Biocontrol del dione june a través de esporas de bacillus ssp

en pasiflora edulis

Introducción:

La presente investigación pretende dar a conocer el biocontrol de larvas lepidoteras de

diones june a través de las endotoxinas de Bacillus Thurigensis . Las cepas de Bacillus
Thurigensis son bacterias Gram positivas capaces de producir toxinas en forma de una
endospora, esta microespora a sido utilizada como biocontrol en muchas de las especies
de Lespirosteras

La presente investigación pretende dar a conocer el biocontrol de larvas lepidopteras de

Dione june a través de las ∂-endotoxinas de Bacillus thurigensis. Las cepas de Bacillus
Thurigensis son bacterias Gram Positivas capaces de producir toxinas en forma de una
endoespora, esta microsespora a sido utilizada como biocontrol en muchas de las
especeis de Lepidopteras,

El objetivo de este trabajo aislar e identificar cepas productoras de esporas en Bacillus

Thuriguiensis de muestra de suelo y probar la efectividad como biocontrolador de estas
en Lepidopteras como Dione june.
CARACTERÍSTICAS GENERALES
Bacillus thuringiensis es un bacilo Gram positivo, de flagelación peritica, que mide de 3
a 5 µm de largo por 1 a 1,2 µm de ancho y que posee la característica de desarrollar
esporas de resistencia elipsoidales que no provocan el hinchamiento del perfil bacilar
(Figura 1). Es un microorganismo anaerobio facultativo, quimioorganótrofo y con
actividad de catalasa. Los distintos aislamientos de B. thuringiensis presentan en general
características bioquímicas comunes. Poseen la capacidad de fermentar glucosa,
fructosa, trealosa, maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno,
esculina y N-acetil-glucosamina. Sin embargo, la característica principal de B.
thuringiensis es que durante el proceso de esporulación produce una inclusión
parasporal formada por uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza proteica que son
tóxicos para distintos invertebrados, especialmente larvas de insectos. Estas proteínas se
llaman Cry (del inglés, Crystal) y constituyen la base del insecticida biológico más
difundido a nivel mundial.
Figura 1: Micrografía de transmisión electrónica de Bacillus thuringiensis. Se muestra
espora bacteriana y cristal proteico (Sanchis, 2010).

CRISTALES PARASPORALES
Desde el instante en el que ocurre el englobamiento de la pre-espora hasta su
maduración, en simultaneidad con la formación de la espora, tiene lugar en B.
thuringiensis la síntesis de uno o varios cristales parasporales, que pueden representar
hasta un 30% del peso seco del esporangio. Estos cristales pueden presentar distintas
morfologías y pueden clasificarse en bipiramidales, cúbicos, cuadrados aplanados,
esféricos y otras formas atípicas menos frecuentes. Se logró en muchos casos establecer
asociaciones entre la morfología del cristal, sus proteínas Cry constituyentes, el peso
molecular de éstas y su espectro de actividad insecticida (Tabla 2). Sin embargo, existen
trabajos en los que se describieron cristales parasporales que, a pesar de tener
morfologías asociadas a una toxicidad específica, no parecen poseer actividad
insecticida alguna. Los cristales de B. thuringiensis pueden ser degradados por la acción
de los microorganismos del suelo y, al igual que sus esporas, también pueden ser
inactivados por la acción de la luz ultravioleta. El cristal parasporal se ubica en el
interior del esporangio y, por lo general, fuera del exosporio de la espora, y ambos son
finalmente liberados tras la lisis celular. Existen algunos casos donde se describieron
cristales dentro del exosporio, por lo que estos continúan junto a las esporas tras la lisis.
En otro caso muy atípico, se pudo observar que los cristales se forman fuera del
exosporio, pero ambos permanecen indefinidamente dentro de un esporangio que no se
lisa, preservándolos de una rápida degradación. Cada cuerpo de inclusión cristalino
puede estar constituido por proteínas Cry de una o varias clases que se agrupan entre sí
mediante puentes disulfuro. La estabilidad de estas uniones condiciona el pH de
solubilización del cristal (ver “Mecanismo de acción”). Particularmente en el caso de
los cristales bipiramidales,
Características de las δ-endotoxinas
Las δ-endotoxinas son el componente paraesporal predominante en la mayoría de
subespecies de Bt (Bulla, 1980), donde existen variaciones en el número, la forma y la
composición de estas inclusiones (Aronson et al., 1986). Cada cuerpo de inclusión
cristalino está constituido por proteínas Cry y Cyt (del inglés Crystal y Cytolitic,
respectivamente) de una o varias clases, las cuales les confieren un amplio y diverso
espectro de acción insecticida (Porcar y Juárez-Pérez, 2004). Ésta actividad biocida
actúa sobre ciertas especies de insectos entre los órdenes Lepidóptera, Díptera y
Coleóptera durante el estadio larvario. La definición de proteínas Cry es muy amplia,
pero de manera general es una proteína paraesporal de 130 a 140 KDa, que muestra un
efecto tóxico hacia algún organismo, verificable por bioensayos o cualquier proteína
que muestre similitud con las actuales proteínas Cry. Por otra parte, las proteínas Cyt
denotan a las proteínas paraesporales de Bt que muestren actividad hemolítica o tengan
similitud a la secuencia de las toxinas Cyt (Barloy et al., 1996). Las toxinas Cry y Cyt
son proteínas globulares formadas por tres dominios estructurales discretos. El dominio
I está formado por siete estructuras α-hélice, donde una hélice central está rodeada de
otras seis. Se ha propuesto que este dominio, participa en la formación de poros en la
membrana de las células del intestino del insecto susceptible. El dominio II está
formado por tres láminas de estructura β en antiparalelo. Este dominio participa en la
interacción con el receptor, que se encuentra en la cara apical de la membrana epitelial
del intestino medio del insecto blanco, determinando así la especificidad de la proteína.
Finalmente, el dominio III es una estructura β- plegada que también parece estar 12
involucrada en especificidad y que participa en la protección contra proteasas (Bravo y
Cerón, 2004). Hasta el 2015, han sido descritas 305 proteínas, clasificadas en 74 grupos
de diferentes clases y subclases, las cuales están reportadas en la base de datos de
Crickmore. La familia de genes que codifican para estas toxinas es la familia del gen cry
(Crickmore et al., 1998; Schnepf et al., 1998). Una característica común de los genes
cry es su expresión durante la fase estacionaria de crecimiento. La gran mayoría de los
genes cry que se conocen pertenecen al grupo cry1 y estos son sin duda los más
estudiados. (Crickmore et al., 2008).
Figura 2: Estructura tridimensional de la proteína insecticida Cry1Aa producida por
Bacillus thuringiensis. Tomado de De Maagd et al. (2001)

MECANISMO DE ACCIÓN:
El mecanismo de acción de las proteínas Cry se describió principalmente en
lepidópteros como un proceso de múltiples etapas. Los cristales de B. thuringiensis son
ingeridos y luego solubilizados en el intestino medio del insecto, tras lo cual se liberan
las proteínas cristalinas en forma de protoxinas. Estas no producirán el daño per se, sino
que deberán ser procesadas por proteasas intestinales para generar las toxinas activas
que llevarán a la muerte de la larva. Bajo su forma monomérica, las toxinas atraviesan
la membrana peritrófica y se unen de forma univalente a la caderina, con gran afinidad
en la cara apical de la membrana epitelial. Luego, de acuerdo con estudios realizados en
cultivos de células de insectos, se inicia una cascada de señalización dependiente del ion
magnesio que sería responsable de la muerte celular. Además, el inicio de esa cascada
de señalización estimula la exocitosis de caderina desde vesículas intracelulares hacia la
membrana apical de la célula y aumenta el número de receptores; por ende, recluta un
número mayor de toxinas libres que amplificarían la señal inicial. Por otro lado, con
base en experimentos in vitro y bioensayos, se propone que la unión de los monómeros
a caderina facilita el clivaje proteolítico sobre el extremo N-terminal de la toxina. Este
último clivaje induce el ensamble de los monómeros y se establece una forma
oligomérica pre-poro. Esta estructura incrementa la afinidad por un receptor secundario
como puede ser la aminopeptidasa N o la fosfatasa alcalina. Por último, la unión a ese
segundo receptor facilita la formación de un poro en el epitelio del intestino medio, esto
provoca un desequilibrio osmótico y la consecuente lisis celular. El tejido intestinal
resulta dañado gravemente, lo que impide la asimilación y retención de compuestos
vitales para la larva y lleva a la muerte del insecto. La muerte puede acelerarse al
germinar las esporas y proliferar las células vegetativas en el hemocele del insecto.
Broderick et al. descartaron estas posibilidades y demostraron que la mortalidad
inducida por B. thuringiensis dependería en esencia de ciertas bacterias entéricas que
son parte de la microbiota normal del intestino del insecto susceptible, ya que sólo B.
thuringiensis no sería suficiente. Estas bacterias serían responsables de causar la
septicemia en el insecto luego de que B. thuringiensis les permite alcanzar el hemocele
tras dañar el epitelio intestinal.

Fig 03: Mecanismo de acción de las Esporas de B. Thuriguiensis en Lepidopteras.1.

ingestión de la Bt toxin Crystal. 2. Solubilizacion a pH10. 3. Activacion por proteasas
intestinales. 4. las toxinas atraviesan la membrana peritrófica y se unen a la caderina. 5.
Via de activación de la muerte celular. 6 muerte larvarea por septicemia,
Proteínas Cry y Vip tóxicas para insectos lepidópteros:
Las proteínas de la clase Cry1 y las Vip3 son las consideradas tradicionalmente tóxicas
para las larvas del orden Lepidoptera. Las diferencias aminoacídicas que presentan se
traducen comúnmente en variaciones de toxicidad y especificidad. En general, las
proteínas Cry y Vip muestran espectros de actividad reducidos y muchas veces acotados
a unas cuantas especies de insectos pertenecientes a un mismo orden. No obstante, la
toxicidad de las proteínas Cry1 no se restringe sólo a los lepidópteros. Por ejemplo, las
proteínas Cry1Ba y Cry1Ia demostraron poseer también toxicidad para coleópteros y la
proteína Cry1Ca para dípteros. Sucede algo similar con la proteína Cry2Aa, que es
tóxica para dípteros también. En la Tabla 3 se presentan en forma detallada las proteínas
Cry y Vip tóxicas para lepidópteros, como así también las familias y especies de
insectos susceptibles.
Identificación molecular de Bacillus thuringiensis
Los ácidos nucléicos pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos
de la historia evolutiva. Los cambios en la secuencia de los ácidos nucléicos se
producen al azar y aumentan con el tiempo, por lo tanto, las diferencias en la secuencia
de los nucleótidos que integran macromoléculas homólogas, presentes en dos formas de
vida, reflejan la distancia evolutiva existente entre ellas (Zuckerkandl et al., 1965). El
ADN que codifica para el ARN ribosomal (ARNr) 16S es la macromolécula más
ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación
como cronómetro molecular fue propuesta por Carl Woese a principios de la década de
1970 (Olsen et al., 1993). Desde entonces, el análisis de los ARNr 16S se ha utilizado
ampliamente para establecer las relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota
(Rodicio y Mendoza, 2004). Los ribosomas son macromoléculas complejas, altamente
especializadas para el proceso de síntesis de proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un
coeficiente de sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede
disociarse en dos subunidades, la subunidad mayor (50S) y la subunidad menor (30S).
Cada subunidad es un complejo ribonucleoproteico constituido por proteínas
ribosómicas y moléculas de ARNr específicas. La subunidad 30S contiene el ARNr 16S
y 21 proteínas diferentes (numeradas desde S1-S21, donde S procede de small),
mientras que la subunidad 50S contiene los ARNr 5S y 23S junto con unas 34 proteínas
(L1-L34; L, large) [Figura 4].
En bacterias, los genes que codifican los ARN ribosomales están organizados en
operones, es decir son un conjunto de genes que se transcriben a partir de la misma
región promotora. Cada operón ribosómico (rrn) incluye genes para los ARNr 23S (rrl),
16S (rrs) y 5S (rrf), separados por regiones espaciadoras o intergénicas (IG), y contiene

además genes para uno o más ARN de transferencia (ARNt) [Figura 5]. El producto de
la transcripción del operón a partir de dos promotores, P1 y P2, situados en la región
anterior a rrs, es procesado por la enzima ARNasa III mediante cortes en sitios
específicos que separan las tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG (Rodicio y
Mendoza, 2004).
El ARNr 16S es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 b, codificado por el
gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya
secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier
secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una estructura
secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con
regiones de cadena sencilla [Figura 6] (Neefs et al., 1990). El ARNr 16S procede de las
subunidades pequeñas de los ribosomas (ARNr SSU, del inglés, small subunit), estas
subunidades pequeñas se encuentran altamente conservados, presentando regiones
comunes a todos los organismos, pero además contienen variaciones que se concentran
en zonas específicas.
El ARNr 16S presenta una serie de características, con base en las cuales fue
considerado por Woese (1987) como cronómetro molecular definitivo ya que se trata de
una molécula presente en todas las bacterias actuales, por tanto, se considera una diana
universal para su identificación. La estructura y función del ARNr 16S han permanecido
constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la
secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios. Dichos cambios ocurren de
manera suficientemente lenta, como para aportar información acerca de todos los
procariotas a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin
embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más alejados,
sino también los más próximos. El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.5
kb) minimiza las fluctuaciones estadísticas. La conservación en estructura secundaria
puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el alineamiento
preciso. Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ARNr 16S existen amplias
bases de datos y en continuo crecimiento. No obstante hay que tener presente que
actualmente en taxonomía se recomienda la identificación que utiliza criterios
fenotípicos junto con datos de secuenciación. Esto implica que la secuenciación del
ARNr 16S no aportará siempre una identificación definitiva a nivel especie (Patel,
2001).

Antecedentes:

El uso de agentes microbianos como biocontroladores ha sido considerado como una

alternativa ecológica a los agroquímicos. Bacillus thuringiensis es una de las cepas más
utilizadas como componente principal de formulaciones comerciales para el control de
plagas. Existe un interés creciente, en laboratorios del mundo, en la búsqueda de nuevas
cepas que produzcan nuevas proteínas Cry, con un mayor espectro de actividad biocida,
las cuales puedan ser utilizadas para la realización de nuevas formulaciones. La gran
mayoría de estas investigaciones inician con la búsqueda de muestras de suelo, ya que
son la fuente más importante de Bt. Bacillus thuringiensis fue asumida como un
habitante del suelo gracias a Martin y Travers (1989), quienes tomaron muestras de
suelos en más de 30 países distribuidos en los 5 continentes. Como resultado lograron
crear una colección que contaba con más de 1115 aislados de Bt en Estados Unidos y 25
aislados en otras ciudades del mundo, reportando diferentes subespecies basándose en la
morfología del cristal. Por otro lado, Bernhard et al. (1998) colectaron 5003 aislados de
Bt en 80 países, la mayoría de las muestras provenían del Reino Unido y Norte
América, donde solo el 5 % de los aislados obtenidos eran de Suramérica. En
investigaciones llevadas a cabo en Latinoamérica, Ibarra et al. (2003) probaron una
colección de 6531 cepas de Bt obtenida de muestras de suelo de Brasil, México y
Colombia. Estos aislados fueron enfrentados a larvas de Aedes aegypti, encontrando
que 1881 presentaban actividad tóxica contra las larvas de este insecto. 22 Por su parte,
en investigaciones acerca de la ecología de Bt, se ha establecido que la presencia de este
microorganismo en el medio ambiente se ve favorecida por la abundancia de los
insectos. Se ha propuesto que las especies de insectos y las especies de Bt han
coevolucionado (Feitelson et al., 1992). Bravo et al. (1998), partiendo de esta
suposición y considerando que México es un país con una gran biodiversidad, se
propusieron como objetivo establecer una colección nativa de Bt de ese país,
suponiendo que con estas colecciones de cepas autóctonas podrían obtener nuevas
proteínas Cry, que pudieran ser utilizadas como controladores para distintas plagas. En
esta investigación se colectaron 503 muestras de suelo en 5 macroregiones del país,
obteniendo como resultado 496 aislados de Bt. Éstos fueron analizados mediante PCR
multiplex con cebadores generales y específicos para detectar un amplio espectro de
genes cry. De esta forma, el gen cry1 era el más abundante en los aislados (49,5 %),
seguido del gen cry3 (21,5 %). Sin embargo, un 14 % de las muestras analizadas no
generaron producto de PCR, proponiendo que estos aislados pueden presentar nuevos
genes cry. Monnerat et al. (2001), proveen un catálogo que contiene 1400 aislados de Bt
entomopatogénicos, pertenecientes a Embrapa Recursos Genéticos y Biotecnología.
Estos aislados fueron obtenidos de muestras de suelo y de agua en diferentes lugares de
Brasil. En investigaciones posteriores se probó la actividad tóxica de esta colección
sobre larvas de Spodoptera frugiperda, Plutella xylostella y Anticarsia gemmatalis
(Monnerat et al., 2007). Asimismo, en 2003, Uribe et al. colectaron muestras de suelo
tanto en áreas agrícolas como silvestres, en diferentes regiones de Colombia. Estos
investigadores destacan que de las áreas intervenidas con actividad agrícola se
encontraban cultivos de papa; uno de los más 23 importantes en ese país, los cuales no
habían sido asperjados con ninguna formulación comercial de Bt. Mientras que las áreas
silvestres, donde se colectaron las muestras, correspondían a bosques tropicales y
sabanas. Estos investigadores reportaron como nativos los 108 aislados de Bt obtenidos,
a los cuales se les realizó una caracterización a nivel bioquímico y molecular,
observando que la mayoría poseían el gen cry1. Adicionalmente, se les evaluó su
actividad tóxica sobre larvas de Spodoptera frugiperda y Premnotrypes vorax
(Coleoptero plaga de la papa), encontrando que presentaban una alta patogenicidad. En
Venezuela, Vitelli et al. (2010) procesaron muestras de suelos obtenidas en la Península
de Paria (0 m.s.n.m), donde no había sido asperjado ningún bioinsecticida con base en
Bt. De este análisis, se identificaron 11 cepas nativas de Bt caracterizadas
molecularmente, a través de la técnica de ribotipificación automatizada. La
categorización en ribogrupos demostró una gran variabilidad entre los aislados. Chak et
al. (1994), realizaron un estudio en Taiwán con 225 cepas de Bt aisladas tanto en zonas
de gran altura (3000 m.s.n.m.) como en zonas de baja altitud (varios cientos de metros
sobre el nivel del mar), evidenciando que la distribución de los genes cry de sus aislados
depende de la región geográfica. En esta investigación se observó que el gen cry1 se
encontraba en mayores proporciones en zonas de alta montaña (> 3000 m.s.n.ms.).
Como se puede observar, existen muchos reportes que dan cuenta de la importancia del
establecimiento de colecciones de Bt, que pudieran proporcionar nueva proteína Cry
que sean tóxicas para plaga de interés agrícola como de salud pública

JUSTIFICACIÓN
Uno de los objetivos de la biotecnología agrícola es reducir la dependencia del uso
intensivo de insecticidas químicos sin afectar la productividad del campo, teniendo
como consecuencia la reducción tanto en el costo de insumos como de los problemas
ambientales. Una alternativa para estos problemas es el control biológico de plagas con
el uso de patógenos para mantener reducidas las poblaciones. Uno de los patógenos más
utilizados es Bacillus thuringiensis, capaz de producir una δ-endotoxina altamente
tóxica y específica, utilizada para formular bioinsecticidas denominada proteína Cry. En
México, desde 1999, la venta de bioinsecticidas a base de Bacillus thuringiensis se
incrementó en un 15-20% anual, mientras que en el mercado internacional representa de
120-140 millones de dólares (Tamez, et al., 2001). Algunas proteínas Cry que no tienen
actividad insecticida, presentan actividad citotóxica contra varios tipos de células de
vertebrados incluso contra células cancerígenas humanas (parasporinas). Bacillus
thuringiensis es una bacteria cosmopolita que se puede aislar de suelo, hojas, insectos
muertos, etc. Esta característica ha generado la constante búsqueda de nuevas cepas
productoras de proteínas Cry para usarse en el control biológico de plagas. Así como de
cepas productoras de parasporinas como potencial tratamiento contra el cáncer. Por lo
tanto, en el presente trabajo se propone obtener aislados de B. thuringiensis de suelos de
la región del Papaloapan productoras de proteínas Cry o parasporinas.
OBJETIVOS
 Objetivo General
- Aislar y caracterizar cepas de Bacillus thuringiensis de muestras de suelo obtenidas en
Paraiso,

 Objetivos específicos
- Aislar selectivamente cepas de Bt a partir de muestras de suelo encontrados en zonas
intervenidas y no intervenidas con actividad agrícola en Paraiso.
-Aislar cepas puras de Bacillus Thurigiensis capaces de producir proteínas Cry.
- Demostrar la efectividad de las toxinas de Bt sobre larvas de Lepidopteras como el
Dione June.

Materiales:

Muestra de tierra:
Los suelos son una fuente con una gran de cantidad esporas de B. thuringiensis, para el
aislado de cepas se tuvieron que recoger en puntos específicos de campo de chacra de
localidad Paraiso- provincia de Huaura a la altura de peaje para la entrada a la ciudad de
Huacho, los 5 puntos donde se tomaron las muestras de suelo fueron en las
coordenadas:
1ro S: 11° 12, 166’, O: 77° 32, 714’.
2do S: 11° 12, 150’, O: 77° 32, 725’
3ro S: 11° 05, 401’, O: 77° 21, 276’
4to S: 11° 45, 837’, O: 77° 07, 543’
5to S: 12° 21, 771’, O: 76° 51, 520’
En cada punto se tomaron de 0.5 a 1 kg de tierra en bolsas herméticas esteriles, a 20 cm
de profundidad.
Muestra Biológica:
Ya que las esporas son las causantes de muerte de muchas larvas de Lepidopteras
también se recolectaron muestras de larvas muertas, con una pinza estéril se pusieron en
frascos estériles de tapa de rosca y fueron llevados al laboratorio, cualquier especie de
larvas pero las que se encontraron en mayor cantidad de población fueron de
Lepidopteras como el Dione June, las plantaciones de maracuyá.

Medios de cultivos para el crecimiento de las cepas bacterianas:

Medio A-80: Este medio propuesto por Arcas et al. (1984), se utilizó para la obtención
del complejo espora-cristal de la cepa Bt de referencia.

La solución A y la solución B se esterilizaron a 15 lb durante 15 min a 121 °C. La

solución C se esterilizó a 10 lb por 15 min. Estas cantidades corresponden a 1,5 L de
medio A-80. Las soluciones B y C se agregaron a la solución A, la solución B se agregó
gota a gota para evitar la precipitación de las sales.

Agar Nutritivo (AN): Este medio se utilizó para la preservación, en punciones, de las
cepas de Bt aislada. Para 1 L de solución se agregaron 22,5 g de Agar Nutritivo en 1 L
de agua destilada. Se preparó en una fiola en agitación y calentamiento. Posteriormente,
se agregaron 5 mL del medio en viales de vidrio, se esterilizaron a 15 lb por 15 min.
PLAN DE TRABAJO:

METODOLOGIA:

Aislamiento de cepas bacterianas Bacillus ssp a partir de muestras de suelo:

Recolección y procesamiento de las muestras de suelo:

Para la recolección de las muestras de suelo en zonas de Paraíso, se descartó la capa
superficial del suelo, a unos 20 cm de profundidad, se tomó la muestra bajo condiciones
estériles, colocándola en bolsas herméticas estériles. Las muestras colectadas, se
mantuvieron a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el laboratorio.
En el laboratorio se agito la muestra de tierra con el fin de homogenizar todo para
próximamente quitar 10 g de tierra para agregarlos en 10ml de agua destilada estéril. Se
procede a hacerle un tratamiento de shock térmico con el fin de eliminar bacterias y
organismos no deseados, el shock térmico se hizo a una temperatura de 60°C durante
una hora en la incubadora.
Terminada el shock térmico pasamos a sembrar las colonias vivas en Agar nutritivo en
placas Petri de vidrio, utilizando el método de siembra por diseminación utilizando el
asa de digralsky esteril, ula vez terminada la siembra se incuba a 30ºC durante 24 a 48
horas. Todo este proceso se realizó en una cámara de flujo esterilizada con luz
ultravioleta durante 15 min.
Obtenidas las clonias aisladas pasamos a repicarlas en tubos Eppendorf con 1ml de
Caldo Nutritivo dándole un código único, estos tubos se incuban a 30ºC durante 24. Una
vez crecida la cepa en el caldo nutritivo se conserva en refrigeración a 5ºC hasta su
próxima prueba.

Recolección y procesamiento de las muestras de larvas muertas

En cada punto de recolección se encontraron Larvas de Lepidopteras como de Dione
June, estas larvas fureon recolectadas en frascos de vidrios esteriles. El fin de recolectar
estas larvas era de encontrar las endoesporas de Bacillus ssp o también al mismo
Bacillus Thurigiensis dentro de la larva.
Para identificar si hay larvas o Esporas lo primero que se hizo fue introducir una larva
entera muerta en 10ml de Agua destilada esteril en tubo de vidrio, y con la varilla de
vidrio aplastar y destrozar el cadáver de larva. Una vez terminada con las larvas se pasa
a un proceso de shock térmico a 60ºC durante una hora para eliminar hongos y bacterias
no desadas.
Terminada el shock térmico pasamos a sembrar las colonias vivas en Agar nutritivo en
placas Petri de vidrio, utilizando el método de siembra por diseminación utilizando el
asa de digralsky esteril, ula vez terminada la siembra se incuba a 30ºC durante 24 a 48
horas. Todo este proceso se realizó en una cámara de flujo esterilizada con luz
ultravioleta durante 15 min.
Obtenidas las clonias aisladas pasamos a repicarlas en tubos Eppendorf con 1ml de
Caldo Nutritivo dándole un código único, estos tubos se incuban a 30ºC durante 24. Una
vez crecida la cepa en el caldo nutritivo se conserva en refrigeración a 5ºC hasta su
próxima prueba.

Aislamiento de colonias con morfotipo de Bt.

Una vez transcurridas las 24 h de la incubación de las placas con los aislados de las muestras
de suelo, se procedió a seleccionar aquellas colonias individuales que poseían el morfotipo
característico de B. thuringiensis, es decir, aquellas colonias blancas, grumosas, con bordes
irregulares, con aspecto ceroso. Luego, las colonias fueron repicadas en Caldo Nutritivo, se
incubaron por 24 h a 30 °C en tubos Eppendorf para posteriormente hacerle una siembra por
cuadrantes en Agar nutritivo en placas Petri para verificar si tenemos baceterias puras y
aisladas.

Observación de cristales en microscopio óptico.

Una vez transcurridas las 48 h de incubación, las colonias aisladas y puras se somente a la
técnica de tinción de esporas con Verde de malaquita.

Identificación de Cepas productoras de Esporas:

Para la identificación de cepas productoras de esporas se utilizo un colorante para
esporas llamado Verde de malaquita, este colorante tiñe la espora