Instituto Tecnolgico de Acapulco

Departamento de Ingeniera Qumica y Bioqumica.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
DISEO EXPERIMENTAL: Prctica #5
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM
POSITIVOS

Microbiologa
General B

AGOSTO DICIEMBRE 2017

Alumna: Rodrguez Hermenegildo Cynthia Guadalupe 13320055
Instructor: M. C. Miguel ngel Daz Alday

FECHA DE ENTREGA: 30-SEPTIEMBRE-2017

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NDICE.

Objetivo..... 2

Introduccin......3

Conclusiones...14

Bibliografa...15

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Objetivos

Describir y localizar las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms relevantes

de las especies de Staphylococcusspp y Streptococcus spp de mayor importancia.

Realizar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa
microscpica, afinidad tintorial y agrupaci

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GENERO: STAPHYLOCOCCUS.
Introduccin.

Los Estafilococos pertenecen a Familia Micricococcaceae y son organismos redondos u ovales,

agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados y Gampositivos en los
cutivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forunculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus,
S. epidermidis y S. saprophyticus, solo dos tienen importancia medica. Solo la especie patgena
S. aureus produce una enzima llamada coagulasa.

Marco Terico.

Este gnero Estafilococos pertenece a la familia Staphylococacceae, orden Bacillales, clase Bacilli,
Phylum Firmicutes. Dentro del gnero Staphylococcus hay 55 especies y subespecies, siendo las
ms importantes desde el punto de vista clnico las siguientes:
Staphylococcus aureus subsp. Aureus.
Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus saprophyticus subsp. Saprophyticus.
El microorganismo ms importante por su patogenicidad es Staphylococcus aureus, que se
caracteriza por poseer una enzima que coagula el plasma: la coagulasa. Esta prueba permite
distinguir a S. aureus del resto de especies de estafilococos que aparecen clnicamente, que no
poseen dicho enzima.
Los estafilococos de inters en patologa humana que no pertenecen a ninguna de las especies
anteriores se informan en el laboratorio como estafilococos coagulasa negativos (SCN) y
aunque son colonizadores habituales del ser humano no producen enfermedad tan importante
como los anteriores.
Patgenos comunes:
S. haemolyticus.
S. lugdunensis.

Patgenos infrecuentes:
S. capitis
S. saccharolyticus
S. hominis
S. warneri
S. auricularis
S. cohnii
Algunas especies de gneros diferentes, anteriormente relacionados taxonmicamente, como
Micrococcus luteus o Kocuria rosea, que raramente producen infecciones en humanos, tienen
caractersticas fenotpicas muy similares desde el punto de vista morfolgico y bioqumico a los
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estafilococos, por lo que conviene saber diferenciar ambas especies de las del gnero
Staphylococcus.
CARACTERSTICAS MICROSCPICAS Y DE TINCIN.
Las bacterias pertenecientes a esta especie son cocos, con forma casi esfrica. Forman masas
arracimadas, vindose como bacterias Gram positivas. No tienen flagelos, no forman esporas y
excepcionalmente pueden tener cpsula. En los cultivos viejos los estafilococos pueden aparecer
como bacterias Gram negativas.
CARACTERSTICAS DE CULTIVO. .
Son poco exigentes en sus necesidades; crecen bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen
mejor en los medios enriquecidos. Son aerobios y anaerobios facultativos, con una temperatura
ptima de crecimiento entre 30-37C.
Una particularidad de los miembros de este gnero es que crecen en medios con una elevada
concentracin de ClNa que no soportan el resto de los microorganismos (son bacterias halfilas).
Esto permite la creacin de medios de cultivo casi especficos para los estafilococos. Las colonias
son visibles fcilmente, sobre todo en agar sangre, con forma redonda y aplanada, bordes netos,
superficie lisa y brillante, consistencia variable y en algunas ocasiones, hemolticas. Algunas cepas
pueden producir un pigmento carotenoide que les da una coloracin amarillenta (S. aureus). La
produccin de este pigmento es mucho ms evidente en agar chocolate o a temperatura ambiente.
En caso de partir de una muestra con flora polimicrobiana, ser conveniente utilizar medios
diferenciales o inhibidores que nos permitan evitar el crecimiento de aquellos microorganismos no
deseados, o visualizar mejor las colonias de S. aureus cuando stas aparezcan en el medio.

Entre los medios especficos para su recuperacin tenemos el medio de Chapman, que posee
manitol y una alta concentracin de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros
microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH cido al
medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un
color amarillo sobre un fondo rosado.
MEDIO DE BAIRD-PARKER:
Permite el crecimiento de estafilococos y otros grmenes Gram positivos, presentndose las
colonias de S. aureus negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un halo brillante de 2 a 5 mm de
dimetro.
AGAR SANGRE:
Con inhibidores (Acido Nalidxico) tambin se utiliza para la recuperacin de este
microorganismo, apareciendo las colonias de la misma manera que lo hacen en agar sangre. En
C.L.E.D. las colonias de S. aureus aparecen con una coloracin amarillenta no debida a la
pigmentacin, sino a la fermentacin de la lactosa que lleva incorporada el medio y al cambio de
color del indicador.
AGAR DNASA:
Contiene DNA, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en
bacterias. S. aureus producir una lisis del DNA presente en la placa si posee este enzima, con el
consiguiente aclaramiento del medio.

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PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN DEL GNERO

STAPHYLOCOCCUS.
Adems de la tincin de Gram, que debe mostrar un frotis con cocos Gram positivos, arracimados,
existen otras pruebas que nos van a permitir identificar correctamente a los miembros del gnero
Staphylococcus. La distincin fundamental debemos hacerla con aquellas bacterias que muestren
unas caractersticas morfolgicas y de tincin semejantes, como son Micrococcus, Kocuria,
Streptococcus y Enterococcus.

Las dos pruebas ms importantes para poder discernir entre los gneros aludidos anteriormente
son:

CATALASA: La prueba de la catalasa se utiliza para diferenciar microorganismos procedentes de

cultivos en los que, al hacer una tincin de Gram, se observan cocos Gram positivos. La prueba de
la catalasa es positiva para los gneros Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria y negativa para
Streptococcus y Enterococcus, que morfolgica y tintorialmente pueden aparecer de forma similar.

LISOSTAFINA: La lisostafina es un enzima que rompe la pared de Staphylococcus y no tiene

accin sobre Micrococcus / Kocuria; por esta razn se utiliza para diferenciar estos gneros. En
presencia de lisostafina, una suspensin (turbia) de estafilococos acabar lisndose, y por lo tanto
perder esa turbidez inicial. La lisostafina, al no ejercer ningn efecto sobre Micrococcus / Kocuria;
mantendr la misma turbidez que originalmente tena la suspensin.

ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR LOS ESTAFILOCOCOS.

Los estafilococos son parte de la flora bacteriana normal de piel, mucosas y tracto respiratorio
superior. Sin embargo en determinadas ocasiones son capaces de lesionar gravemente al husped
dando lugar a diversos cuadros infecciosos, entre los cuales destacan:
Absceso cutneo: foco localizado de infeccin en la piel,
Sndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ),
Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco drmico,
Endocarditis: infeccin de vlvulas cardiacas,
Osteomielitis: infeccin del hueso,
Neumona: 2 a gripe o a bacteriemia,
Infecciones urinarias: ms frecuentes en mujeres,
Conjuntivitis: infeccin de la conjuntiva, y
Sndrome del shock txico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes.

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Las toxinas estafiloccicas responsables de la mayor parte de los efectos perjudiciales de estos
grmenes sobre el husped son:
Hemolisinas y leucocidina (actan sobre clulas sanguneas)
Enterotoxinas (responsables de las toxiinfecciones alimentarias)
Exfoliatina (responsable del sndrome de piel escaldada)
Exotoxinas pirgenas (productoras de hipertermia)
Enzimas estafiloccicas: Coagulasa, hialuronidasa y estafiloquinasa.

La inmunidad que dejan las infecciones estafiloccicas es generalmente escasa y poco duradera.

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ESTAFILOCOCOS.

En general, los estafilococos son microorganismos bastante sensibles a la mayora de los
antimicrobianos tradicionales. Sin embargo la aparicin de resistencia ante un antibitico parece
extenderse a todos los dems, resultando algunas cepas resistentes a la mayora de los
antimicrobianos utilizados. La presencia de un enzima -lactamasa (codificada y trasmitida
mediante plsmidos), condiciona la resistencia de estos microorganismos a todos los antibiticos
beta lactmicos (penicilina y derivados). La aparicin de penicilinas que resistan la accin de las
beta lactamasas, como oxacilina o meticilina, pareci solucionar el grave problema que
representaba la inutilidad teraputica de la penicilina G. En la actualidad se utilizan sustancias no
antibiticas que se unen irreversiblemente a las betalactamasas impidiendo su accin posterior.
Son el cido clavulnico y el sulbactam. En estos ltimos aos ha aparecido en Espaa un aumento
de resistencia de los estafilococos a la meticilina, considerndose un grave problema a nivel
hospitalario. Estas cepas se denominan MRSA (Staphylococcus aureus meticilin resistentes).
Antibiticos tradicionales tales como vancomicina o lincomicina siguen siendo buenas opciones
para el tratamiento de las infecciones producidas por estos microorganismos. Sin embargo nuevas
molculas como roxitromicina o teicoplanina aparecen para aliviar la presin que sufren los
hospitales ante este aumento de resistencias a los antibiticos comnmente utilizados.

El siguiente cuadro resume la susceptibilidad actual de S. aureus a los antimicrobianos ms

importantes:

Resistencia: <10%. Resistencia: VARIABLE Resistencia: > 90%

Oxacilina Penicilina
Clindamicina Eritromicina
Ampicilina
Vancomicina Tetraciclina
Aztreonam
Imipenem Cefalosporinas
Ciprofloxacino Meticilina
Gentamicina
Amikacina
Cloranfenicol

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GENERO: STREPTOCOCCUS
Introduccin.
El genero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de
Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S.
canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo).
Con la coloracin de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos
son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del
cuerpo y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite
diferenciar algunas especies en base a ala hemolisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,
los globulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente daados pero no lisados como sucede
en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un
derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El
grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus
pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxigeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la
diferenciacin de las especies de Streptococcus.

Marco Terico:

El gnero Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos grampositivos

pertenecientes al filo firmicutes y al grupo de las bacterias cido lcticas. Estas bacterias crecen en
cadenas o pares, donde cada divisin celular ocurre a lo largo de un eje. De all que su nombre, del
Griego streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena.

Los Streptococci son oxidasa y catalasanegativos.

Las especies de estreptococus que producen enfermedades son:

Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e imptigo.
Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y
trastornos del embarazo en la mujer.
Neumococo: Streptococcus pneumoniae, es la principal causa de neumona adquirida en la
comunidad.
Streptococcus viridans: es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales.
Streptococcus mutans: causa importante de caries dental. Pertenece al grupo
de estreptococos viridans.
Algunas especies de los grupos C y G tienen en su pared la protena G, que, por su capacidad de
unin a anticuerpos, tiene importantes aplicaciones en biotecnologa.

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Caractersticas.
La mayora de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos crecen
nicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono (crecimiento capnoflico). Sus
exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos
con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos produciendo cido lctico y tambin
son catalasa negativos a diferencia de los estafilococos.

Clasificacin.
La diferenciacin de las especies que componen este gnero es complicada debido a que utilizan
tres sistemas diferentes:
Propiedades serolgicas (grupos de Lancefield).
Grupos de la A a la W
Patrones hemolticos:
Hemlisis completa (hemlisis beta [])
Hemlisis incompleta (hemlisis alfa [])
Ausencia de hemlisis (hemlisis gamma [])
Propiedades bioqumicas
Pruebas bioqumicas
Los grupos de Lancefield (creados por Rebeca Lancefield en 1933) se basa en la identificacin de
antgenos especficos de grupo la mayora de los cuales son carbohidratos de pared celular.
Algunos pueden identificarse con pruebas inmunolgicas instantaneas, por ejemplo, en la
identificacin de Streptococcus pyogenes para iniciar el tratamiento antibitico. Desgraciadamente
muchos estreptococos -hemolticos y no hemolticos carece de los antgenos de pared celular y
no son especficos.
Patognesis
A pesar de las enfermedades infecciosas que causan algunas especies de estreptococo, otras no
son patgenas. Los estreptococos forman parte de la flora saprfita de la boca, piel, intestino y
el tracto respiratorio superior de los humanos.
Por regla general, las especies individuales de los estreptococos se clasifican basados en sus
propiedades hemolticas.
Estreptococo Alfa-Hemoltico
Neumococo
S. pneumoniae, causante de neumona bacteriana, otitis media y meningitis.
Son diplococos gram positivos. Al microscopio ptico se ven como cocaceas gram positivas de
aspecto lanceolado (forma de grano de arroz). En cultivo en agar sangre de cordero se observan
a la lupa de luz como colonias umbilicadas (elevacin central)
Viridans y Otros
S. mutans, un contribuyente para caries dental.
S. viridans, causa de endocarditis y Abscesos dentales.
S. thermophilus, usado en la manufactura de algunos quesos y yogurts.

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S. constellatus, patgeno humano ocasional, notable como colonias con crecimiento en Agar
Sangre con fuerte olor a caramelo.

Estreptococos Beta-Hemolticos.
Grupo A.
S. pyogenes (tambin conocido como GAS) es el agente causal en las infecciones
estreptoccicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis estreptoccica (amigdalitis), fiebre
reumtica aguda, fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante. Si
la amigdalitis no es tratada, puede desarrollarse fiebre reumtica, una enfermedad que afecta
las articulaciones y lasvlvulas cardiacas. Otras especies de Streptococcus tambin pueden
poseer el antgeno del Grupo A, pero las infecciones en humanos por cepas no-S.
pyogenes GAS (algunas cepas S. dysgalactiae subsp. equisimilis y del Grupo S. anginosus)
parecen no ser comunes.

La infeccin por Estreptococos Grupo A es diagnosticada generalmente con una Prueba Rpida
de Estreptococos o mediante Cultivo.
El mtodo ms comnmente empleado en los laboratorios clnicos para la identificacin
presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemoltico del grupo A (Streptococcuss pyogenes)
es la prueba de susceptibiidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antgeno A
mediante enzimoinmunoanlisis o inmunoaglutinacin.

Grupo B
S. agalactiae, o GBS, causa neumona y meningitis en neonatos y en las personas ms
jvenes, con bacteremia sistmica ocasional. Estos tambin pueden colonizar los intestinos y el
tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la
transmisin al infante.
Grupo C
S. equi, el cual causa enfermedad en caballos, y S. zooepidemicus, el cual causa infecciones
en varias especies de mamferos incluyendo al ganado y caballos. Este tambin puede
ocasionar muerte en gallinas y alces. Muchos habitantes de las montaas en Canad han
encontrado cadveres de alces yaciendo en la mitad del camino; las pruebas post mrtem han
establecido la presencia de estreptococos del grupo C en su sangre.

Grupo D (Enterococos) *hemolsis de tipo variable

Muchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en
el Gnero Enterococcus (incluyendo S. faecalis, S. faciem, S. durans, y S. avium). Por
ejemplo, Streptococcus faecalis se conoce en la actualidad como Enterococcus faecalis.
Las cadenas remanentes no-enteroccicas del Grupo D incluyen Streptococcus
bovis y Streptococcus equinus.
Estreptococos no hemolticos

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Los estreptococos no hemolticos rara vez causan enfermedad. Sin embargo, estreptococos del
grupo D betahemolticos dbilmente hemolticos y Listeria monocytogenes no deben ser
confundidos con estreptococos no hemolticos.

Materiales:
Asas bacteriolgicas graduadas.
Asas bacteriolgicas rectas.
Portaobjetos.
Papel secante.
Solucin Desinfectante.
Marcador permanente.
Mechero.
Estufa Bacteriolgica a 37 C (temperatura constante).
Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X, 40X, 100X).

Cultivos:
Cultivo en Agar de Staphylococcus aureus
Cultivo en Agar de Staphylococcus epidermidis
Cultivo en Agar de Streptococcus agalactiae
Cultivo en Agar de Streptococcus disgalactiae
Cultivo en Agar de Steptococcus hemoltico
Cultivo en Agar de Enterococcus faecalis

Metodologa:
Primer Da:
1) Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2) Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana
establecida a cada equipo.
3) Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4) Realice la prueba de catalasa, y efectu la prueba de coagulasa en
portaobjetos
5) Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada
equipo
6) Incube los medios de cultivo y pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h
7) Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8) Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.

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Segundo Da:

1) Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

2) Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de catalasa.
3) Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4) Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada
medio de cultivo.
5) Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de
las pruebas bioqumicas.
6) Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

Conclusin.
Se prepararon los respectivos medios de cultivo para el crecimiento y desarrollo del microorganismo
de inters, realizando los respectivos clculos y adecundolos de acuerdos a lo requerido.

Cuando se caracterizen algunas colonias que obtendremos en la preparacin de medios de cultivo

y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades halladas en la caja de Petri.

Se efectura coloracin de Gram para identificacin de Gram positivas de acuerdo a las colonias ya
caracterizadas.

Tendremos que aislar los microorganismos de inters a partir del mtodo de aislamiento por
estras.Se hicieron pruebas Bioqumicas a los microorganismos de inters como prueba
defermentacin de azcares y tolerancia de etanol, las cuales dieron positivas deacuerdo a lo
esperado para evidenciar la presencia del microorganismo de inters

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Bibliografa.
Instructivo para la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos
de inters Biotecnolgico.
Prctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.

Instructivo para realizar la tcnica de aislamiento por estras prctica de laboratorio.

Prctica 2 y 3. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.Instructivo para la identificacin de
microorganismos mediante pruebas bioqumicasprctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje.
SENA, 2014.

INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA. Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke/ Christine L.

Case, Edicin 9.

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