UNIVERSIDAD DE CORDOBA

Universidad de
Facultad Ciencias de la Salud Córdoba,
comprometida
Departamento de Bacteriología con el
desarrollo
NIT 891080031-3 regional.
ASIGNATURA: Microbiología de lácteos
CODIGO: 504205
HORAS SEMANALES: 3
COMPONENTE: Practico
UBICACIÓN: VII Semestre
REQUISITOS: 504158
DOCENTE: Eduardo Thorrens Romero
GUIA N° 3

TOMA DE MUESTRAS, PREPARACION Y DILUCION DE LOS

HOMOGENIZADOS DE MUESTRAS DE ALIMENTOS LACTEOS

INTRODUCCION

Los alimentos para ser sometidos al análisis microbiológico deben seleccionarse

adecuadamente según la finalidad del análisis, con el objeto de que los resultados
sean significativos. La fracción de alimento destinada al análisis debe ser
representativa de la totalidad de la muestra. En general, la muestra analítica debe
estar constituida, aproximadamente, por 200 gramos de la misma. Para la puesta
en marcha de las distintas determinaciones se utilizan 100 gramos, el resto sirve
de reserva, por si es necesario repetir el análisis. La toma de la muestra se hace
en condiciones asépticas muy estrictas y con material estéril, utilizando, cámaras
de flujo laminar y, siempre en las proximidades de un mechero. El material
utilizado en la apertura de envases y en la toma de la muestra es de acuerdo a la
naturaleza del producto: abridores, pinzas, bisturís, espátulas, etc. El
procedimiento comúnmente empleado para el aislamiento y recuento de los
microorganismos presentes en los alimentos consiste en la preparación de una
suspensión homogénea de alimento y de microorganismos que permita la
preparación de las diluciones que posteriormente podrán ser utilizadas en
diversos métodos de recuento.

Recuento de microorganismos mesofilos viables

En el recuento de microorganismos aerobios mesófilos, se estima la flora pero sin

especificar tipos de gérmenes. Es el método comúnmente utilizado para
determinar el número de células viables o de unidades formadoras de colonias
(UFC) en un alimento. Es el indicador más amplio en alimentos, ya que incluye
todos los géneros aerobios y facultativos que crecen en medios simples a una
temperatura entre 20 0C y 45 0C. Este recuento se considera como indicador del
grado de contaminación de los alimentos en cualquier etapa del proceso de
producción, permite también obtener información sobre la alteración incipiente de
los alimentos y su probable vida útil. El recuento de microorganismos mesófilos
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facultativos viables es el parámetro indicativo de calidad microbiológica de leche
cruda, el decreto 1880 establece un límite admisible de hasta 700.000 UFC\ml

NECESIDAD
Promover en el estudiante el desarrollo de habilidades en la toma y preparación de
diluciones de muestras de alimentos lácteos

OBJETO DE ESTUDIO
Toma de muestras de alimentos lácteos y preparación de diluciones

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

 Identificar los diferentes métodos de toma y preparación de muestras de

alimentos lácteos
 Preparar diluciones de muestras de alimentos lácteos en sus
presentaciones: líquidos, solidos, en polvo y granulados
 Realizar determinación de microorganismos mesófilos aerobios en una
muestra de leche cruda

COMPETENCIAS QUE DESARROLLARA EL ESTUDIANTE

El estudiante aplica procedimientos para la correcta toma de muestras y prepara

adecuadamente las diluciones para el análisis de las mismas

MATERIALES DE LABORATORIO
 Balanza de una capacidad no inferior a 2500 gramos
 Refrigerador de 0 – 5 0C.
 Pipeteador
 Bolsas de plástico estériles para homogenizador.
 Frascos de dilución aforados a 99 ml.
 Tubos de ensayo tapa rosca 16 x 100 estériles.
 Instrumentos estériles para tomar asépticamente la muestra: cuchillos,
tenedores, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, sacabocados, morteros con sus
respectivos pistilos.
 Gradillas.
 Agua peptonada al 0.1% estéril.
 Alcohol al 70%
 Incubadoras a 35 +/- 2 0C.
 Cuenta colonias
 Cajas de petri estériles
 Pipetas de 1 ml estériles.
 Agar plate count fundido
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PROCEDIMIENTO

1. Preparación de muestras y diluciones

Productos líquidos (leche cruda):

Mezclar muy bien las muestras para asegurar su homogenización. Desinfectar con
alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.

Las muestras líquidas deben agitarse vigorosamente para su homogenización,

bien sea agitando el recipiente con la muestra por 25 veces moviendo el antebrazo
para formar un arco de 30 cm, por un tiempo máximo de 7 seg.

En el caso de estar sin espacio libre en el recipiente, abrirlo y con una pipeta
estéril de suficiente capacidad, aspirar y dejar caer durante 10 veces el líquido.

Finalmente tomar 10 ml u 11 ml de la muestra y llevarlos al frasco que contiene 90

ml o 99 ml de agua peptonada 0.1%, de este modo se obtiene la dilución 1:10 (10 -
1
). Figura 1

Agitar vigorosamente el frasco, dejar en reposo durante 10 minutos.

Preparar la dilución 1:100 (10 -2), transfiriendo 1 ml de la dilución 1:10. Con pipeta
de 1ml aun tubo que contiene 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar
cuidadosamente.

Preparar la dilución 1:1000 (10 -3), transfiriendo 1 ml de la dilución 10 con pipeta

de 1 ml a un tubo que contenga 9 ml de agua peptonada 0.1%, agitar
cuidadosamente.

Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias.

El rango de diluciones preparadas puede modificarse en función a la cifra de

microorganismos esperada. Se deben sembrar siempre tres diluciones
consecutivas.

Productos sólidos (queso fresco):

Los alimentos sólidos o semisólidos y en general los que no se pueden

homogenizar por agitación, deben tomarse separando o cortando pequeñas
porciones a diferentes niveles o zonas, con la ayuda de pinzas, tijeras, cuchillos,
tenedores, etc., los cuales se van depositando en la bolsa de homogenizador
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estéril, previamente tarada, hasta obtener 10 g y añadir los 90 ml de agua
peptonada 0.1%, de esta forma se obtiene la dilución 10 -1 .

Para alimentos con un alto contenido de grasa (superior al 20%), es necesario

añadir 1% de Tween 80 o de otro tensioactivo no tóxico.

Proceder a realizar las diluciones consecutivas 10-2, 10-3, etc., agitando

cuidadosamente cada dilución. Figura 1.

Productos en polvo, granulados, etc. (leche en polvo):

Con la ayuda de espátulas, cucharas estériles, etc., tomar pequeñas porciones y

agitar para que la muestra sea representativa, depositar ésta en la bolsa de
homogenizador, previamente tarada, hasta ajustar 10 g, y añadir 90 ml de agua
peptonada 0.1%, de esta forma se obtendrá la dilución 10 -1.

Comenzar la homogenización si es en licuadora, con un número bajo de

revoluciones y en pocos segundos pasar a muchas revoluciones; o aumentar
gradualmente en pocos segundos, hasta alcanzar las revoluciones máximas,
controlar cuidadosamente el tiempo de homogenización, de forma que no supere
los 2 minutos, a muchas revoluciones, pues se podría producir lesión a los
microorganismos, bien sea por el efecto mecánico de las cuchillas o por el
aumento de calor.

2. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios

1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados, en la forma

recomendada.
2. Transferir por duplicado, alícuotas de 1 ml, de cada una de las diluciones
consecutivas en cajas de petri estériles.
3. Verter en las cajas de petri 15 ml de agar plate count fundido y mantenido a 45
0
C.

4. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir más de

20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. La
manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente :

a. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces.

b. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las manecillas del reloj.
c. Mover la caja cinco veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento(a).
d. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
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5. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que
contenga agar plate count.
6. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 01%, incubando una caja que
contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate count.
7. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35 0C
+/- 2 0C durante 48 horas.

Cálculo e interpretación de los resultados:

Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten

entre 30 y 300 colonias. Contar todas las colonias de cada caja. Hallar la media
aritmética de los dos valores y multiplicarlas por el factor de dilución.

Se reporta como “unidades formadoras de colonias (ufc)/ g ó ml.

Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y

mayores de 300 colonias, contar las cuatro cajas, calcular el recuento para cada
una de las diluciones y sacar el promedio entre las dos.

Ejemplo:

Dilución 1: 10

caja 1 : 330 colonias caja 2 : 350 colonias

350 + 330 x 10 = 3400

2

Dilución 1: 100

caja 1 = 26 colonias caja 2 = 28 colonias

26 + 28 x 100 = 2700
2

media aritmética : 3400 + 2700 = 3050

2
Reportar el recuento como 3050 ufc/ g o ml.

Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilución de mayor

concentración, informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de
dilución más concentrado.
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Ejemplo:

Dilución 1:10

Ausencia de colonias.

Reportar el resultado como menor de 10 ufc / g o ml.

10 (si se ha sembrado 0.1ml de la dilución 10 – 1)

Ausencia de colonias.

Reportar el recuento como menor de 100 ufc/g o ml.

En el caso de que dos diluciones consecutivas estén dentro del rango de 30 – 300
colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones y se reporta la
media aritmética de los dos valores obtenidos, a menos que el recuento mayor
contenga dos veces al menor, en este caso se reporta el recuento menor.

Ejemplos:

a. 10-1 : 290 colonias = 2900

10-2: 40 colonias = 4000

4000 = 1,3 (menos de 2)

2900

Reportar media aritmética: 3.450 ufc / g o ml

b. 10-1 : 170 colonias = 1700

10-2: 35 colonias = 3500

3500 = 2.05 (mayor de 2)

1700

Reportar el recuento menor: 1700 ufc/g

PRE-LABORATORIO

1. Que se entiende por alimento

2. Que se entiende por muestreo
3. En qué casos debe realizarse muestreo aleatorio y en qué casos por lote
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POST-LABORATORIO

1. Realice un diagrama donde se resuma el procedimiento adecuado para la

preparación de muestra de acuerdo al tipo de alimento
2. Establezca una comparación entre los resultados obtenidos en la práctica
del recuento de mesófilos aerobios y la norma que aplica de acuerdo al
lácteo evaluado

BIBLIOGRAFIA

MUÑOZ, A; OTERO, L. Guía de Aseguramiento de la calidad, valoración de medios de

cultivo y validación microbiológica cualitativa para los laboratorios de microbiología de
alimentos. INVIMA, Bogotá 2011.

HOLGUIN, M; HIGUERA, M. Manual de técnicas de análisis para control de calidad

microbiológico de alimentos para consumo humano. INVIMA. Bogotá, 1998.