Brewer’s Yeast During Serial Beer Fermentation. Journal of the
American Society of Brewing Chemists; 1 – 12.

3. FUNDAMENTO TEÓRICO

Los requisitos más importantes en la producción comercial de levadura son el crecimiento rápido y el
alto rendimiento de la biomasa, junto con una buena capacidad de fermentación de la masa. Estas
metas son intrínsecamente y metabólicamente contradictorias porque un alto rendimiento de biomasa
es favorecido por un catabolismo respiratorio, mientras que una alta capacidad de fermentación de
masa significa una alta capacidad para realizar catabolismo fermentativo. Por lo tanto, la capacidad
leudante de la levadura es un parámetro extremadamente importante en la producción de levadura de
panadería.
Básicamente, el concepto de proceso industrial se basa en la propagación de células a partir de un
cultivo puro en agar a grandes biorreactores que aumentan el volumen en cada etapa de propagación
hasta el volumen final del biorreactor. Sin embargo, además de este concepto simple, la producción
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industrial apunta a la conversión eficiente de la materia prima de azúcar en biomasa de levadura. Una
transformación eficiente del azúcar en proteína de levadura requiere que la producción de metabolitos
anaeróbicos como el etanol y acetaldehído se minimice, es decir, que el metabolismo del azúcar se
desvíe a la vía oxidativa para lograr el máximo rendimiento de energía ATP y formación de biomasa.
Además, los productos de fermentación tales como el etanol y en particular, el acetaldehído son
tóxicos. Este problema adquiere especial relevancia durante el cultivo a altas densidades de biomasa.

En general se sabe que las especies de Saccharomyces cerevisiae tienden a metabolizar la glucosa
glicolíticamente bajo el exceso de glucosa incluso en condiciones totalmente aerobias que producen
etanol, un fenómeno conocido como efecto Crabtree. Además, no sólo la glucosa, sino también la
fructosa ha demostrado desencadenar la represión catabolita sobre algunas cepas de Saccharomyces
cerevisiae. Esta represión de catabolitos produce un bajo rendimiento de biomasa en cultivos
discontinuos y afecta negativamente los rendimientos de la biomasa debido al bajo rendimiento de
ATP de la fermentación alcohólica. A pesar de ello, la formación de biomasa puede lograrse mediante
innumerables vías metabólicas y el rendimiento de la biomasa en el sustrato puede alcanzar valores
de hasta un 50% en el crecimiento oxidativo puro.

Para superar estas limitaciones en la producción de biomasa se deben tener en cuenta dos variables
de gran importancia: la tasa de transferencia de oxígeno y la concentración de glucosa en el medio.
En reacciones heterogéneas gas-líquido, por ejemplo, en la fermentación aerobia, la fase líquida
controla los procesos de transferencia de masa debido a la relativa insolubilidad de los gases. Esta
limitación se minimiza mediante el uso de reactores de columna de burbujas debido a su buena
transferencia de oxígeno con una operación de bajo costo en comparación con los reactores de tanque
agitado. La concentración mínima de azúcar en el caldo se puede alcanzar mediante el uso de un
proceso alimentado por lotes. Este concepto de proceso es el actual en escala industrial y proporciona
buenos rendimientos de biomasa cuando se utiliza la estrategia de control de procesos apropiada.
Tradicionalmente, en la producción industrial, la melaza u otra alimentación de materia prima sigue
una estrategia construida sobre la base de datos históricos de fábrica y por lo tanto es peculiar a una
tensión determinada y otras condiciones del proceso. Hoy en día, no sólo por razones económicas,
sino también por la política ambiental, algunas industrias están invirtiendo en nuevas estrategias de
control de procesos para evitar la emisión de contaminantes tóxicos.

Sustratos para la Producción de Levaduras

Las fuentes renovables utilizadas para la producción de biomasa pueden clasificarse en: azúcares,
almidón, biomasa lignocelulósica y algas. Las materias primas a base de azúcar requieren sólo un
proceso de extracción para obtener azúcares fermentables, mientras que los sustratos amiláceos
necesitan someterse a hidrólisis para convertir el almidón en glucosa. Por otro lado, la biomasa
lignocelulósica tiene que ser pretratada antes de la hidrólisis con el fin de alterar las estructuras de
celulosa para la accesibilidad enzimática.

 Azúcares
Los azúcares fermentables presentes en la biomasa, particularmente las materias primas a base
azúcar, son principalmente glucosa, fructosa y sacarosa. Estos azúcares solubles pueden ser
fermentados por levaduras u otros microorganismos fermentadores sin necesidad de ningún
tratamiento adicional. A diferencia de los azúcares solubles, el almidón es un polímero de glucosa que
no puede ser metabolizado por las levaduras y bacterias tradicionales en su etapa polimérica. Por
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consiguiente, el almidón debe convertirse en glucosa antes de someterlo a fermentación, lo que

requiere enzimas amilolíticas.

 Almidón
El almidón es el principal carbohidrato de almacenamiento en las plantas y actúa como reserva de
energía para las plantas superiores, como los cereales, las leguminosas y los tubérculos. Sin embargo,
la biodisponibilidad del almidón durante la hidrólisis enzimática depende de su estructura que puede
variar con respecto a las fuentes botánicas e híbridos de cultivo. El almidón se compone de dos
polímeros de unidades de α-D-glucosa, amilosa y amilopectina. La amilosa está unida por enlaces α-
1 → 4 glicosídicos, mientras que los enlaces α-1 → 4 y α-1 → 6 se encuentran en la amilopectina. La
amilosa es un polímero lineal de alrededor de 1000 unidades de glucosa, mientras que la amilopectina
posee una configuración muy ramificada junto con una rama que se une por enlaces α-1 → 6 en cada
20 enlaces. Las propiedades fisicoquímicas del almidón se asocian a menudo con su proporción de
amilosa y amilopectina, lo que significa significativamente un rendimiento final de etanol final.

 Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica contiene cantidades variables de celulosa, hemicelulosa y lignina
dependiendo del tipo de biomasa. La celulosa y las hemicelulosas constituyen aproximadamente dos
tercios del peso seco total de la biomasa vegetal. En la biomasa nativa, los polímeros de celulosa y
hemicelulosa permanecen conectados entre sí por los enlaces covalentes y de hidrógeno, ambos
ligados a la lignina, formando así una matriz ligninocelulósica compleja, robusta y recalcitrante a la
despolimerización. En general, la recalcitrancia de la biomasa se asocia con las propiedades de la
biomasa, incluyendo la naturaleza cristalina de la celulosa, la baja superficie disponible, la protección
de la celulosa y la hemicelulosa por la lignina y la naturaleza heterogénea de las partículas de biomasa.

 Celulosa
La celulosa es un polisacárido con una estructura lineal y cristalina que contiene cadenas lineales de
unidades de glucosa unidas entre sí por enlaces β-1 → 4-glucosídico. El enlace de hidrógeno extensivo
dentro de las moléculas de celulosa crea una red cristalina a través de la reticulación de varios grupos
hidroxilo y finalmente produce microfibrillas que hacen que las moléculas de celulosa sean más
resistentes y rígidas. Esta estructura explícita de la celulosa da como resultado su esqueleto apretado
y gran cristalinidad, lo que a su vez provoca la insolubilidad del polímero en agua y la resistencia a la
despolimerización.

 Hemicelulosa
La hemicelulosa es un heteropolímero. Consta de cadenas cortas, lineales y altamente ramificadas de
monómeros diferentes incluyendo hexosas (β-D-glucosa, α-D-galactosa y β-D-manosa) y pentosas (β-
D-xilosa y α-L-arabinosa). Las cadenas de hemicelulosa pueden contener también ácidos de azúcar
(ácidos urónicos): ácido α-D-glucurónico, α-D-galacturónico y α-D-4-O-metilgalacturónico, que
permanecen asociados con celulosa en la pared celular de la planta. A veces pueden encontrarse en
la hemicelulosa otros azúcares en pequeñas cantidades como α-L-ramnosa y α-L-fructosa. La cadena
principal de hemicelulosa se compone principalmente de xilano a través de enlaces β-1, 4 que incluyen
D-xilosa (alrededor del 90%) y L-arabinosa. Las hemicelulosas comúnmente conocidas son xilanos y
glucomananos. Los xilanos son la principal hemicelulosa en maderas duras, desechos forestales,
residuos agrícolas y residuos municipales e industriales, mientras que la madera blanda suele ser rica
en glucomanano.
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 Lignina
La lignina es un polímero aromático altamente ramificado presente en la pared celular de la planta, y
está vinculado a los polímeros de celulosa que forman una matriz lignocelulósica. Los monómeros de
un polímero de lignina son tres compuestos fenólicos: cumárico, coniferilo y alcohol sinapílico. Entre
la biomasa lignocelulósica, las maderas contienen cantidades relativamente más altas de lignina,
donde las maderas blandas varían entre 30% y 60% y las maderas duras varían entre 30 y 55% de
lignina. Las gramíneas y los residuos agrícolas contienen bajas cantidades de lignina, que van del 10%
al 30% y del 3 al 15%, respectivamente.

4. MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

Tubos de 16 x 150 con 9mL
1 solución salina 0.85% (p/v) 5 UN
estériles
2 Cámara de Neubauer 1 UN
3 Caja de Láminas portaobjetos 1 UN Por mesón de trabajo
4 Caja de Laminillas cubreobjetos 1 UN Por mesón de trabajo
5 Capilares 1 UN
6 Celdas para espectrofotómetro 1 UN Para todo el laboratorio
7 Paquete de Asas desechables 1 UN
8 Rack de puntas de 1mL 1 UN
9 Frasco lavador 3 UN Por mesón de trabajo
10 Beacker de 500mL 2 UN Para todo el salón

REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

1 Agua destilada 100 mL

EQUIPOS

Tabla 3. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por grupo:

ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES

1 Micropipeta 100 - 1000µL 1 UN
2 Espectrofotómetro 1 UN
3 pHmetro Vórtex 1 UN
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4 Plancha de calentamiento 2 UN
5 Centrífuga 1 UN

SOLUCIONES

Tabla 4. Listado de soluciones que requieren estar listas para el día de la práctica:
ITEM DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD U.M. OBSERVACIONES
1 Azul de Metileno 1% (p/v) 1 UN Por mesón de trabajo
2 DNS 10 mL Para todo el salón
3 Kit Tinción de Gram 1 UN Por mesón de trabajo

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1 Reactivación de la Cepa

 Adicionar el contenido de un vial de Saccharomyces cerevisiae en 50mL de caldo YGC estéril.
 Incubar durante 12 horas a una temperatura de 30°C ± 2°C en agitación constante a 100rpm.
Nota: Esta etapa es realizada por el monitor de la asignatura.

5.2 Producción de Biomasa

 Tomar 25mL de cultivo de S. cerevisiae y adicionarlos en 125mL de caldo YGC estéril.
 Incubar durante 12 horas y tomar muestras cada 2 horas.
Nota: Esta etapa es realizada por el monitor de la asignatura.

5.3 Cuantificación de Biomasa por Espectrofotometría

 Tomar 50mL del cultivo en un tubo Falcon.
 Centrifugar durante 15 minutos a 2250 g.
 Separar el sobrenadante en un tubo Falcon limpio.
 Suspender en solución salina el precipitado (biomasa de la levadura) y realizar dos lavados más
con solución salina.
 Finalmente tomar lectura de absorbancia a 620 nm y reemplazar en la curva patrón de peso seco.

5.4 Determinación del Porcentaje Viabilidad

 Tomar 1mL de cada tiempo de muestreo y adicionarlos en 9mL de solución salina estéril 0.85%
(p/v). Este corresponde a la dilución 10-1.
 Realizar diluciones seriadas en base 10 desde 10-1 hasta 10-3 en solución salina estéril 0.85% (p/v).
 Tonmar 1mL de esta dilución y mezclar con 1mL de azul de metileno 0.1% (p/v)
 Mezclar por inmersión.
 Colocar un cubre objetos sobre el sector central de la cámara de Neubauer.
 Con ayuda de una punta de micropipeta o un capilar poner en contacto con la muestra y permitir
que esta suba por capilaridad.
 Colocar la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos y dejar que el líquido penetre entre
la cámara y el cubreobjetos desde el lateral por capilaridad. No ejercer presión sobre la cámara.
 Colocar la cámara en sobre la platina del microscopio.
 Enfocar la cuadrícula central con el objetivo de 4X y a aumentar hasta 40X.
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 Por cada cuadrante, contar tanto las células incoloras como las células coloreadas y reportar el
valor de cada una de ellas.
 Calcular el porcentaje de viabilidad empleando la siguiente fórmula:

𝐂é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥𝐞𝐬 − 𝐂é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐌𝐮𝐞𝐫𝐭𝐚𝐬

× 𝟏𝟎𝟎
𝐂é𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 𝐓𝐨𝐭𝐚𝐥𝐞𝐬
El valor obtenido corresponde al porcentaje de viabilidad de las células presentes en la muestra

5.5 Medición de pH
 A partir del volumen obtenido en cada tiempo de muestreo y luego de separar la biomasa realizar
la medición de pH en el pHmetro. Verificar la calibración previa a su uso.

5.6 Cuantificación de Azúcares Reductores

 Cubrir un tubo de 16 x 150 con papel aluminio evitando el paso de la luz.
 Tomar 0.25mL de la muestra y 0.25mL del reactivo DNS y adicionarlas en el tubo.
 Calentar en baño maría durante 5minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de
los tubos en hielo durante 5 minutos.
 Adicionar 2.5mL de agua destilada a cada uno de los tubos de reacción.
 Ajustar el cero de absorbancia del espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm.
 Realizar la lectura de absorbancia de los tubos de reacción.
 En caso de obtener un valor por encima de 1.0 se debe realizar una dilución a la muestra inicial y
repetir el procedimiento.
 Reemplazar el valor obtenido en la ecuación de la recta obtenida previamente.

6. PAUTAS PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS

 Realizar una gráfica integrada de la biomasa, porcentaje de viabilidad, pH y azúcares reductores
durante los diferentes tiempos de muestreo.
 Cuales rutas metabólicas están implicados en la producción de biomasa y cómo se llevó a cabo el
metabolismo del sustrato presente.
 ¿Qué relación existe entre el pH y la producción de biomasa? Tenga en cuenta los metabolitos que
se producen durante el cultivo.
 ¿Qué modificaciones a nivel de membrana y/o metabolitos emplean las levaduras para evitar la
afectación de su membrana?

BIBLIOGRAFÍA
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Edición. Prentice Hall International. (2014).
 Durão E, Stupiello M, Andrietta S. (2013). Yeast biomass production: a new approach in glucose-
limited feeding strategy. Brazilian Journal of Microbiology 44, 551 – 558.
 Martínez R Morales P, Gonzalez R, Mas R, Beltran G. (2012). Biomass production and alcoholic
fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae as a function of nitrogen source. FEMS 12,
477 – 485.
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 Perez R, Gamero E, Gómez R, Garre E, Aranda A, Matallana E. (2015). Yeast biomass, an

optimised product with myriad applications in the food industry. Trends in Food Science &
Technology 46, 167 – 175.
 Okafor, N. Modern industrial microbiology and biotechnology. Enfield: Science. (2007)