APTÁMEROS

OLIGONUCLEOTÍDICOS

NUEVAS HERRAMIENTAS EN
LA TERAPIA

Diagnosticos Moleculares y Celulares

 ¿QUÉ SON LOS APTÁMEROS?
● Introducción

◾ C a d e n a s o lig o n u c le o t íd ic a s d e R NA o s s D NA
◾ Son lig a nd o s de a lt a ESPECIFICIDAD y AFINIDAD
p o r e s t r u c t u r a s t r id im e n s io n a l e s p r e s e n t e s e n la s c é lu la s d ia n a

Conocidos “Anticuerpos
como: químicos”
¿QUÉ SON LOS APTÁMEROS?
¿POR QUÉ DESARROLLAR
APTÁMEROS?
 ¿POR QUÉ DESARROLLAR
APTÁMEROS?
Permite identificar biomarcadores
Diagnóstico in vitro
Terapia dirigida o vectorizada
Técnicas de visualización in vivo

Última >4000
tendencia
 ¿POR QUÉ
DESARROLLAR
APTÁMEROS?
VENTAJAS
• Estabilidad térmica. Capaces de renaturalizarse.
• Síntesis y modificaciones sencillas y a gran escala.
• Baja variabilidad estructural en la síntesis.
• Síntesis industrial
• Para dianas muy diferentes. (de iones a tejidos).
• Menor coste de producción.
• Bajo peso molecular. Paso de membranas
• No inmunogénicas
 ANTICUERPOS VS. ÁPTAMEROS
• Los anticuerpos y los aptámeros tienen propiedades de reconocimiento similares con altas afinidades (en el
rango bajo nanomolar a picomolar), pero los aptámeros muestran una serie de ventajas importantes.De
hecho, tienen una especificidad superior, una producción simple y rentable y son resistentes a entornos
hostiles (pH y temperaturas).

Las ventajas adicionales de los aptámeros sobre los anticuerpos incluyen la posibilidad de sintetizarlos
químicamente una vez seleccionados, con alta pureza y muy baja variabilidad entre lotes, y la forma fácil en
que pueden modificarse químicamente.

Se pueden realizar modificaciones para mejorar aún más su estabilidad, biodisponibilidad y farmacocinética,
o para permitir su simple inmovilización o marcaje para su uso en ensayos de diagnóstico.

Además, en comparación con los anticuerpos, los aptámeros tienen tamaños más pequeños (20 a 25 veces
en comparación con los anticuerpos monoclonales de tamaño completo), lo que permite una mejor
penetración en los tejidos.

Lo que es más importante, no son inmunogénicos, lo que permite la administración segura de dosis repetidas
que están prohibidas para los anticuerpos, a menos que sean humanizados o producidos completamente por
seres humanos.
01.
Método SELEX
(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)
“ Los aptámeros son moléculas de ADN/ARN monocatenarias de alta
afinidad, producidas mediante un procedimiento combinatorio
denominado SELEX (evolución sistemática de ligandos por
enriquecimiento exponencial), que están emergiendo como
herramientas diagnósticas y terapéuticas prometedoras.

Entre las estrategias de selección, se han desarrollado procedimientos

que utilizan células vivas como objetivos complejos (denominados
"cell-SELEX") como un medio eficaz para generar aptámeros para
“
proteínas de superficie celular muy modificadas, asegurando la unión
del objetivo en su conformación nativa.
.
El punto de partida del procedimiento SELEX es la generación de una
biblioteca de ácidos nucleicos monocatenarios (ARN o ADN) con una
secuencia de alta complejidad. Por lo general, la biblioteca contiene
una región central aleatoria de 20 a 50 bases, cuya aleatorización
genera un grupo complejo de diferentes secuencias con diferentes
conformaciones y capacidades de unión. La dimensión de esta región
aleatoria es un factor importante. La dimensión de esta región aleatoria
es un aspecto importante.

De hecho, el uso de bibliotecas SELEX cortas (<50 nucleótidos) tiene

la ventaja de proporcionar aptámeros más cortos, lo que permite una
síntesis química eficiente y rentable, pero al mismo tiempo reduce la
complejidad de la biblioteca y podría limitar la eficacia de la selección.
La parte central suele estar flanqueada por dos regiones constantes
que se requieren para la amplificación y transcripción por PCR (en el
caso de la biblioteca de ARN).
 SELEX

Para implementar la técnica, se

necesita una librería de ADN o ARN
que contenga una región variable
en el centro de la secuencia (20-40
nucleótidos), y regiones
conservadas en los extremos que
permitan diseñar oligonucleótidos
específicos para amplificar y
seleccionar las secuencias que se
unen al blanco
 SELEX
■ Incubación. Una vez obtenida la librería de oligonucleótidos (ADN o ARN), se pone en contacto con
el blanco que se quiere reconocer, el cual puede estar anclado a una superficie o en suspensión.

■ Selección. Para los blancos que están anclados a una superficie, se hacen varios lavados, con el fin
de descartar las secuencias no unidas. Si el blanco se encuentra en suspensión, es necesario centrifugar
para separar las secuencias unidas de las no unidas. Una vez obtenidos los complejos de secuencia y
blanco, este se debe separar para obtener únicamente las secuencias. Para esto existen varias
estrategias, como el uso de detergentes, proteinasas y soluciones tampón, entre otras.

■ Amplificación. Posteriormente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR con

transcripción inversa (RT-PCR), según la naturaleza del ácido nucleico, se amplifican las secuencias
unidas para enriquecer la librería con aquellas que tienen capacidad de reconocer el blanco, las cuales
se someten después a nuevas rondas de incubación y selección.

■ Clonación y secuenciación. Una vez se obtienen secuencias que alcancen la afinidad y

especificidad deseadas, se procede a clonar y secuenciar para conocer su composición de nucleótidos
2.- Calentar y Formación de
enfriar la estructuras
colección 3D
4.- Eluir los no
afines
3.- No unión
Mezclar
con el
elemento 5.- Amplificar
diana Unión
 M“aterial y Métodos
Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento
Exponencial” (SELEX)
1.- 1.- Colección de
Colección ssDNA aleatoria
de ssDNA +Promotor RNApol
aleatoria
F B 3’
5’ 3’ 5’

5’ 3’
 7.- Eluir los no
específicos

6.- Mezclar Unión

con elementos
control
8.- Amplificar
No unión

1.- Colección
de oligont’s
más específica
Material y Métodos
Elementos diana
§Proteínas purificadas: conformación fisiológica.
§Células vivas completas: moléculas de superficie.
§Transfección génica
§SELEX híbrido
§20 ciclos iniciales con células que sobreexpresan el
marcador
§5 ciclos adicionales con el marcador purificado
§SELEX de internalización.
§FACS-SELEX: Eliminar células muertas
 Métodos SELEX
basados en células

El uso de objetivos complejos

para la selección de aptámeros
fue introducido por primera vez
por Morris et al. [9] en 1998.
Utilizaron preparaciones de
membrana de glóbulos rojos
humanos (fantasmas de RBC)
en lugar de proteínas de
membrana purificadas para
Este trabajo abrió el camino para el desarrollo de aislar múltiples moléculas de
protocolos SELEX de células vivas completas. En ssDNA con alta afinidad por
general, estos protocolos se han adoptado para aislar diferentes objetivos de
aptámeros capaces de reconocer un objetivo de interés membrana celular.
conocido o un fenotipo celular específico
OUR HISTORY
 Cell-SELEX
• Aislar aptámeros frente a una proteína de Se han generado aptámeros que reconocen

350
interés conocida mediante el uso en el paso específicamente el receptor del factor de crecimiento
de selección positiva de una línea celular que transformante-β tipo III (TGFβRIII) mediante este
sobreexpresa el objetivo enfoque.

TOTAL EMPLOYEES IN 3 YEARS

Células de ovario de hámster chino (CHO) que
expresan ectópicamente TGFβRIII como diana y

50
aislaron un aptámero de ARN con una constante
El aptámero también es capaz de inhibir la de disociación muy buena (rango de 1 nM), capaz
interacción entre TGFβRII y el ligando TGF-β2 in de reconocer de manera eficiente el receptor de la
vitro, lo NEW
que muestra una posible aplicabilidad superficie celular.
EMPLOYEES IN 2021
como herramienta para investigar la función del
(estimated)
receptor y como agente terapéutico.
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 ÁPTAMEROS

Ligand-Guided
Cell-SELEX Variants Selection 3D Cell-SELEX and In
(LIGS) Vivo SELEX

Cell Internalization Microfluidic-

Sequencing and
SELEX Based
Bioinformati
System
c Analysis
Cell-SELEX
 APLICACIONES Y EJEMPLOS

Terapia dirigida por aptámeros

Aplicaciones y ejemplos

Conjugados fármaco-aptámero
Nanopartículas
Terapia génica
Inmunoterapia
Terapia biológica
 Terapia dirigida por aptámeros

Conjugados fármaco-aptámero
Nanopartículas
Terapia génica
Inmunoterapia
◾Método simple y efectivo
Terapia biológica
◾Eficacia mayor frente a fármaco solo
◾Varios problemas de los conjugados:
a) Inestabilidad (en uniones no covalentes)
b) Baja vida media in vivo (bajo peso molecular)
c) Baja cantidad de fármaco conjugada (estructura de los
aptámeros es simple)
 CONJUGADOS FÁRMACO-
APTÁMERO
Aplicaciones y ejemplos

Intercalación no
covalente

Aptámero

Intercalación
covalente

a) Solución: Unión covalente con un linker sensible a condiciones

controlables (ejemplo: pH bajo)
 CONJUGADOS FÁRMACO-
APTÁMERO
Aplicaciones y ejemplos

b) Aumento de peso molecular:

Conjugación con polímeros:
◾ Ejemplo: polietilenglicol (PEG), produjo:
◾ Aumento en peso molecular (y vida media)
◾ Aumento de estabilidad
◾ Menor acumulación en tejidos no diana
 CONJUGADOS FÁRMACO-
APTÁMERO
Aplicaciones y ejemplos

c) Aumento de cantidad de fármaco conjugada

Varias estrategias:
“Nanotrenes” (aptNTrs):
- Aptámero= Locomotora
- Sondas DNA= Vagones
Aptámeros con fármacos fotosensibles
Aptámeros bi- o tri-específicos
 NANOPARTÍCULAS
Aplicaciones y ejemplos

Biocompatibilidad
Gran superficie (unión del aptámero y del fármaco)
Otras características según tipo

Tipos
a) Copolímeros y liposomas
b) Nanomateriales metálicos
c) VLPs (virus-like particles)
 COPOLÍMEROS Y LIPOSOMAS
Aplicaciones y ejemplos

◾ Mayor degradación y biocompatibilidad

◾ Ejemplo: Bioconjugado: PLGA-lecitina-PEG y aptámero con
paclitaxel
◾ Gran eficiencia en encapsulación
◾ Mayor vida media
NANOMATERIALES METÁLICOS
Aplicaciones y ejemplos

Propiedades ópticas
Propiedades electromagnéticas
Estabilidad
Biocompatibilidad
NANOMATERALES METÁLICOS
Aplicaciones y ejemplos

Nanoesfera de oro hueca

Aptámero CD30 sintético
PEG
Doxorubicina

pH

Célula tumoral
 VLPS
Aplicaciones y ejemplos

Ejemplo:
Estrategia oxidativa
60 copias de aptámero sgc8 en cada cápsida de bacteriófago
MS2
Unión fuerte a células diana
Internalización y degradación por lisosomas
 TERAPIA GÉNICA. EJEMPLO
Aplicaciones y ejemplos
PEI
Sun et al.
Alta eficacia de transfección celular
Nanonúcleo con polímero
transportador
Internalización: endosomas citoplasma

Linfoma
Expresión de CD30

· Downregulation del gen

ALK
· Inhibición proliferación
celular
 INMUNOTERAPIA
Aplicaciones y ejemplos

Bajo potencial de efectos adversos

Anticuerpos
Alta especificidad
artificiales

Reconocimiento – internalización
en macrófagos (Bruno et al.)
 INMUNOTERAPIA. EJEMPLOS
Aplicaciones y ejemplos
Stecker et al.
Línea de células de
MCF7
cáncer de pulmón (MCF7)
Formación de un complejo MUC1
de ataque a membrana C1q
( MAC) MA MCF7
C
Muerte celular
Xiong et al.
Células de leucemia (K562)

+ Ligando PEG Protección conformación 3D (aptámero)

+ Cola: lípido diacetilado Facilita y mejora incorporación a

membrana
 TERAPIA BIOLÓGICA
Aplicaciones y ejemplos

Vías de transducción
Agonistas o antagonistas

Aptámeros monovalentes
Activar vías de señalización downstream
(diana: biomarcadores)

Activar vías de señalización downstream

Aptámeros multivalentes
(multimerización del receptor)
 CONCLUSIONES

Los aptámeros suponen un gran avance con respecto a los

anticuerpos en el campo de la terapia dirigida.
Por otro lado, aún resulta necesaria la optimización de algunos
aspectos técnicos:
§ SELEX mejorado, para mayor rapidez de selección de las estructuras.
§ Búsqueda de elementos diana relevantes.
§ Mejora de la estabilidad in vivo.
§ Liberación efectiva del principio activo.
◾ En definitiva, los aptámeros prometen ser una atractiva
herramienta en la terapia dirigida al cáncer u otras
enfermedades.