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1
Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Química, Universidad de Pamplona, Km 1 Vía
Bucaramanga, Pamplona, Norte de Santander, Colombia
2
Facultad de Ingenierías y Arquitectura, Programa Ingeniería de Alimentos, Universidad de
Pamplona, Km 1 Vía Bucaramanga, Pamplona, Norte de Santander, Colombia
RESUMEN
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obtuvo como resultado qu, la acetona, a una concentración de
75% v/v, es la más eficaz para la extracción (243,2mg) que supera
aproximadamente en 100mg a la cantidad obtenida con el etanol al
50% v/v (146,0mg). El análisis electroforético muestra que el peso
molecular de la bromelina es de 35000 dalton. El comportamiento
cinético de la bromelina se ajusta al modelo de michaelis-menten,
en el cual se determinan la vmax 3.38e-3 mm/seg y el valor de km
de 4,19e-3 mm.
ABSTRACT
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INTRODUCCIÓN
El uso de enzimas como biocatalizado- eficacia del 60%, lo que hace que estos enzi-
res es una gran opción que debe desarrollar mas tengan la capacidad de proporcionar un
nuestro país, disminuyendo de esta forma el rápido ablandamiento de la carne de vacuno
atraso tecnológico en que nos encontramos adulto (Ionescu., et al., 2008). Según Galarza
en el campo de la enzimología y buscando a D. (2002), un extracto de corazón de la piña,
la vez las aplicaciones que proporcionen pro- tiene mayor efecto sobre el ablandamiento
greso a nivel industrial. Colombia es una de de carnes que extractos de cáscara y pulpa;
las potencias mundiales en cuanto al cultivo esto puede indicar que el corazón de la piña
de piña, ya que se encuentra entre los doce contiene bromelina de mayor actividad en-
países más productores de este fruto, alcan- zimática que la de cualquier otra parte de
zando a producir más de 400.000 toneladas la fruta. Propiedades similares le permiten
de piña en 2009 según los registros de la FAO actuar eficientemente sobre levaduras, lo que
(Carrera., J.; 2003). conlleva a que su uso se extienda a la industria
panificadora (Moodie, P. 2001).
Bromelina
En la industria de los alimentos encon-
La bromelina (Enzyme commission tramos la aplicación más popular de la bro-
number: E.C. 3.4.22.32) se obtiene del jugo, melina. La capacidad de la bromelina para
de la fruta o de los tallos de la piña (Ananas degradar el material fibroso de los cárnicos
comosus). Es una glicoproteína del grupo de es bien conocida. Tanto la cáscara, como la
las cisteíno proteasas. Actúa preferencialmen- pulpa y el corazón de la piña ejercen un efec-
te sobre los aminoácidos básicos y aromáticos to ablandador sobre las carnes, esto es dado
de las proteínas. Su pH óptimo se encuentra por supuesto por la presencia de bromelina
en el rango de 5 a 8. Tiene baja tolerancia en todo el fruto de piña (Galarza, D., 2002).
térmica. El enzima se utiliza principalmente
como ablandador de carne (tiene buena acti- En cuanto a la industria vinícola Benucci,
vidad sobre los tendones y el tejido conectivo I. et al. (2010), demostraron que la bromeli-
rico en elastina) y para hidrolizar proteínas na estabiliza proteínas presentes en el vino
solubles de la cerveza que pudieran preci- blanco e impide que estas precipiten durante
pitar y causar opacidad por el enfriamiento la fabricación de la bebida, aspecto que le
(Carrera., J.; 2003). Estudios de secuencia- confiere al producto más claridad y que puede
ción de aminoácidos han demostrado que llevar a futuras aplicaciones biotecnológicas
la bromelina debe su actividad a un grupo de la bromelina en la fabricación de vinos.
sulfihidrilo (–SH) propio de una cisteína-25
(Ritonja, A.. et al., 1989), grupo activo que Factores que afectan la velocidad de
se asemeja a otras cisteíno proteasas como la reacción
actinidina y la papaína (Lee, A. et al., 1997).
Junto con la papaína (enzima activa de la Existen varios factores que afectan di-
papaya), la bromelina tiene una actividad rectamente la velocidad de reacción de un
hidrolítica sobre el tejido conectivo con una enzima, algunos modifican el entorno quími-
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co del medio impidiendo que el enzima actúe factores que desnaturalizan el enzima, puesto
con naturalidad y otras inhiben totalmente que cada enzima tiene unas condiciones de
la actividad enzimática, conduciendo gene- pH y temperatura óptimas para su funciona-
ralmente a la desnaturalización del enzima. miento, fuera de las cuales el funcionamiento
Estos factores son: no será el adecuado y en algunos casos será
• Concentración del Enzima. nulo (Colarossi., A., 2011).
MATERIALES Y MÉTODOS
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Cuantificación proteica del extracto medición es que la concentración de sustrato
sea significativamente mayor que la concen-
Se realizó la cuantificación de proteína tración de enzima. Se preparó además una
del extracto trabajado para la extracción de la solución de buffer fosfato 0,1M pH 6 y una
misma utilizando el método de Biuret (XXI solución de ácido acético (CARLO ERBA
Congreso de investigación CUAM-AC Mor, REAGENTS) 1M. Se hicieron pequeñas mez-
2010). Éste proceso resulta de vital impor- clas de las soluciones de enzima y sustrato en
tancia para tener una certeza de la cantidad presencia de buffer, 3mL de cada una y 1,5mL
de proteína presente en el extracto y calcular de Buffer. Se adicionó a la mezcla 3mL de la
nuestro rendimiento durante la extracción, solución de ácido acético 1M con el objetivo
teniendo en cuenta la cantidad de precipita- de parar la reacción. La adición de este último
do final obtenido. El reactivo de Biuret fue componente a la primera mezcla se realizó a
fabricado por el laboratorio de sustancias y los 30 segundos, la segunda a los 60 segun-
reactivos de la Universidad de Pamplona. dos, y así sucesivamente cada medio minuto
hasta completar cuatro minutos para un total
Electroforesis de 8 muestras. Se usó una mezcla de caseína
y buffer como blanco y se midió la absor-
La electroforesis realizada se llevó a cabo bancia de cada una de las muestras a 280nm
con el objetivo de encontrar el peso molecular en un espectrofotómetro Genesys 10UV. Ya
aproximado de la proteína extraída, y poder con las medidas anteriores, se determina el
realizar una comparación con el registrado en tiempo necesario para que la reacción alcan-
la literatura, más específicamente el reporta- ce la velocidad máxima, éste se da cuando
do por Yamada, F. et al. (1975), el cual tiene las medidas de absorbancia empiezan a ser
un valor de 31000 Dalton. El procedimiento constantes. Dado este tiempo, se procedió a
realizado fue un seguimiento de un protocolo medir la influencia de la concentración del
establecido por el laboratorio de biomoléculas sustrato en la reacción; para esto se trabajó la
de la Universidad de Pamplona. misma concentración de enzima (4,5e-5 M),
ante soluciones acuosas de caseína de concen-
Actividad proteolítica tración 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5% peso a peso. Estas
medidas se hacen por supuesto, en presencia
Se trabajó una solución de enzima con del Buffer fosfato 0,1M pH 6 y deteniendo
una concentración de 4,5e-5 M. Se prepararon la reacción con ácido acético 1M. Con los
100mL de una solución acuosa de caseína α datos obtenidos se procede a determinar ma-
(MERCK CHEMICALS) al 2% en peso, la temáticamente la velocidad de reacción y la
cual teniendo en cuenta el peso molecular de constante de Michaelis-Menten del enzima,
la caseína es aproximadamente 25.000 Dalton usando el diagrama de Michaelis y algunos
(Boné, J., 2005), nos daría una concentra- métodos de linealización como Lineweaver-
ción de 8e-4 M. Lo más relevante para esta Burk, Eadie-Hofstee y Hanes-Wool.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El extracto de piña, después de ser centri- Extracción con etanol Extracción con cetona
fugado por primera vez, era mezclado con el 75% v/v 50% v/v 75% v/v 50% v/v
solvente de trabajo en relación volumétrica de 178,2mg 146,0mg 243,2mg 205,4mg
1:1. Con el segundo centrifugado se obtuvo el 1,782mg/mL 1.460mg/mL 2,432mg/mL 2,054mg/mL
primer precipitado, el cual es descartado. Este de extracto de extracto de extracto de extracto
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Tabla 2 Tabla 4
Absorbancia de muestra problema Velocidades catalíticas del enzima en cada mezcla
Tiempo en contacto con Muestra Tiempo (seg) Abs. Velocidad
Muestra Absorbancia
los 3ml de biuret
Promedio (U.O./seg)
1mL extracto + 1mL 20 minutos
0,151 Blanco -- 0 0
de agua
1 30 0,0766 2,55e-3
Según la ecuación de la recta obtenida: 2 60 0,0846 1,41e-3
y = 0,2704x + 0,0127; para cada valor de 3 90 0,0890 9,89e-4
absorbancia se tendrá una respectiva con- 4 120 0,0930 7,75e-4
centración. Puesto que la absorbancia es la 5 150 0,0986 6,57e-4
variable correspondiente al eje “y”, despe- 6 180 0,0980 5,40e-4
7 210 0,1000 4,76e-4
jamos la ecuación y obtenemos que x= (y-
8 240 0,0986 4,11e-4
0,0127)/0,2704. El valor de concentración
correspondiente a la variable “x” y teniendo
En la figura 2, se muestra como las me-
en cuenta el factor de dilución fue de 2,5573
didas de absorbancia se ven alteradas con
y una absorbancia de 0,151.
el pasar de los segundos hasta llegar a ser
constantes.
Actividad proteolítica
Tabla 3
Absorbancias de las mezclas sustrato-enzima
t´ de contacto
Muestra sin ácido Absorbancia Abs. promed
acético (seg)
Blanco -- 0 0 0 0
Figura 2. Variación de la absorbancia respecto al tiempo.
1 30 0,076 0,077 0,077 0,0766
2 60 0,085 0,084 0,085 0,0846
3 90 0,090 0,088 0,089 0,0890
Como se puede apreciar, en la figura 2, a
4 120 0,093 0,093 0,093 0,0930
medida que el tiempo avanza la absorbancia
5 150 0,100 0,098 0,098 0,0986 crece hasta llegar a alcanzar un equilibrio;
6 180 0,098 0,098 0,098 0,0980 éste se da alrededor de los tres minutos, cuan-
7 210 0,100 0,099 0,0101 0,1000 do la curva ascendente tiende a permanecer
8 240 0,099 0,099 0,098 0,0986 constante, es decir, cuando el enzima está
alcanzando su mayor índice de actividad.
De acuerdo a estos datos se calcula una velo-
Se comprobó seguidamente el pH ópti-
cidad de reacción dividiendo la absorbancia
de cada caso entre el tiempo, de esta forma mo de la bromelina; para esto se mezclaron
se halla una expresión de velocidad expresa- de nuevo 3mL de solución de caseína 8e-4M
da en unidades ópticas por segundo (U.O./ y 3mL de solución de enzima 4,5e-5 M, en
seg.). Estos valores de velocidad para cada presencia de 1,5mL de buffer fosfato 0,1M
caso se muestran en la tabla 4. de pH variable. Se tomaron las medidas con
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valores de pH desde 4 hasta 10. Se tomaron Se puede hallar la velocidad expresada
medidas de absorbancia a 280nm. Los datos en unidades ópticas por segundo dividiendo
obtenidos se muestran en la tabla 5, mientras la absorbancia entre el tiempo, que para este
en la figura 3, se muestra la relación entre la caso equivale a 180 segundos para todas las
velocidad de reacción y el pH. muestras. Estas velocidades se muestran en
la figura 4, donde se grafican las velocidades
Tabla 5
Velocidades de reacción del enzima a diferente pH en función de las concentraciones molares de
sustrato; esta gráfica nos llevará al diagrama
Velocidad
pH Abs. promedio Tiempo (seg)
(U.O./seg)
completo de Michaelis-Menten:
4 0,0981 180 5,450e-4
5 0,0988 180 5,489e-4
6 0,0994 180 5,522e-4
7 0,0993 180 5,516e-4
8 0,0993 180 5,516e-4
9 0,0988 180 5,489e-4
10 0,0986 180 5,478e-4
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CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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