TECNOLOGICO DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE ECATEPEC
DI VI SI ON DE I NGENI ERI A QUI MI CA Y BI OQUI MI CA

MICROBIOLOGA
SANDOVAL GMEZ YANIN GABRIELA
PRACTICA #5
CUENTA DE COLONIAS POR LA TECNICA
DE VACIADO EN PLACA E INOCULACION EN
SUPERFICIE

INTEGRANTES DEL EQUIPO:
CALZONZIN JIMENEZ IVAN GIANCARLO
HERNANDEZ VILLEGAS PRISCILA
RANGEL MARQUINA IVAN ARTURO
RIVERO LOBATO MAURICIO
GRUPO: 3551

FECHA DE ENTREGA: 31/OCTUBRE/2013
Practica #1 Cuenta de colonias por la tcnica de
vaciado en placa e inoculacin en superficie

Objetivo:
1. El alumno aislara bacterias aerobias por las tcnicas de vaciado en placa e
inoculacin en superficie.

Marco Terico:
Mtodo para el conteo de microorganismos viables:
Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento.
Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que
no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un
indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento.
Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la interpretacin de resultados.
Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado
en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados
sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia
de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque,
en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer
recuentos de anaerobios totales.

Cuenta en placa:

Se determina el nmero de microorganismos en una muestra en relacin a las
colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean
soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada
colonia formada provenga de un solo microorganismo aunque algunas
agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones.

Se utilizan principalmente para la cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos. Se reporta como: UFC ****/unidad de volumen o peso


Diluciones y cuenta en placa

Nmero ms probable (NMP), tambin llamada tcnica de dilucin en tubo,
proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con
base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye
conforme es menor el volumen de muestra inoculado.
Reglas para conteo en placa

Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay
menor error en el conteo.

Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no
hay diluciones subsecuentes:

301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se
multiplica por 2.

501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se
multiplica por 4. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se
multiplica por el nmero de cuadros que ocupa la caja.

El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la
dilucin y considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al
volumen de la muestra).

Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al
inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400.

Tcnicas de vaciado en placa:

Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de
colonias, la tcnica por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en
cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles, y se adiciona el medio
de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que
multiplicadas por el inverso de la dilucin que corresponda permite estimar el
nmero de microorganismos viable por gramo o ml de muestra, obviamente con
las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y tipo de
colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado grupo de
microorganismos. Esta tcnica permite la mayora de las veces cuantificar la
contaminacin en alimentos, medicamentos.


Metodologa
Tcnica de vaciado en placa:
1. Homogeneizar el cultivo agitando vigorosamente la muestra.

2. Transferir 10 ml del cultivo a la botella conteniendo 90 ml de agua
peptonada, agitar y transferir 1 ml a un tubo conteniendo 9 ml de agua
peptonada, agitar y transferir 1 ml, a otro tubo conteniendo 9 ml de agua
peptonada.

3. Agitar el contenido del tubo y transferir 1 ml a otro tubo conteniendo 9 ml de
agua peptonada (dilucin 10
-3
) y transferir otro ml en caso de realizar la
dilucin 10
-4
y as sucesivamente para otras diluciones.

4. Proceder de igual manera para realizar la dilucin 10
-3
.

5. Al concluir cada dilucin inocular 1 ml, en una caja de Petri, previamente
marcada, indicando la dilucin correspondiente, antes de preparar la
siguiente dilucin.

6. Agregar a cada caja 15 ml (en forma aproximada) de agar nutritivo, fundido
y enfriado a 45C.

7. Incorporar el inoculo al medio por rotacin de la caja sobre la mesa,
procurando levantar ligeramente la tapa.

8. Dejar solidificar las cajas.

9. Inocular las cajas a 35C por 48 horas.

10. Contar todas las colonias en aquellas cajas que contengan menos de 300 y
el resultado multiplicarlo por la inversa de la dilucin.



Tcnica de inoculacin en superficie:
1. A partir de las 5 diluciones que se hicieron anteriormente se siembran 5
cajas Petri conteniendo agar nutritivo, adicionando 1 ml, de cada dilucin en
el contenido de la placa correspondiente.

2. Introducir en alcohol la varilla de vidrio y flamearla, dejarla enfriar a un
extremo de la caja.

3. Extender con la varilla el inoculo en toda la superficie de la placa pasando
la varilla repetidas veces, utilizar la varilla flameada para cada dilucin.

4. Dejar secar la superficie de las cajas, aproximadamente 15 minutos.

5. Invertir e introducir a 37C por 48 horas en el caso de levaduras, incubar a
28C durante 24 horas entre 30 y 300C.

6. Seleccionar las cajas que tengan colonias para el conteo.


Resultados y anlisis
Medio de
cultivo
Dilucin Numero de
colonias
Infusin cerebro-corazn -1 30000000
Infusin cerebro-corazn -2 Incontables
Infusin cerebro-corazn -3 9300000
Infusin cerebro-corazn -4 2021000
Infusin cerebro-corazn -5 75000
Infusin cerebro-corazn -6 19583
Infusin cerebro-corazn -7 4125
Papa-dextrosa -1 10000000
Papa-dextrosa -2 8000000
Papa-dextrosa -3 Incontable
Papa-dextrosa -4 804166
Papa-dextrosa -5 519000
Papa-dextrosa -6 76250
Papa-dextrosa -7 12375
Al observar las cajas se pudo notar que las primeras tres cajas con las diluciones
de 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, hubo un gran crecimiento de colonias el cual es bastante difcil
de cuantificar por lo cual se requiri del uso del cuenta colonias, en las otras
cuatro diluciones el conteo se pudo realizar sin emplear el cuenta colonias debido
a que solo existan pocas colonias.
Analizando la tabla anterior que nos muestra el total de colonias en cada uno de
los medios de cultivo y con su respectiva dilucin, nos podemos dar cuenta que
conforme va aumentando la dilucin disminuye el total de colonias.

Conclusiones
Las tcnicas de aislamiento de colonias son de gran importancia a nivel industrial,
para esto es importante tomar en cuenta las tcnicas que sirven para realizar este
aislamiento como lo son las diluciones, estas tienen gran importancia ya que si lo
que se quiere es trabajar con unas cuantas colonias e incluso con un solo tipo de
colonia de bacterias se recurre al uso de estas diluciones.

Cuestionario

1.- Explicar las ventajas y desventajas de la tcnica de vaciado en placa
Ventajas:
Mide el nmero de clulas viables
Los microorganismos sensibles al calor pueden resultar daados por el
agar fundido.
Desventajas:
Requiere bastante tiempo (24 horas o ms)
Las bacterias crecen en unidades, en cadenas o como grumos.
En medios diferenciales las colonias que se forman debajo de la superficie
no son adecuadas (solo las de la superficie)
Debe haber un nmero determinado de colonias en la placa (30-300)

2.- Explicar las ventajas y desventajas de la tcnica por inoculacin en
superficie
Ventajas:
Es una tcnica rpida
No requiere de diluciones
Requiere de muy poca cantidad de muestra
Evita el contacto de las clulas con el agar fundido
Desventaja:
Esta tcnica es poco exacta
Carencia de uniformidad en la extensin
Requiere de largos periodos de tiempo

3.- Discuta en base al nmero de colonias que encontraron en cada una de
las cajas, si estuvo bien desarrollada la tcnica
El nmeros de colonias que se obtuvieron mediante esta tcnica ilustra que es una
tcnica muy efectiva ya que el crecimiento de microorganismos fue disminuyendo
lo cual muestra que estos crecimientos corresponden de acuerdo al tipo de
dilucin que se realiz mostrando adems de menor cantidad de
microorganismos, tambin se aprecia menos variedad microbiana conforme la
dilucin es mayor.
4.- Ud. Conoce el nmero de bacterias por gramo de una muestra de
pimienta molida, por lo que realiza la siguiente serie de diluciones de 10
-1
a
10
-8
, siembra 0.1 ml en cajas por la tcnica de inoculacin en superficie y
obtiene los siguientes resultados:
Dilucin Cuenta microbiana
10-1 Incontable
10-2 Incontable
10-3 Incontable
10-4 Incontable
10-5 325
10-6 30
10-7 4
10-8 Sin crecimiento
10-9 Sin crecimiento
10-10 Sin crecimiento

5.- Qu dilucin utilizara para conocer el nmero de clulas por gramo de
pimienta y por qu?
La dilucin que se empleara para determinar el nmero de clulas por gramo del
pimienta seria la dilucin 10
-6
ya que se encuentra dentro del rango de medicin
contable (30-300 colonias), ya que esta dilucin no posee gran cantidad de
colonias se puede realizar un clculo ms preciso.
6.- Cul es el nmero de bacterias por gramo?
El nmero de bacterias por gramo seria de 1 ya que la muestra inicial es
considerada como dilucin 10
0
lo cual corresponde a: 1 bacteria/gramo de muestra
de pimienta.
O se puede suponer una cantidad inicial de bacterias
7.- Indique los clculos a realizar y sus resultados
Para las primeras 4 y ultimas 3 diluciones al no haber un nmero aproximado de
crecimiento bacteriano o al haber ocurrido crecimiento no se debe realizar conteo
ni elaborar clculos ya que el nmero de bacterias por gramo sern inexactos o de
cero. Para las otras diluciones se realiza lo siguiente:
Posteriormente al ya conocer el nmero de colonias bacterianas se sustituye en la
siguiente ecuacin obtenindose el nmero de bacterias por gramo de muestra:

UFC/g = (NC * 1/FD * 1/ V)

Dnde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de pimienta molida
NC= nmero de colonias en una caja.
FD = factor de dilucin que corresponde a la dilucin de donde se tom la muestra
con la que se inocula la caja (10-2 a 10-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
Dilucin 10
-1
: incontable

Dilucin 10
-2
: incontable
Dilucin 10
-3
: incontable
Dilucin 10
-4
: incontable


Dilucin 10
-5
:
UFC/g = (NC * 1/FD * 1/ V)
UFC/g = ((325)(1/1X10
-5
)(1/0.1ml)
UFC/g = 0.0325

Dilucin 10
-6
:
UFC/g = (NC * 1/FD * 1/ V)
UFC/g = ((30)(1/1X10
-6
)(1/0.1ml)
UFC/g = 3x10
-4

Dilucin 10
-7
:
UFC/g = (NC * 1/FD * 1/ V)
UFC/g = ((4)(1/1X10
-7
)(1/0.1ml)
UFC/g = 4x10
-6

Dilucin 10
-8
: Sin crecimiento
Dilucin 10
-9
: Sin crecimiento

Dilucin 10
-9
: Sin crecimiento


Referencias bibliogrficas:

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_1983
7.pdf

http://docencia.izt.uam.mx/smk/233155/practicas/Practica%204.pdf

http://www.unavarra.es/genmic/recuento%20microorganismos.htm

http://es.scribd.com/doc/38138496/Recuento-y-Cuantificacion-de-
Microorganismos

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf