Práctica 7

Recuento de microorganismos

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Objetivos

 Realizar el método de recuento viable en superficie y profundidad.

 Aprender a realizar diluciones y siembra en placa.
 Determinar las UFC (unidades formadoras de colonias), en cada dilución.
 Calcular el número de unidades formadoras de colonias/mL (UFC/mL de
muestra).

1. Preinforme

● ¿Qué son las UFC en microbiología? ¿Todos los microorganismos pueden formar
UFC?
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● ¿Cuáles son las metodologías utilizadas para el recuento de microorganismos viables

totales? Explique en qué consiste cada una.
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● ¿Cómo se estudia la viabilidad de un microorganismo?

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 ¿Cómo se calcula el número de UFC/mL en una muestra?

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2. Bioconceptos

En estudios microbiológicos de análisis de alimentos, agua, muestras ambientales entre

otras, es importante determinar el número de microorganismos presentes en la muestra para
determinar su calidad.

El número de bacterias puede determinarse directamente por recuento del número total de
células o indirectamente por la estimación del número más probable, por filtración o por el
recuento de células viables en placa (células capaces de dividirse en un medio de cultivo
sólido, también se refieren como unidades formadoras de colonias, UFCs).

Métodos de recuento de bacterias viables en placa

Estos métodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo las bacterias viables presentes en una
muestra. Implican la dilución seriada de la muestra en agua, caldo o solución salina, la
inoculación de la dilución en medio de cultivo sólido y la incubación durante 24-48 horas a
la temperatura apropiada. Son métodos de estimación de bacterias viables en término de
unidades formadoras de colonias (UFCs). El número de unidades formadoras de colonias
de una suspensión bacteriana puede determinarse mediante dos técnicas descritas a
continuación.

Recuento en placa por siembra en profundidad: consiste en añadir medio de cultivo fundido
y enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra
diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar
solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la
superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos
anaerobios facultativos o microaerofilos.

Recuento en placa por siembra en superficie: consiste en la siembra de un volumen

conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa
Petri. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente
se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias.

3. Materiales y métodos

3.1 Materiales

 Bata anti fluido (proporcionada por el estudiante)

 Zapatos blancos referencia Evacol 080 (proporcionados por el estudiante)
 Toallas de papel (proporcionadas por el estudiante)
 Gorro (proporcionado por el estudiante)
 Guantes (proporcionados por el estudiante)
 Mascarilla N95 para riesgo biológico (proporcionada por el estudiante)
  Encendedor (proporcionado por el estudiante)
 Asa recta y en argolla (proporcionada por el estudiante)
 Pipeteador (proporcionado por el estudiante)
 Gafas de seguridad (proporcionadas por el estudiante)
 Cubreobjetos (proporcionado por el estudiante)
 Porta objetos (proporcionado por el estudiante)
 Marcador indeleble (proporcionado por el estudiante)
 Muestra de suelo rizosférico (proporcionado por el estudiante)
 Pipetas graduadas de vidrio estériles de 1 ml
 Cajas de Petri estériles
 Tubos de ensayo tapa rosca estériles para diluciones
 Gradillas
 Rastrillo de vidrio estéril
 Balanza
 Frascos Tapa rosca de 150mL con 90mL de agua destilada estéril
 Cajas de Petri con agar PCA
 Tubos de ensayo con 15mL de agar PCA
 Agua destilada estéril

3.2 Metodología

 Diluciones

Pese 10 g de suelo y colóquelos en condiciones de esterilidad en un frasco que contiene 90

mL de agua destilada estéril. Agite y deje reposar algunos minutos. (Solución madre).
Rotule los tubos.

Tome 1mL de la suspensión anterior (no arrastrar sedimento) y resuspéndala en 9mL de

agua destilada estéril, agite. Dilución 10-1. Repita este paso hasta llegar a la dilución
deseada 10-6.

 Siembra en superficie y por profundidad

Siembra en superficie: realice por duplicado, adicione 0,1 mL de cada dilución (10 -4, 10-5,
10-6) sobre la superficie de los medios listos para siembra. Una vez inoculado el medio se
procede a distribuir el inóculo con la ayuda de rastrillo o pipeta estéril (siembra masiva).
Marque las cajas con la dilución, el tipo de siembra, nombre y fecha.

Siembra por profundidad: realice por duplicado, adicione 1 mL de cada dilución (10 -4, 10-5,
10-6) sobre la caja de Petri estéril vacía. Vierta el medio de cultivo previamente fundido (45
± 1 °C) en cada placa de Petri, flameando la boca del recipiente antes de adicionarlo.
Mezcle por completo el medio con la muestra diluida previamente colocada, haciendo girar
suavemente la caja, primero en una dirección y luego en la otra. Deje solidificar. Marque
las cajas con la dilución, el tipo de siembra, nombre y fecha.

Lleve las cajas a la incubadora a 35°C en forma invertida, durante 24 horas. Realice el
conteo de colonias en un rango de 10-100. Reporte: recuento de UFC/mL en la tabla.

Siembra 10-4 10-5 10-6 Observaciones y resultado UFC/mL

Profundidad

Superficie

Exprese los resultados de acuerdo al siguiente ejemplo.

−4
10 =115 colonias

No . colonias x Factor de dilución x 10

5
UFC=115 x 10 UFC /mL
6
UFC=11 x 10 UFC / mL

4. Preguntas de profundización

 ¿Qué conclusiones parciales se pueden obtener del conteo de microorganismos en

placa?
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 ¿Cuáles son las limitaciones de esta metodología? ¿Cómo se pueden minimizar los
errores aleatorios?
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 Describa cómo obtendría una dilución de 10-5 de una muestra a analizar, partiendo
de una muestra de suelo cuya masa es 10000 mg.

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 ¿Por qué son importantes las diluciones seriadas en los recuentos de bacterias?
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● Mencione las diferencias más significativas entre la metodología del conteo en placa y
el número más probable (NMP).
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 Realice un diagrama de flujo que explique metodológicamente cómo se lleva a cabo

el conteo de microorganismos en placa.

 Al realizar el conteo de una muestra de agua da como resultado que las UFC de E. coli
son incontables; qué indica este resultado en términos de calidad del agua, según las
NTC (Normas técnicas colombianas).
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 ¿Cuál es el fundamento del agar PCA?

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 ¿Cuáles son los grupos funcionales de microorganismos que se encuentran en la

rizosfera del suelo? Explique la función de cada grupo.
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 ¿Por qué se debe realizar la siembra en profundidad y por superficie para el recuento de
UFC y por qué se debe realizar por duplicado?
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5. Bibliografía consultada

Autor (es) Libro – Revista Páginas Año Editorial