GUÍA DE APRENDIZAJE

SEMANA N° 09

CURSO: BACTERIOLOGÍA
DOCENTE: Christian Alexander Rivera Salazar

Jaén – Perú, MAYO 2022

ÍNDICE

Pág.
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3

2. CONTENIDO TEMÁTICO .................................................................................................. 3

3. DESARROLLO .................................................................................................................... 3

4. ACTIVIDADES Y EVALUACIÓN ................................................................................... 10

Actividad 1 .............................................................................................................................. 10

5. GLOSARIO ......................................................................................................................... 11

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 11

1. INTRODUCCIÓN

Staphylococcus es un género bacteriano gram positivos, en forma circular, siendo las de

importancia clínica S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis. S. aureus es patógeno por
excelencia y responsable de intoxicaciones alimentarias y otras infecciones, S. saprophyticus no
es patógeno y causante de infecciones del tracto urinario en personas inmunocomprometidas y
S. epidermidis responsable de infecciones relacionadas con dispositivos intrahospitalarios.
El diagnóstico laboratorial a partir de las muestras biológicas y su respectivo antibiograma es de
suma importancia para el tratamiento y prevención de estas infecciones estafilocócicas, siendo
importante la participación del profesional Tecnólogo Médico.

2. CONTENIDO TEMÁTICO

Características generales

Factores de virulencia

Aislamiento e identificación

3. DESARROLLO

3.1Características microbiológicas

El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro de
0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas. Ogston1 introdujo el nombre de Staphylococcus, del griego
staphyle que significa racimo de uvas, para describir a los cocos responsables de
inflamación y supuración. Son bacterias no móviles, no esporuladas, no poseen cápsula,
aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias
facultativas. La mayoría de los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de
desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se utiliza
para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus
que son catalasa negativos 1,2.

Los estafilococos fueron clasificados inicialmente en un género común en la familia

Micrococacea además de los géneros Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus. Sin
embargo, en estudios recientes se observaron diferencias con estos géneros, una de las
principales es la cantidad de guanina-citocina (G+C de 30 a 39%), mientras que los
Micrococcus tienen un contenido mayor de G+C de 63 a 73%. Los estudios de homología
genética, secuenciación del DNA, hibridación DNA-rRNA, y la secuenciación
comparativa del RNAr 16S, han permitido demostrar que los géneros Staphylococcus y
Micrococcus están poco relacionados. Por otro lado, la pared celular de los estafilococos
tienen unidos los ácidos teicoicos, los cuales no existen en los micrococos; otra diferencia
es la composición del citocromo y menaquinona de la cadena respiratoria presentes en los
estafilococos 1,2,3.

Estudios recientes demuestran que el género Staphylococcus se encuentra más cercano a

los géneros Bacillus y Streptococcus. El género Staphylococcus contiene 32 especies, de
las cuales 16 de ellas se localizan en los humanos, algunas forman parte de la microbiota
de piel y mucosas en humanos, y otras se encuentran sólo entre la flora de otros mamíferos
y aves. Algunas de estas especies son patógenas cuando existe predisposición e
inmunosupresión en el huésped o en presencia de cuerpos extraños. Por lo general, cada
especie tiende a ocupar una localización anatómica específica en el huésped que coloniza.
Entre las especies que colonizan al humano, las de mayor importancia clínica son: S.
aureus y Staphylococcus lugdunensis; en tanto que en animales se encuentra además de
S. aureus a Staphylococcus intermedius. 12,13 El Staphylococcus epidermidis y el
Staphylococcus saprophyticus son comúnmente responsables de infecciones relacionadas
con dispositivos e infecciones del tracto urinario, siendo éstos menos infecciosos que S.
aureus 4,5.

3.2 Factores de virulencia

a.- Polisacárido capsulares: Algunas cepas de S. aureus producen un exopolisacárido

que puede impedir la ingestión del microorganismo por las células polimorfonucleares
(evita el proceso de la fagocitosis)6.
b.- Peptidoglucano y ácido teicoicos: Las paredes celulares de S. aureus contienen
peptidoglucanos (entrecruzamiento de polímeros de TV-acetil glucosomina y acido W-
acetil muramico). que son similares a los encontrados en otras bacterias grampositivas, y
acidos teicoicos, que son polímeros de fosfato de ribitol (monosacárido de 5 carbonos)
(vease cap. 5). Los acidos teicoicos actuan en la adherencia especifica de las bacterias
grampositivas a las superficies mucosas. Además de proveer rigidez y elasticidad a la
membrana celular estafilocócica 7.
C.-Proteína A: La pared celular de S. aureus también contiene una proteína llamada
proteína A. La proteína A purificada tiene un peso molecular de 42 kDa y se encuentra
en la superficie celular y en el medio de cultivo. Esta proteína particular tiene la capacidad
de unirse a la región Fe de todas las subclases de IgG humanas excepto IgGr 110 La
proteína A funciona como un factor de virulencia porque interfiere en la opsonización e
ingestión de los microorganismos llevada a cabo por los leucocitos polimorfonucleares 8.
D.-Coagulasa : Enzima que puede existir en forma libre en el medio o unida a la célula, se une a
la protrombina y la vuelve enzimáticamente activa con lo que cataliza la conversión de
fibrinógeno en fibrina 9. Esta actividad enzimatica puede actuar para cubrir las celulas bacterianas
con fibrina, haciendolas más resistentes a la opsonizacion y la fagocitosis.
E.- La catalasa. La producción de catalasa por estos microorganismos puede funcionar para
inactivar el peróxido de hidrogeno y los radicales libres tóxicos formados por el sistema de la
mieloperoxidasa dentro de las células fagocíticas después de la ingestión de los microorganismos
10
.
F.-Fibrinolisisna e Hialuronidadas: Las fibrinolisinas rompen los coágulos de fibrina y
facilitan la diseminación de la infección a tejidos contiguos. De modo similar, la hialuronidasa
hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacáridos ácidos en el tejido y, puede actuar así para
diseminar los microorganismos a áreas adyacentes en los tejidos 11.
G.- Lipasas: lipasas potentes que pueden ayudar a diseminar los microorganismos en los tejidos
cutáneo y subcutáneo 11.
H.- Nucleasa o fosfodiesterasa: Actúan sobre los enlaces fosfodiester de las moléculas de AD y
ARN.
I.- Enzimas betalactamasas: Actúan sobre el anillo betalactámico de penicilina y ampicilina.
J.- α Hemolisinas: La a-hemolisina tiene efectos letales sobre una gran variedad de tipos
celulares, incluidos los leucocitos polimorfonucleares y lisan eritrocitos de varias especies
animales. La toxina es una proteína con un peso molecular de 33 kDa y es segregada en el medio
de cultivo durante el crecimiento logarítmico tardío. Los monómeros individuales interactúan en
la membrana de la célula diana para formar heptámeros cilíndricos con un poro central.458 Los
poros abiertos por estos agregados heptaméricos de a-hemolisina permiten la salida rápida de
iones de potasio y de otras moléculas pequeñas y el ingreso de iones de sodio y calcio, lo que
conduce a la tumefacción osmótica y a la rotura de la célula, es dermanecrótica 12,13.
K.-β Hemolisina: Producida solamente por cepas de animales y sólo un 20 % de células humanas.
Es una esfingomielinasa. Destruye glóbulos rojos de carnero pero no de conejo a 37°C.
L.-Leucocidina: Causa desgranulación (formación de poro a nivel de la membrana celular) de
los leucocitos de los polimorfonucleares de humano y conejo y también de los macrófagos a esto
se le llama factor antifagocítico, inhibe la fagocitosis y es antigénica14.
M.-Exfoliatina: Estas proteínas tienen actividad proteolítica y disuelven la matriz de
mucopolisacaridos de la epidermis, lo que conduce a la rotura intraepitelial de conexiones
celulares en el estrato granuloso. Las cepas que producen una o ambas toxinas son responsables
del "‘estafilococico de la piel escaldada” 15.
N.- Enterotoxinas: Las enterotoxinas A hasta E, H e I son moléculas termoestables responsables
de las características clínicas de la intoxicación alimentaria estafilocócica. Probablemente la causa
más común de intoxicación por alimentos en los Estados Unidos. El modo exacto de acción de
estas enterotoxinas se desconoce, pero se ha demostrado un aumento del peristaltismo intestinal.
La ingestión de enterotoxinas preformadas en alimentos contaminados con desarrollo
estafilocócico (p. ej., artículos de panadería, flanes, ensalada de patatas, carnes procesadas,
helados) provoca vómitos con diarrea o sin ella dentro de las 2 a 8 horas. Estas afecciones toxicas
se autolimitan (24-48 horas) y solo requieren terapia de mantenimiento. Los cambios
inflamatorios (hiperemia mucosa, infiltrantes por neutrófilos, exudados mucopurulentos
duodenales, lesión del ribete en cepillo) se observan en todo el tubo digestivo; las lesiones más
graves y extendidas se encuentran en el estómago y en los segmentos altos del intestino delgado
16,17.

3.3 Díagnóstico y aislamiento

Los datos clínicos y epidemiológicos son fundamentales para orientar el diagnóstico
microbiológico, así como la sospecha del agente etiológico causante de la infección, por lo que
se requiere del aislamiento y la identificación de S. aureus a partir de muestras clínicas. Entre
dichas muestras se encuentra en la sangre, tejidos, líquidos normalmente estériles, aspirados de
abscesos, las cuales al ser teñidas con la tinción de Gram permiten observar la forma y agrupación,
así como una respuesta inflamatoria con la presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Medios de aislamiento
En los medios de cultivo tradicionales la mayoría de las especies crecen después de incubarse
durante 18-24 horas, formando colonias de 0.5-1.5 mm de diámetro. Las colonias de S. aureus se
observan lisas, elevadas, brillantes y de bordes enteros, presentan consistencia cremosa y
pigmentación que va del amarillo a dorado debido a la producción de carotenoides, la mayoría de
las cepas producen β-hemólisis o hemólisis total alrededor de las colonias cuando se cultivan en
agar sangre. S. aureus se diferencia de las demás especies por producir coagulasa que se
manifiesta por su capacidad para coagular el plasma, es resistente al calor, a la desecación y puede
crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7.5%).
S. aureus crece bien en medios de cultivos no selectivos, como el agar sangre, agar chocolate,
cerebro corazón infusión agar (BHI, por sus siglas en inglés) y medios líquidos para hemocultivo
donde se recupera fácilmente. Se debe usar un medio selectivo en muestras clínicas donde hay
bacterias Gram negativas junto con S. aureus. El medio recomendable y usado por la mayoría de
los laboratorios es el agar sal manitol o medio de Chapman por su elevado contenido de sal que
inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram negativas. Este medio permite realizar
la identificación presuntiva de S. aureus por la pigmentación amarilla característica de S. aureus.
Debido a que esta bacteria fermenta el manitol se genera un cambio de color en el medio que vira
de rojo pálido a amarillo. Los Staphylococcus coagulasa negativos no fermentan el manitol y
crecen en el medio formando colonias pequeñas de color que varía de blanco a rosado 18,19.
Condiciones generales
Según el Manual de procedimientos bacteriológicos de infecciones intrahospitalarias se tieen que
tener en cuenta lo siguiente:
a) La primera consideración práctica a tomar en cuenta es determinar, si un aislamiento es
estafilococo, estreptococo o enterococo.
Esta diferenciación se realiza basándose en la morfología de la colonia, tipo de hemólisis, forma
de las bacterias por coloración Gram a partir de un cultivo y de la prueba de reacción de la catalasa.
b) Las colonias de estafilococos son comúnmente grandes (2 mm a 3 mm a las 24 horas),
convexas, lisas, enteras, opacas y con frecuencia pigmentadas, a diferencia de las colonias de
estreptococos y enterococos que son más pequeñas (menos de 2 mm de diámetro), puntiformes,
con aspecto translúcido a semiopaco.
c) Los estafilococos pueden ser fuertemente β hemolíticos en agar sangre de carnero, pero las
zonas de hemólisis son menores en relación al tamaño de las colonias que las generadas por los
enterococos y estreptococos hemolíticos.
d) Los estafilococos se agrupan generalmente en racimos, a diferencia de los estreptococos y
enterococos que se reúnen en pares o cadenas.
Identificación de estafilococos
Lectura de cultivos en agar sangre de carnero y agar Columbia (CNA) – sangre
a) Morfología de las colonias
Las colonias de la mayoría de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden
aproximadamente de 1 a 3 mm de diámetro a las 24 horas. Si las placas se siguen incubando tres
días a 34 – 37 °C las colonias pueden medir de 3 – 8 mm dependiendo de las especies.
Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, éstas siguen desarrollando si
se deja en incubación por unos días más. Son de borde entero, de superficie lisa, la mayoría de
ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo crema hasta el naranja.
Las colonias de Staphylococcus epidermidis son algo más pequeñas dependiendo de las cepas,
usualmente no se detecta pigmentos. Las colonias de Staphylococcus saprophyticus son más
grandes que S. epidermidis, son lustrosas y más convexas que otras colonias de estafilococos. Un
50% de las cepas son pigmentadas.
b) Coloración Gram
Hacer una coloración Gram de las colonias sospechosas y observar al microscopio. Aplicar el
procedimiento descrito en el anexo B, método de coloración Gram. Si se observan cocos
Gram positivos en racimos, realizar la prueba de la catalasa.
c) Prueba de la catalasa
Determina la presencia de la enzima catalasa, esta enzima descompone el peróxido de hidrógeno
en agua y oxígeno .
Reactivo
Peróxido de hidrógeno al 3%
Procedimiento
Con el asa de siembra, recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocarla sobre
un portaobjetos limpio.
Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta Pasteur.
No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2.
Observar una inmediata efervescencia (formación de burbujas) que indica una prueba positiva, de
lo contrario se considera la prueba negativa.
Desechar el portaobjeto colocándolo en un desinfectante.
Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles:
–Control positivo: S. aureus.
–Control negativo: Streptococcus spp.
No invertir el orden del método porque puede producir resultados falsos positivos.
Si son catalasa positivas determinar primero si el organismo es o no Staphylococcus aureus, para
ello se realiza la prueba de la coagulasa.
d) Prueba de la coagulasa
• Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por acción de la
enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación del plasma. El resultado final es
la formación de un coágulo de fibrina.
– Prueba en lámina (detecta factor de aglutinación o coagulasa ligada).
– Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada).
• La prueba de coagulasa en tubo es definitiva, y la prueba de coagulasa en lámina puede ser usada
como una técnica de tamizaje rápida para la identificación de S. aureus. Todas las pruebas
negativas en lámina deben repetirse utilizando la técnica en tubo.
Reactivo
Plasma liofilizado de conejo. (Reconstituir de acuerdo con las instrucciones del fabricante.)
Nota: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido cuidadosamente probado de
no contener algún agente infeccioso, capacidad de coagulación e inhibidores.
Controles
Positivo: S. aureus.
Negativo: S. epidermidis o S. saprophyticus.
Prueba en lámina
La prueba de la coagulasa en lámina es un método únicamente presuntivo. Por esa razón todos
los resultados negativos o retardados (más de 20 segundos) deben ser confirmados por la prueba
en tubo.
Procedimiento
• Preparar una suspensión densa de la colonia en agua destilada o solución fisiológica mezclando
bien para homogeneizar.
Si hubiera autoaglutinación, no continuar y realizar la prueba en tubo.
Agregar una gota de plasma y mezclar con movimientos circulares.
Observar la formación de aglutinación o precipitado dentro de 20 segundos.
Todas las pruebas negativas y positivas retardadas (20 a 60 segundos) deben confirmarse con la
prueba en tubo.
Nota: Es una prueba bastante rápida y económica, pero si hubiese de 10 a 15% de S. aureus puede
dar un resultado negativo, por ello, todos los resultados negativos deben repetirse utilizando la
técnica en tubo.
Prueba en tubo
Procedimiento
Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de plasma reconstituido (en un
tubo de vidrio estéril de 13 x 100).
Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar.
Incubar la mezcla a 35 – 37 °C (en baño maría de preferencia) por 4 horas; observar si hay
formación de coágulo inclinando lentamente el tubo.
Observar cuidadosamente si hay formación de coágulo inclinando lentamente el tubo (sin agitar)
en intervalos de hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulación es una prueba positiva.
La mayoría de los S. aureus formarán coágulo en una hora. • Si es negativa a las 4 horas, seguir
incubando hasta el día siguiente a temperatura ambiente. Esto es recomendado porque un pequeño
número de cepas de S. aureus puede requerir más de cuatro horas para la formación del coágulo.
Considerar que Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el coágulo.
Realizar el control de calidad del reactivo utilizando las pruebas de resistencia a la polimixina B
y novobiocina (disco de 5 ug) para tener una identificación presuntiva. S. saprophyticus es
resistente a la novobiocina y S. epidermidis es resistente a la polimixina B.

Figura 1 Colonias de Staphylococcus aureus(INS20)

Figura 2 Prueba de la catalasa (INS20)

Figura 3 Prueba de la coagulasa (INS20)

4. ACTIVIDADES Y EVALUACIÓN

Actividad 1

En relación a la temática desarrollada, proponga usted un esquema de aislamiento para

Staphylococcus aureus a partir de muestras de hisopado faríngeo
Evaluación
Se utilizará la siguiente rúbrica para evaluar el análisis escrito:

RÚBRICA

CALIFICACIÓN
 CRITERIO / Muy bueno Bueno (4) Regular Malo (2) Calificació
DEFINICIÓN (5) (3) n (1)
Síntesis: capacidad para
expresar lo penado
utilizando la menor
cantidad de palabras
posibles
Redacción: Coherencia en
la idea(s) expuesta(s)
Claridad :precisión de la
idea(s) expuesta(s)
Novedad: Carácter
innovador de la idea(s)
expuesta(s)

5. GLOSARIO

Aislamiento: Desarrollo de microorganismos a partir de una muestra clínica.

Bacteria: Microorganismo unicelular microscópico perteneciente a los procariontes que se

multiplica por fisión binaria y carece de clorofila. Se diferencian por la coloración de Gram.
Incubación: Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo
y multiplicación.
Infección intrahospitalaria (IIH): Infección que se adquiere luego de 48 horas de permanecer
en el establecimiento de salud y que el paciente no portaba a su ingreso. Se consideran también a
aquellos procesos infecciosos que ocurren hasta 30 días luego del alta.
Medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento y
multiplicación de las bacterias in vitro, que puede encontrarse en estado sólido, semisólido o
líquido.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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