Producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de cáscaras de naranja y de toronja como fuente de carbono

Aline M. Beltrán V.*, Carmen Larrondo S.*, Mauricio S. Ramírez B.*, Aseneth Ruiz C.*, Luis M. Salgado R.*
*Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Calz. Del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Del. Coyoacán, México Distrito Federal.

Resumen: Se realizó un estudio comparativo de la producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada como fuente de carbono, debido a la importancia que tienen estas enzimas en diversos campos de la industria. Se cuantificó la producción de proteínas por el método de Lowry y se determinaron los azucares reductores por el método de Miller; posteriormente se determinó la actividad enzimática para comparar la producción de pectinasas en las diferentes fuentes de carbono. De acuerdo con los datos obtenidos concluimos que la pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor producción de pectinasas por Aspergillus niger. Abstract: We conducted a comparative study for the production of pectinases by Aspergillus niger from pectin extracted from orange peel and grapefruit used as carbon source, because of the importance of this enzymes for many industries. We quantified the production of proteins by the Lowry method and reducing sugars were determined by the method of Miller, later determined to compare the enzymatic activity of pectinases production in different carbon sources. According to the data obtained, we conclude that pectin extracted from orange peel induces higher production of pectinases by Aspergillus niger.

1. Introducción La palabra pectina viene del nombre griego pectos que significa solidificado o coagulado. En 1790 Vauquelin descubrió la pectina como una sustancia soluble presente en los zumos de fruta, pero no fue hasta 1824 cuando Braconnot, quien continuó el trabajo de Vauquelin, llamó a esta sustancia ácido péctico, ya que tenía propiedades gelificantes cuando se le añadía ácido a la solución.1 Actualmente se sabe que la pectina es una mezcla amplia de

sustancias pécticas de diferente composición que contiene como componente principal ácido pectínico. La pectina en forma natural se localiza en la pared celular y puede estar entrecruzada con otros polisacáridos estructurales y proteínas para formar protopectina insoluble.1 El componente más abundante de las pectinas es el ácido galacturónico, que forma el esqueleto principal de la molécula consistente en una cadena de residuos de ácido Dgalacturónico unidos mediante enlaces

reacciones que catalizan el rompimiento de la molécula. siendo el grado de metilación variable según el origen de la pectina. queso.2 La degradación de este polímero requiere la intervención de un sistema pectinolítico compuesto por varias enzimas distribuidas en tres grupos principalmente: pectinesterasas las cuales catalizan la desesterificación de los grupos metoxilo. Las pectinasas ácidas son utilizadas en la industria de zumos de fruta y en la fabricación de vinos. esterificados en el C-6 con alcohol metílico. Tanto la actividad como los mecanismos que controlan su síntesis y su secreción están bajo la influencia de diversos factores ambientales. Se realizó una extracción ácida de pectina a cada muestra agregando agua destilada en ebullición hasta hidratarla.3 Las pectinasas actúan de manera sinérgica y secuencial. así como en la fabricación de productos espumantes. principalmente en el enriado de lino y en el procesado de fibras de plantas.4 Las pectinasas figuran entre las enzimas de aplicación industrial más antiguas. además de HCl 6N hasta alcanzar un pH de 2 y se hirvió durante 15 min. son secretadas en grandes cantidades por hongos filamentosos. Se filtró y con el residuo se repitió el proceso 2 veces más y por último se lavó con agua a . Las enzimas que se utilizan en estos sectores proceden mayoritariamente de bacterias. pueden clasificarse en dos grandes grupos: ácidas y alcalinas. de los que destacan los del género Aspergillus. helados. y en la industria de los plásticos.α . salsas. pectina despolimerasas que rompen los enlaces α – (1 – 4) glucosídicos por hidrólisis (polimetilgalacturonasas y poligalacturonasas) o transeliminación (pectina y pectato liasas). como la farmacéutica.1 Preparación de la muestra Se pesaron 50 g de albedo de naranja y 50 g de albedo de toronja. Generalmente la ramnosa forma parte de la cadena principal. La pectina también contiene con frecuencia residuos de ramnosa. arabinosa y galactosa. Estos residuos pueden estar parcialmente metilados. la temperatura de incubación y la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono. Son mayoritariamente poligalacturonasas de origen fúngico. tales como el pH del medio. niger. También se emplean en otras industrias. destacando entre ellas las producidas por Bacillus. 2. Material y métodos 2. que requieren modificar la viscosidad de sus productos. especialmente de A.1 Estas pectinas son ingredientes muy importantes en la industria de los alimentos para hacer gelatinas.(1 – 4). Las pectinasas alcalinas se han introducido en diversos procesos industriales. mientras que la arabinosa y la galactosa se encuentran en las cadenas laterales unidas a la cadena principal formando ramificaciones.1 El objetivo de este trabajo es producir pectinasas por Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada como fuente de carbono. como agente de clarificación y aglutinante. como el textil.

2. Esto se llevo a cabo utilizando el método de Lowry9.5 Determinación de proteínas La cuantificación de proteínas se tomó en cuenta para evaluar la producción de enzimas pectinolíticas. se realizó una dilución 2:100 para que el tamaño del inóculo fuera el conveniente (106 esporas/mL).2.6 Por último. 2. La pectina resultante se filtró y se secó a 40°C. para lo cual fue necesario realizar una curva estándar de albúmina cuyo rango de concentración fue desde 0 µg hasta 100 µg por mL. 5 g/L de (NH4)2SO4 y 10 g/L de la fuente de carbono correspondiente. tomando muestras de 6 mL de cada cultivo cada 24 h. extracto de albedo de naranja y extracto de albedo de toronja) cuya composición fue la siguiente: 2 g/L de K2HPO4.2 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer La muestra se homogenizó por medio de agitación y se colocó con una jeringa estéril entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara y se observó al microscopio con el objetivo de 10x localizando la zona cuadriculada y se contaron las esporas presentes en dicha cuadrícula con ayuda de un cuentacolonias. Finalmente se agregó un volumen de etanol equivalente al volumen total de los filtrados anteriores. ya teniendo la concentración de esporas en la solución. 2.ebullición.1 Extracción de las esporas de un medio sólido Se agregó solución salina y perlas de vidrio a la caja de Petri que contenía las esporas y se agitó suavemente hasta suspender las esporas.2. 2.*5 2. posteriormente se utilizó el mismo método para determinar los azúcares reductores presentes en el sobrenadante de las muestras problema.3 Fermentación Se prepararon 100 mL de medio de cultivo basal para cada muestra de pectina (pectina comercial. las cuales se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 min y el sobrenadante se guardó en refrigeración para realizar pruebas posteriores. 2 g/L de KH2PO4. dejando reposar 2h para precipitar la pectina. Posteriormente se inoculó con 1 mL de la suspensión de esporas cada uno de los matraces y se incubaron a 37°C con agitación de 250 rpm durante 72 h*7.4 Determinación reductores de azúcares Para determinar azúcares reductores en las muestras del cultivo de fermentación se realizó previamente una curva estándar de azúcares la cual contempló concentraciones de 0 µg hasta 1000 µg de glucosa por mL y se le determinaron azúcares reductores utilizando el método de Miller8. Se tomó 1 mL de esta suspensión y se llevó a cuenta directa.2 Cuantificación de esporas en el inóculo 2. después se aplicó el método de Lowry para determinar proteínas en el sobrenadante de las muestras problema. .

1 Curva reductores.5 ml de extracto enzimático.2.2 Curva estándar de proteínas La ecuación obtenida a partir de esta curva estándar se utilizó para calcular la cantidad de proteínas presentes en las muestras problema. . *La actividad exopectinasas se expresa como mg de azúcares reductores liberados/mL de extracto. blanco sustrato (0.5 ml de buffer de acetatos al 0. 0.5 ml de solución al 0. blanco enzima (0. 0.5 ml de agua). estándar de azúcares 3.5 ml de buffer de acetatos al 0.9% de pectina). por lo cual el microorganismo produjo proteínas necesarias para seguir degradando la pectina.9% de pectina).5 ml de buffer de acetatos al 0.3 Pectina Con la curva estándar se obtuvo la ecuación de la recta. 3.5 ml de extracto enzimático.1M y 0.5 ml de medio. En las gráficas se observa que en las primeras 24 horas el microorganismo produjo enzimas suficientes para degradar el sustrato. 0. con la cual se determinó la concentración de azúcares reductores en cada muestra problema. 3. Después de 48 horas se observa un consumo importante de azúcares reductores. Después se determinaron los azucares reductores liberados por el método de DNS. Resultados y discusión 3.6 Determinación de la actividad enzimática Se prepararon dos muestras de: blanco problema (0.5 ml de solución al 0.1M y 0.1M y 0. Posteriormente uno de cada uno de los blancos se incubó durante 30 minutos a 45°C y los otros se refrigeraron.

3. sin embargo entre las 24 y 48 horas es probable que el sustrato se haya terminado.5 Naranja Analizando las gráficas. por lo que la producción de proteínas bajó drásticamente.6 Actividad enzimática . durante las primeras 24 horas el microorganismo aparentemente utilizó azúcares reductores presentes en el extracto obtenido que fueron más accesibles que la pectina. A las 48 horas consumió gran parte del sustrato. por esto. por lo que se observa un aumento en la concentración de azúcares reductores. a partir de las 48 horas esta primera fuente de carbono se agotó y empezó a consumir la pectina extraída de la naranja. 3. produjo más enzimas en busca de metabolizar otra fuente de energía. Como se observa en las gráficas. en un principio el microorganismo produjo las enzimas necesarias para empezar a degradar el sustrato.4 Toronja 3. es por esto que se observa un incremento en la producción de proteínas y azúcares reductores.

Departamento de biotecnología. 4. Proceso para producir pectinas cítricas. se observa que el extracto de naranja indujo una actividad enzimática semejante a ésta. 3. Devia J.. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.67 7. Facultad de Biología. Análisis de sistemas pectinolíticos bacterianos. Conclusiones  Es posible que Aspergillus niger produzca pectinasas utilizando como fuente de carbono pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja. 2004. pp. genomic organization and mRNA expression of a pectin lyase gene from a mutant strain of Penicillium occitanis. Pela de Paenibacillus sp. Devia J.  La pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor actividad enzimática que la extraída de la cáscara de toronja. Universidad EAFIT. y Aguilar-Osorio.. Laboratorio de catálisis enzimática. BP-23 e YvpA de Bacillus subtillis... 5. Martínez-Trujillo. Medellín. 2006.. Proceso para producir pectinas cítricas. Aislamiento y caracterización de las pectinasas. García-Rivero. Aquiahuatl-Ramos M. Cloning. Martínez-Trujillo M. pp. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. 24. Medellín. Colombia.: 54. Universidad EAFIT. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción de pectinasas y ramnoglacturonasas por 2 cepas autóctonas de Aspergillus. pp. 4.. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. pp. mientras que en el extracto de toronja es menor. Pérez-Chabela M. García-Rivero M.Al tomar la pectina como nuestra fuente de carbono de referencia. pp. 8-40.. M. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción de pectinasas y ramnogalacturonasas por dos cepas autóctonas de Aspergillus. 2003. y Aguilar-Osorio G.A. 6.: 1. Postgrado de Ingeniería Bioquímica. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec.. L. Referencias 1. 22. Trigui-Lahiani H. Soriano M. Departamento de Microbiología. España. 2007. Pérez-Vargas. G. Arreguín-Rangel L. México. Colombia. 2007. 2003. J. Laboratorio de Catálisis Enzimática. Arreguín-Rangel. Gene Section Functional Genomics. México. pp. México. Universidad de Barcelona. . Gargouri A.. M. 2004. Pérez-Vargas J. 2.

Protein measurement with the folin phenol reagent. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.L. Lowry OH. G. (1959). Farr AL y Randall RJ (1951).8. 9. Miller. Journal Biological Chemistry 193: 265-273 . Rosebrough NL. Analytical Chemistry 31: 426-428.