Los aptámeros son oligonucleótidos de hebra simple entre 60 a 150 nucleótidos (ssDNA o RNA)

que son seleccionados de una biblioteca combinatorial sintética Los aptámeros son
seleccionados mediante ensayos in vitro de afinidad entre un conjunto general de la biblioteca
y una proteína diana . Los aptámeros poseen una estructura tridimensional específica que
depende principalmente de su secuencia. Dicha estructura le permite interactuar con la
superficie de las proteínas diana de manera similar a los anticuerpos (Figura 2) (30). En los
últimos años, la tecnología de los aptámeros ha sido usada en un amplio rango de técnicas de
diagnóstico y aplicaciones terapéuticas (31). Como un ejemplo, cabe mencionar que estas
estrategias están siendo usadas actualmente para desarrollar aptámeros específicos contra
proteínas diana asociadas a la patogenicidad y virulencia de tripanosomátido.

Figura 2. Aptámeros vs Anticuerpos. A) Comparación del tamaño y complejidad estructural entre el

aptámero y el anticuerpo. El aptámero es un ácido nucleico de hebra simple, mientras que el anticuerpo
es un complejo proteico. Los aptámeros pesan es promedio 26 KDa mientras que los anticuerpos
promedian los 150 KDa. B) Breve resumen de las ventajas de los aptámeros sobre los anticuerpos. Los
aptámeros han mostrado afinidad al blanco con valores similares o superiores a los alcanzados por los
anticuerpos (Jing & Bowser 2010). Adaptado de Cheung YW et al. 2013 y Saphire EO et al. 2001

La manera de producir aptámeros es mediante un método denominado SELEX (Systematic

Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). El método SELEX es un protocolo cíclico de
presión evolutiva para selección de secuencias que cada ronda se hacen más afines a la
molécula blanco que se haya elegido (Figura 3). El procedimiento SELEX está caracterizado por
emplear bibliotecas aleatorizadas de oligonucleótidos de hasta 1012 – 1015 moléculas
diferentes de ácidos nucleicos, los cuales forman, al menos, el mismo número de estructuras
secundarias y terciarias de los oligonucleótidos de cadena simple. Asimismo, las bibliotecas
usadas en SELEX constan de secuencias constantes que se encuentran en los extremos 5’ y 3’
de la región aleatorizada central y que sirven para la amplificación por PCR ya que son el sitio
de unión de los primers. El término biblioteca aleatorizada hace referencia al hecho que cada
unidad del ácido nucleico de hebra simple tiene la probabilidad de ser adenina, guanina,
citosina o timina (uracilo, en el caso de ARN). La metodología SELEX convencional ha sido
implementada con diversas herramientas para mejorar el rendimiento. Un ejemplo de esta
implementación es el uso de perlas magnéticas, llamadas beads, para la inmovilización del
blanco. Esta metodología fue por primera vez publicada en 1997 (33).
Figura 3. Esquema del Procedimiento SELEX. En primer lugar, el SELEX comienza con la
incubación de la biblioteca y el blanco (1, binding); luego se aplica un lavado para eliminar la
biblioteca que se une débilmente (2, wash); paso siguiente se libera la biblioteca unida a los
Beads (3, elution); seguido se amplifica la poca biblioteca unida mediante PCR (4,
amplificación); y finalmente, esta biblioteca amplificada sirve para la siguiente ronda de SELEX
(5, regeneration). Cuando finalmente se obtiene una biblioteca lo suficientemente enriquecida
se hace el análisis de la biblioteca enriquecida (6, evaluation). Adaptado de Schutze T. et al.
(2011).

Desde que la metodología fue implementada por primera vez, se han hecho muchas variantes
que le dan versatilidad a la técnica. Por ejemplo, una variante muy utilizada es realizar un
SELEX contra una célula completa o contra un tejido (34). Lo importante es utilizar los
controles negativos correctos que permitan enriquecer la biblioteca hacia el objetivo que se ha
planteado ya sea de diagnóstico, de terapia o simplemente de afinidad. Incluso, existen
metodologías que han implementado protocolos in silico con softwares computacionalmente
muy demandantes que permiten ahorrar pasos en las rondas de SELEX (35). Además, hay que
mencionar que la era del secuenciamiento también ha impactado positivamente a la
tecnología de aptámeros brindándole el conocimiento de las secuencias que van
enriqueciendo con el fin de entender los principios en los que se rigen estos enriquecimientos.
Una razón más para utilizar los aptámeros radica en el hecho de que estas moléculas son de
fácil manejo y pueden ser insertadas en plataformas de sensores que ha producido la era de
los nanomateriales (36).

Aptámeros: agentes diagnósticos y terapéuticos

Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, que reconocen una gran
variedad de moléculas. Cada aptámero posee una estructura tridimensional particular que le
permite unirse con afinidad y especificidad altas a la molécula diana. Los aptámeros tienen
propiedades de reconocimiento equiparables a las de los anticuerpos; sin embargo, por la
naturaleza de su composición tienen ventajas significativas en cuanto a su tamaño, producción
y modificación. Estas características los hacen excelentes candidatos para el desarrollo de
nuevas plataformas biotecnológicas. Se han identificado aptámeros con propiedades
terapéuticas que han sido evaluados exitosamente en modelos animales; entre ellos, algunos
se encuentran en fase clínica y uno ya fue aprobado para tratamiento por la FDA (Food and
Drug Administration). Todos estos avances ocurridos durante las dos últimas décadas permiten
anticipar el protagonismo que tendrán los aptámeros como agentes diagnósticos y
terapéuticos en un futuro cercano.

INTRODUCCIÓN

Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, con una estructura
tridimensional específica que les permite unirse con alta afinidad a la molécula diana.
Etimológicamente el término aptámero proviene del latín aptus que significa ‘fijar’ o ‘unir’ y
del griego meros que significa ‘partícula’. En 1990, dos grupos diferentes identificaron el
método para la generación de aptámeros denominado SELEX (por la sigla en inglés de
systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (1,2). Este método utiliza la
química combinatoria para la selección de ácidos nucleicos sintéticos con alta afinidad por su
molécula diana. La química combinatoria consiste en la síntesis de un número significativo de
moléculas de estructura similar que forman colecciones (bibliotecas) consiguiendo una gran
diversidad química, y en la cual se puede tamizar una molécula diana para encontrar miembros
(es decir, secuencias) de dicha biblioteca que presenten afinidad (3). En SELEX, estas
secuencias individuales se han denominado aptámeros. El método SELEX (figura 1) consiste en
la selección de los miembros de una biblioteca (aproximadamente 1015 secuencias diferentes)
que se unen a la molécula diana. Se puede dividir este método en tres pasos principales: 1) la
interacción entre los miembros de la biblioteca y la molécula diana; 2) la selección de los
miembros que poseen afinidad por la molécula diana y 3) el enriquecimiento de la biblioteca
mediante amplificación usando PCR (por la sigla en inglés de polymerase chain reaction). La
composición natural de los aptámeros incluye ADN y ARN. Sin embargo, se han incorporado
satisfactoriamente al proceso enzimático o de síntesis secuencias con ácidos nucleicos
modificados. Estos últimos han sido evaluados exitosamente mediante ensayos in vitro o
modelos in vivo (4). En el caso de ADN-SELEX (5), la doble cadena se separa y una de sus
cadenas sencillas es la forma funcional de la biblioteca. En ARN-SELEX (6) se requieren la
transcripción para hacer funcional la biblioteca partiendo de ADN y la transcripción reversa
para enriquecerla posteriormente mediante PCR (7). La posibilidad de obtener aptámeros bajo
condiciones diferentes a las fisiológicas abre la puerta para la selección de elementos de
reconocimiento en condiciones no convencionales. Un ejemplo de la versatilidad en este
aspecto es la toxicidad de una molécula diana. La selección de aptámeros no se ve limitada en
ningún caso por la toxicidad u otras condiciones diferentes a las fisiológicas, dado que el
proceso se lleva a cabo in vitro. Esta es una ventaja de los aptámeros con respecto a los
anticuerpos, que generalmente solo pueden ser generados en condiciones fisiológicas (8), en
las que la toxicidad es un factor determinante. Por lo anterior, es poco probable o no viable el
desarrollo de anticuerpos para un gran número de toxinas. En la actualidad se ha seleccionado
un buen número de aptámeros que reconocen una gran variedad de moléculas diana (9), entre
las cuales se encuentran: toxinas, compuestos inorgánicos y orgánicos, nucleótidos y sus
derivados, cofactores, aminoácidos, carbohidratos, antibióticos, péptidos y proteínas, al igual
que estructuras complejas como células (7). Esta diversidad de aptámeros, aunada al hecho de
que su selección se hace sin importar el pH o la toxicidad de la molécula diana, lleva a
considerar el SELEX como un método genérico (10) que teóricamente permitiría seleccionar
aptámeros para cualquier molécula bajo las condiciones elegidas. La afinidad de los aptámeros
se encuentra muy frecuentemente en un rango bajo de nanomolaridad, similar a la reportada
para los anticuerpos (11). En los aptámeros la afinidad está ligada al número de ciclos de SELEX
que se lleven a cabo y a la efectividad del proceso de separación de secuencias que se unen
con alta o baja afinidad a la molécula diana. En algunos casos ha sido posible obtener
aptámeros con afinidades destacadas que evidentemente superan a los anticuerpos y para las
que se reportan valores de un dígito picomolar (12). La especificidad mostrada por los
aptámeros es otra característica interesante de estos elementos de biorreconocimiento, que
se evidencia en su capacidad para diferenciar cambios estructurales mínimos entre la molécula
diana y moléculas inespecíficas. Un ejemplo claro de esta característica es el aptámero
antiteofilina, que distingue específicamente la teofilina de la cafeína, a pesar de que solo un
grupo metilo diferencia estas dos moléculas (13). En la mayoría de las aplicaciones médicas, se
logran altos niveles de afinidad y especificidad utilizando anticuerpos (14), pero existen
limitaciones en el uso de estos en diversas pruebas clínicas. Algunas de estas limitaciones
están relacionadas principalmente con su producción (se requieren animales o células),
variabilidad de cada lote de anticuerpos (15), frecuente inmunogenicidad, su tamaño que
dificulta el acceso a compartimentos biológicos pequeños y su susceptibilidad en procesos de
desnaturalización (12). En contraste, los aptámeros se seleccionan in vitro y se generan de
forma reproducible utilizando procedimientos convencionales de síntesis en fase sólida con el
método de la fósforo-amidita (16). De igual forma, se los puede modificar fácilmente en el
proceso de síntesis para mejorar su estabilidad frente a nucleasas o adicionarles grupos
funcionales (ejemplo: grupos fluorescentes) para incrementar su aplicabilidad (17). La tabla 1
muestra las principales ventajas y desventajas en el uso de aptámeros y anticuerpos.

Figura 1. SELEX (systematic evolution of ligand by exponential enrichment). A) El inicio consiste

en la síntesis química de la biblioteca, que contiene aproximadamente 1015 secuencias
diferentes. B) La biblioteca y la molécula diana entran en contacto y solo los miembros con
afinidad permanecen unidos. C) Se separan los miembros de la biblioteca que se unen y se
descartan las secuencias con poca afinidad por la molécula diana. D) Enriquecimiento
mediante PCR en las bibliotecas de ADN o por transcripción reversa y PCR en el caso de las
bibliotecas de ARN. E) Comienza un nuevo ciclo, que se repetirá hasta encontrar bibliotecas
que contengan un grupo indeterminado de secuencias que se unen a la molécula diana. F)
Secuenciación del último ciclo para determinar las secuencias individuales con alta afinidad.

Se ha explorado la utilización de aptámeros como elementos de biorreconocimiento en el

desarrollo de numerosos tipos de biosensores, integrándolos de forma eficiente a distintos
sistemas transductivos (18-20). Una ventaja de los aptámeros en el desarrollo de biosensores
es la estabilidad durante su vida útil, que es generada por su naturaleza química. Los
aptámeros pueden ser desnaturalizados mediante aumento de la temperatura o del pH, pero
luego pueden retornar a su estado activo utilizando las condiciones óptimas de
reconocimiento (buffer, temperatura, etc.) (21). Todo lo anterior contrasta con los anticuerpos
en los que cualquier episodio de desnaturalización generalmente les produce una pérdida en la
capacidad de reconocimiento y por lo tanto en su función en un sensor (22). Es de destacar
que algunos aptámeros han sido adaptados exitosamente a métodos convencionales como
ELISA (23), PCR (24), citometría de flujo (25) y microscopía de fluorescencia (26). De igual
forma, algunas técnicas mucho más sofisticadas han incorporado los aptámeros como
moléculas de reconocimiento; entre ellas se encuentran SPR (por la sigla en inglés de
superficial plasmon resonance) (27) y AFM (por la sigla en inglés de atomic force microscopy)
(28). Uno de los ejemplos más claros de la flexibilidad que ofrecen estos ácidos nucleicos es el
aptámero antitrombina (TBA, por la sigla en inglés de thrombin-binding aptamer): es una
secuencia de ADN con 15 oligonucleótidos (5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’) y es posiblemente el
aptámero más popular y con el mayor número de aplicaciones científicas, con más de 400
publicaciones. TBA fue seleccionado por Bock y colaboradores (29) y desde entonces se lo ha
utilizado como modelo en diversas aplicaciones nanotecnológicas (30,31). Una particularidad
de este aptámero es su estructura G-cuádruple (figura 2), que ha facilitado su adaptación a
diferentes biosensores entre los que se destacan los de tipo óptico (32), fluorescente (33) y
electroquímico (21). Con la idea de profundizar en el diagnóstico clínico y la terapia basados en
aptámeros, hemos seleccionado un ejemplo representativo en cada caso. Analizaremos los
aptámeros anti-IgE y anti-VEGF en los contextos diagnóstico y terapéutico, respectivamente.

Aptámeros en el diagnóstico clínico : A pesar de los grandes avances en la identificación de

aptámeros y la utilidad demostrada como moléculas de biorreconocimiento, solo en algunos
casos se los ha utilizado en el diagnóstico en muestras clínicas. Por esa razón, se puede decir
que aún falta un paso definitivo que genere evidencia sobre su aplicabilidad en dicho
diagnóstico. Sin embargo, un gran avance en esta dirección lo están llevando a cabo Gold y
colaboradores (34). Recientemente han descrito un sensor proteómico basado en aptámeros
que mide simultáneamente 813 proteínas diferentes provenientes de una pequeña muestra de
sangre. La efectividad clínica de este multisensor se demostró mediante la identificación del
perfil de proteínas de enfermedades como la falla renal crónica y el cáncer de pulmón. Es, sin
duda, un buen comienzo para la entrada definitiva de los aptámeros en el campo del
diagnóstico clínico. Otro buen ejemplo en este sentido es el aptámero anti-IgE que se utilizó en
la identificación de IgE presente en el suero sanguíneo de 50 muestras clínicas (35).
Utilizaremos este aptámero como modelo ilustrativo de la aplicabilidad de estos elementos de
biorreconocimiento en muestras clínicas.

Aptámero anti-IgE: Las personas que sufren cuadros alérgicos presentan con frecuencia
niveles elevados de IgE comparadas con las no alérgicas. Por lo tanto, se puede deducir la
importancia de cuantificar los niveles de IgE en el tratamiento de un episodio alérgico (36). La
determinación de IgE se hace generalmente mediante ELISA o radioinmunoanálisis (RIA). Sin
embargo, estos métodos son costosos y consumen mucho tiempo (37). Partiendo de la
necesidad de una detección de IgE mucho más rápida y confiable, Yao y colaboradores
desarrollaron un sensor basado en aptámeros que mide en 15 minutos los niveles de IgE, de
forma específica y reproducible (35). Este sensor utiliza una microbalanza de cristal de cuarzo
en la que previamente se ha inmovilizado el aptámero anti-IgE. Una vez que dicho aptámero
reconoce la IgE en solución (suero), el biosensor traduce su nivel que es directamente
proporcional a la masa depositada en él (figura 3). Este tipo de dispositivos abre una puerta
hacia la utilización generalizada de aptámeros en muestras clínicas, campo en el que aún
predominan los anticuerpos como moléculas de biorreconocimiento. Es posible entonces, que
la tecnología basada en aptámeros sea una alternativa futura para el diagnóstico clínico,
cuando se generen sensores eficientes y de bajo costo que puedan competir con los métodos
convencionales.

Figura 3. Esquema de la detección de IgE utilizando aptámeros: el dispositivo desarrollado por

Yao y colaboradores utiliza una microbalanza de cuarzo, en la que previamente se inmoviliza el
aptámero anti-IgE (A). Se inyecta el suero sanguíneo (B) y la IgE presente en la muestra se
detecta por el aptámero anti-IgE. La unión entre el aptámero anti-IgE y la IgE presente en la
solución genera un aumento de la masa en la superficie del sensor (C). Este cambio de masa se
traduce en un cambio de frecuencia (señal) que es directamente proporcional a la
concentración de IgE.

Aptámeros como agentes terapéuticos: Los aptámeros han tenido un gran impacto en el
desarrollo de nuevas terapias; se destacan las orientadas a las enfermedades hematológicas
(38), el cáncer (39) y la infección por VIH (40). En la revisión llevada a cabo por Keefe y
colaboradores, se recopilaron los aptámeros más destacados en modelos terapéuticos (12).
Los aptámeros se pueden usar en dos formas diferentes en el desarrollo de procesos
terapéuticos: 1. Como moléculas efectoras para reconocer un receptor y ejercer directamente
la función terapéutica (41); 2. Como vehículos para la entrega de una molécula secundaria. En
este caso, se utiliza el aptámero únicamente como elemento de biorreconocimiento, que es
modificado con la molécula secundaria encargada de la acción terapéutica (42,43). Dada la
facilidad de modificación de los aptámeros, incluso en el proceso de síntesis, actualmente
están compitiendo con péptidos (44) y anticuerpos (45) en el desarrollo de nuevos enfoques
terapéuticos, lo que evidencia el notorio avance logrado durante los últimos años en este
campo. En la actualidad ocho aptámeros se encuentran en fase clínica y uno ya fue aprobado
para uso clínico (tabla 2). Este último es el aptámero anti-VEGF (por la sigla en inglés de
vascular endothelial growth factor) y lo analizaremos más detenidamente a manera de
ejemplo.
Aptámero anti-VEGF: El anti-VEGF (pegaptanib - Macugen®) es el primer aptámero aprobado
por la FDA y se lo utiliza en el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad
(DMAE) (55,56). Esta enfermedad oftalmológica se caracteriza por el deterioro de la mácula,
tejido de color amarillento sensible a la luz, localizado en el centro de la retina, cuya función
está ligada a la nitidez visual; por lo tanto, está encargado de las percepciones visuales finas
(57). El proceso patológico consiste en la pérdida de nitidez y agudeza visuales. De hecho, la
DMAE es la principal causa mundial de ceguera (58). Por esta razón, se han hecho esfuerzos
significativos para el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad. Una de las
estrategias se basa en utilizar el aptámero anti-VEGF inyectado intravítreo que reconoce la
molécula VEGF165, lo que inhibe la unión a su receptor natural y es así como se genera el
proceso terapéutico, porque se evita la proliferación y migración de vasos sanguíneos hacia el
humor vítreo (59). Los reportes de la utilización de este aptámero son promisorios: ha
generado una inhibición de 65% y 80% en modelos animales y 80% de los pacientes que
participaron en las pruebas clínicas se estabilizaron o mejoraron después de tres meses de
tratamiento (49). En la actualidad más de 50.000 pacientes han sido tratados con pegaptanib
con resultados satisfactorios (49). Con base en aptámeros hay, sin lugar a dudas, una
posibilidad real de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos y cabe destacar que se están
adelantando pruebas clínicas para otros aptámeros de los que se tendrán noticias en los
próximos años. Esperamos entonces que el aptámero anti-VEGF sea solo el inicio de una
generación de nuevos agentes terapéuticos.
Los aptámeros, término que deriva de la palabra latina “aptus” que significa encajar y de la
palabra griega “meros” que significa molécula, son moléculas de RNA o DNA de cadena sencilla
capaces de reconocer de forma estable, específica y con alta afinidad una molécula diana
debido a la estructura que son capaces de adoptar. La unión del aptámero, que presenta
formas complejas como son tallos, horquillas, bucles, motivos pseudoknots, G-tríplex, G-
cuádruplex etc. (Figura 6) a la diana, es el resultado de una combinación de interacciones
equimoleculares en el complejo de unión, que consisten en fuerzas de complementariedad de
bases, interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y puentes de hidrógeno y Patel,
2000). Existen programas informáticos especializados que pueden predecir las estructuras
secundarias de los aptámeros en base a sus secuencias e incluso detectar la posibilidad de que
presenten G-cuádruplex, como los programas Mfold y QGRS Mapper.

Los aptámeros, en base a sus estructuras tridimensionales, pueden unirse a una amplia
variedad de dianas, ya sean moléculas sencillas, complejas u organismos enteros. Se han
descrito aptámeros frente a moléculas inorgánicas, orgánicas de pequeño tamaño (Grate y
Wilson, 2001), proteínas, carbohidratos, nucleótidos, antibióticos, virus e incluso células,
tejidos y organismos enteros. Los diferentes experimentos SELEX demuestran que la selección
es posible para, en principio, cualquier diana que se encuentre en cantidad suficiente y con
alto grado de pureza. Existe una base de datos con una relación de todos los aptámeros
publicados frente a diversas dianas.

En muchos aspectos, la población de aptámeros enriquecida podría asemejarse a anticuerpos

policlonales, y los aptámeros individuales obtenidos a partir de la población, podrían
asemejarse a anticuerpos monoclonales. Los aptámeros presentan una serie de ventajas
respecto a los anticuerpos (Tabla 3). En primer lugar, el proceso de selección in vitro permite
un mayor control de las condiciones de unión a la diana siendo independiente de la utilización
de animales y siendo también aplicable a condiciones no fisiológicas. En segundo lugar, los
aptámeros son más estables y pueden ser desnaturalizados reversiblemente cambiando las
condiciones, mientras que la desnaturalización de los anticuerpos es irreversible. Además, a
diferencia de los anticuerpos, los aptámeros pueden ser generados frente a dianas tóxicas o
dianas que no provocan respuesta inmunológica in vivo. Otra ventaja es que los aptámeros
presentan baja o ninguna inmunogenicidad lo que es importante en aplicaciones terapéuticas
en animales o humanos. Y también, la naturaleza nucleotídica de los aptámeros permite
modificaciones y la introducción de grupos funcionales para mejorar la estabilidad o la unión a
la diana así como su rápida producción a gran escala. Los aptámeros tienen algunas
limitaciones ya que su estructura terciaria es muy dependiente de las condiciones en las que se
encuentren, son fácilmente degradados en sangre y presentan una menor diversidad biológica
que los anticuerpos. Sin embargo, algunos de estos problemas pueden ser solucionados
mediante modificaciones químicas. Al igual que los anticuerpos, los aptámeros modificados
pueden ser utilizados en diversas técnicas como ELISA/ELON, western blot, electroforesis
capilar, citometría de flujo, imágenes in vivo, HPLC y microarrays. Los aptámeros también
pueden emplearse en otras aplicaciones analíticas como cromatografía, espectrometría de
masas, sensores y biosensores, ya que son herramientas moleculares importantes para la
identificación de dianas y para estudios diagnósticos y terapéuticos.

La interacción entre los aptámeros y sus dianas, y los efectos que producen en determinados
procesos y mecanismos reguladores celulares, se utilizan tanto en investigación básica, como
en el desarrollo de nuevas herramientas para terapias y métodos de diagnóstico en medicina.
El primer aptámero aprobado para uso terapéutico en humanos es pegaptanib, denominado
también Macugen. Este aptámero es administrado localmente y une e inhibe la isoforma del
VEGF implicada en la degeneración macular relacionada con la edad, reduciendo el
crecimiento patológico de ciertos vasos sanguíneos. Otros aptámeros que están siendo
desarrollados y estudiados en clínica son REG1/RB006/RB007 (Regado Biosciences, USA) que
es específico para el factor de coagulación IXa y se utilizaría como anticoagulante reversible
durante intervenciones coronarias percutáneas (Chan y col., 2008), ARC1779 (Archemix, USA)
que se une al dominio A1 del factor von Willebrand inhibiendo su unión a las plaquetas y
produciendo un efecto antitrombótico (Diener y col., 2009), así como NOX-A12 y NOXE36
(NOXXON Pharma, Alemania) que son específicos de citoquinas y se utilizarían en el
tratamiento de múltiples mielomas y en diabetes tipo 2. En lo que respecta al tratamiento del
cáncer, se han descrito recientemente aptámeros que parecen tener un elevado potencial
como agentes terapéuticos. con capacidad para internalizarse en células acoplados a RNA de
interferencia, conjugados con toxinas o con drogas . En cáncer, el aptámero más desarrollado
es el AS1411 o AGRO001 (Antisoma, UK), que es rico en guaninas y tiene efectos
antiproliferativos, ya que se une a la nucleolina de la superficie celular de las células
cancerosas y se internaliza llevando a la inhibición de la replicación del DNA. Este aptámero
actualmente se encuentra en ensayos clínicos en fase II para el tratamiento de la leucemia
mieloide aguda. En estudios preclínicos, el aptámero de DNA, GBI-10 se une a la tenascina C,
proteína de la matriz extracelular de algunos tumores. Se han descrito aptámeros peptídicos
que se unen al factor STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3)
produciendo apoptosis en las células tumorales y aptámeros de RNA frente a las proteínas Ku
relacionadas con la reparación del DNA (Zhang y col., 2004). El hecho de que los aptámeros
sean capaces de diferenciar dianas distintas pero muy relacionadas que permitan discernir
entre células tumorales de las que no lo son es muy importante en cáncer. Se han generado
aptámeros capaces de distinguir isoformas de la proteína quinasa C (PKC) 4) y capaces de
reconocer el estado nativo y desnaturalizado de ERK2.

Además, existen aptámeros que interaccionan con proteínas que regulan los pasos de
iniciación en la síntesis de proteínas y que inhiben la traducción dependiente de cap. Hay
aptámeros frente al eIF4E que inhiben la síntesis de proteínas, pero no su interacción con 4E-
BP1 (Mochizuki y col., 2005), y frente al factor eIF4A, que inhiben la hidrólisis de ATP, pero no
interfieren en la unión al eIF4G . Se han seleccionado varios aptámeros frente al factor eIF4G
con capacidad para detener la traducción, algunos de ellos se unen a las regiones que
interactúan con eIF4A y eIF3, mientras que otros inhiben fuertemente la traducción
dependiente de cap por un mecanismo desconocido. La tecnología de los aptámeros
representa un amplio campo de estudio que no sólo permite la obtención de nuevas
herramientas en investigación básica, sino también avances en medicina aplicables a la
prevención, diagnóstico y tratamiento de múltiples enfermedades.

. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES: Desde que aparecieran los aptámeros en 1990 (1), se ha

abierto un gran campo de posibilidades a su paso. Los aptámeros se definen como una
secuencia sencilla de oligonucleótidos de ADN o ARN, de corta longitud que reconocen
moléculas diana. Debido a su sencilla y corta estructura puede plegarse tridimensionalmente
con facilidad de forma que su unión a la molécula diana, sea ésta pequeña o un complejo
multimérico es muy estable.
Las propiedades que se conocen de los aptámeros son muchas, comparten algunas con otros
elementos de reconocimiento como pueden ser los anticuerpos, y en otras difieren, como en
su naturaleza química o en su método de síntesis, y son estas diferencias las que hacen al
aptámero atractivo para la investigación. Las características principales de los aptámeros son
su elevada afinidad y especificidad. La estructura tridimensional que ofrece el aptámero
permite que la interacción con la diana sea adecuada y precisa, aumentando así las
posibilidades del aptámero. A medida que se avanza en las etapas del procedimiento Selex,-
método del que hablaré más adelante- se consigue mejorar y optimizar la selección hasta
llegar a un aptámero óptimo.

En la actualidad, los campos de aplicación (3) de los aptámeros son los siguientes:

- Diagnóstico clínico y análisis de alimentos: es un campo relativamente nuevo y los inicios van
dirigidos al empleo de aptámeros como elemento de reconocimiento (bioreconocimiento) en
diferentes tipos de biosensores. La gran ventaja de utilizar el aptámero en un biosensor es la
alta estabilidad que ofrece debido a su naturaleza química.

- Terapia: la interacción con la molécula diana permite la búsqueda continua de fármacos,

aptámeros como fármacos para distintas patologías, en esta línea muchos aptámeros se
encuentran en fases avanzadas de ensayos clínicos, fase III y alguno ya está comercializado
como el Macugen.

- Investigación y biotecnología: debido a la especificidad de la interacción aptámerodiana y a

las buenas propiedades de reconocimiento que tienen, surgen diferentes líneas de
investigación biotecnológica con aptámeros, cada vez más específicas y precisas, cualquier
nueva molécula diana puede ser un objetivo perfecto para la investigación con un aptámero.
Los fines, que a día de hoy, se persiguen en investigación con áptameros son terapéuticos o
clínicos en su mayoría pero también hay estudios sobre otros campos, como pueden ser la
industria alimentaria- detección de gluten- o la industria agroalimentaria o química. Todo esto
hace que los aptámeros sean de gran interés en el ámbito sanitario, y así mismo explica la
revolución que están teniendo, en menos de 30 años son muchos los avances que han
generado y es una línea de trabajo cada vez mayor.

Diferencias entre aptámeros y anticuerpos:

A lo largo de la historia, los anticuerpos han permitido grandes avances en los ensayos de
diagnóstico y hoy en día son indispensables en las pruebas diagnósticas. Con la llegada del
Selex, procedimiento de enriquecimiento exponencial se hizo posible el aislamiento de
secuencias de oligonucleótidos capaces de reconocer un amplísimo número de moléculas
diana con alta especificad y afinidad, a estas secuencias se les conoce como aptámeros. Estas
moléculas están empezando a sustituir o rivalizar en muchos procesos clínicos y terapéuticos.
Así mismo los ensayos sobre enfermedades nuevas o emergentes están en auge, y los
aptámeros, conjugados o no con Ac, puede ser una opción clave en el mercado farmacéutico.

Según Jayasena (4) es necesario realizar una comparativa crítica entre aptámeros y
anticuerpos:

 La producción de anticuerpos se realiza en el interior de los animales o células, es decir es un

proceso “in vivo” dependiente del animal, esto provoca ciertas dificultades. No es un proceso
reproducible ya que se ve afectado por la variabilidad interindividual. Por esto, es habitual
encontrar variación entre lotes. Así mismo, la generación de anticuerpos para moléculas que
no son bien toleradas en animales, como las toxinas, se hace difícil.

 La identificación y producción de anticuerpos monoclonales es un proceso muy laborioso y

puede llegar a ser excesivamente caro en la búsqueda de anticuerpos raros que requieren el
cribado de un gran número de colonias.

 La identificación de anticuerpos que podrían reconocer dianas bajo condiciones distintas de

las condiciones fisiológicas es inviable. No se pueden modificar los parámetros in vivo, y esto
restringe y limita mucho la identificación. Además los parámetros cinéticos de las interacciones
anticuerpo-diana tampoco se pueden cambiar a demanda, por todo esto ofrecen un estrecho
margen de variabilidad.

 Los anticuerpos son sensibles a la temperatura y a la desnaturalización, siendo un proceso

irreversible. Además tienen una vida útil limitada.

Para satisfacer estas limitaciones y de forma alternativa se pueden considerar los aptámeros.
En esta línea, los aptámeros ofrecen las siguientes ventajas:

 La síntesis de aptámeros se realiza in vitro, no es un proceso dependiente de animales o

células. Por tanto es un proceso sencillo y reproducible mostrando una alta pureza, se espera
poca o ninguna variación entre lotes. Al no ser un proceso dependiente, toxinas y moléculas
que no ofrecen una buena respuesta inmune si pueden formar complejos estables con los
aptámeros.

 Las condiciones de selección pueden ser manipuladas, es decir, se pueden obtener

aptámeros con las propiedades deseadas para el diagnóstico in vitro. No se tiene que trabajar
siempre bajo condiciones fisiológicas, lo mismo sucede con los parámetros cinéticos que se
pueden cambiar según se requiera. Este trabajo tiene una finalidad docente. La Facultad de
Farmacia no se hace responsable de la información contenida en el mismo.

 Los aptámeros son sensibles a la desnaturalización, pero el proceso es reversible. Una vez
desnaturalizado, la regeneración del aptámero puede ser cuestión de minutos. Son estables a
temperatura ambiente y se pueden almacenar a largo plazo.

Método SELEX

Los aptámeros se obtienen por un método conocido como método SELEX (5), Systematic
evolution of ligands by expontential enrichment (Evolución Sistemática de ligandos por
Enriquecimiento Exponencial) proceso que nació de la mano de Larry Gold alrededor del año
1990 con el objetivo de obtener oligonucleótidos de una sola cadena que se unan a moléculas
diana con elevada especificidad y afinidad. El punto de partida de este proceso es una
biblioteca de oligonucleótidos, fragmentos de ADNss (1015 moléculas) que tiene secuencias
conocidas fijas en los extremos 5´ y 3´ y una región central de secuencias al azar. Estas
secuencias se sintetizan químicamente mediante métodos en fase sólida añadiendo una
mezcla de los cuatro nucleótidos trifosfato de forma aleatoria. El método SELEX genera una
gran cantidad de aptámeros los cuales se pueden aplicar en muchos campos de estudio
(industria alimentaria, analítica, clínica…), por tanto tener claro y definido el objetivo (molécula
diana, blanco) optimiza el proceso. El siguiente paso en el proceso SELEX, es seleccionar, de
esas secuencias aleatorias, cuales se unen de forma selectiva y específica a la molécula diana,
X. La unión aptámero-objetivo se realiza por complementariedad de forma, interacciones
electrostáticas entre grupos con carga o enlaces de hidrógeno. Hay grupos que favorecen la
interacción, ya sea por volumen, carga eléctrica u otro motivo; y en esta línea, la presencia de
grupos amino primarios, donantes de hidrógeno o grupos aromáticos en la molécula diana
facilitan la selección del aptámero. Por el contrario, dianas con grupos hidrófobos o cargados
negativamente (por ejemplo, grupos fosfatos) dificultan la unión. En esta etapa de selección
del procedimiento SELEX se incluye la unión de las moléculas diana con las secuencias de la
biblioteca de oligonucleótidos, la eliminación de los oligonucleótidos no unidos, y finalmente la
elución de los oligonucleótidos ligados. La selección está diseñada para encontrar esas
moléculas de entre la gran variedad de secuencias presentes en la biblioteca de
oligonucleótidos con la mayor afinidad y especificidad para la molécula diana de interés, por
eso se realizan entre 6-10 ciclos. Por lo tanto, la biblioteca de oligonucleótidos está expuesta
directamente a la diana y se incuba durante un determinado tiempo. La interacción entre la
diana y los oligonucleótidos dependerá de muchos factores, y en particular de cuál sea el
objetivo, es decir para el fin al que se destine ese aptámero. La separación entre complejos
unidos y secuencias libres tiene que ser muy eficaz, existen dos posibilidades; con
inmovilización de la molécula diana, o sin inmovilización. En el primer caso, se pueden usar
técnicas como la cromatografía de afinidad que incluye a la molécula diana en una matriz de
agarosa o sefarosa en columna en grandes cantidades, o mejor, el uso de perlas magnéticas
que necesita menos cantidad de diana y el manejo es más sencillo. Sin embargo, sin necesitar
el inmovilizado de la diana existen procesos como: la ultrafiltración con filtros de
nitrocelusosa, electroforesis capilar o citometría de flujo. Un parámetro que mide la afinidad
de la unión es la Kre (constante de disociación), cuanto más baja sea mayor afinidad por la
diana muestra el aptámero. El proceso continúa con la eliminación de las secuencias no unidas
mediante lavados rigurosos y los complejos formados se eluyen de la molécula diana para
repetir nuevamente el ciclo SELEX. La elución se puede llevar a cabo con procesos
desnaturalizantes como el tratamiento térmico o por la adición de sustancias especiales como
urea, SDS o EDTA. Finalmente hay una etapa de amplificación para tener suficientes secuencias
para los fines a los que se destine. En esta línea, los procesos de SELEX para la generación de
aptámeros de ARN y ADN difieren significativamente. En el caso de ARN es más complejo, los
oligonucleótidos de ARN primero tienen que someterse a una PCR de transcripción inversa (RT-
PCR). Como resultado, se obtiene el ADN complementario, cADN correspondiente, que
posteriormente se amplifica en una PCR. Por el contrario, los aptámeros de ssDNA
simplemente tienen que amplificarse mediante PCR, donde se pueden usar cebadores
especiales para proporcionar a los aptámeros propiedades adicionales.

Se utiliza el sistema estreptavidina/ biotina de varias formas. Algunos analíticos añaden la

biotina a la hebra no deseada y utilizan la diferencia de tamaños que surge en la electroforesis
en gel para distinguir entre ambas hebras, y otros permiten al dsDNA (sólo una hebra
biotinilada) que se añada a la estreptavidina (placas o perlas) y se separan tras la
desnaturalización del DNA. Con todo este proceso, la complejidad de la biblioteca inicial se
reduce y los candidatos “target-binding” se enriquecen enormemente. El número de ciclos
necesarios para el enriquecimiento óptimo es variable ya que depende de varios factores: el
lugar al que se destina y su concentración, las condiciones de selección, la proporcionalidad de
oligonucleótidos-molécula diana, la eficacia del paso de división…Cuando el enriquecimiento
de la biblioteca no pueda ser mayor, generalmente- después de 6-20 rondas de selección- se
determinan las secuencias de nucleótidos individuales, secuenciación y clonación. Así mismo,
se pueden realizar modificaciones Post-SELEX con el fin de aumentar la estabilidad de los
aptámeros y optimizar los parámetros de unión a la diana.

SELEX:

El primer experimento de SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)

fue realizado en 1990 por Craig Tuerk mientras estudiaba la autorregulación del fago T4, la
cual se produce a través de la unión de la proteína del gen 43(T4 DNA polimerasa) con su
propio ARN mensajero(31). Esta unión proteína-ARN responde a la formación de una
estructura secundaria, de tipo horquilla, que presenta un tallo y un lazo con un motivo de 8
bases. Con la finalidad de conocer la importancia de cada nucleótido de este motivo, Tuerk
realizó una biblioteca de secuencias de ARN con mutaciones aleatorias en las 8 bases del lazo y
la enfrentó a la proteína del gen 43 en ensayos de unión de manera repetitiva, con lo que
descubrió al final de estos ciclos que sólo dos secuencias unían exitosamente la proteína: la
secuencia original y una secuencia con 4 mutaciones(32). Este hallazgo cimentó las bases
metodológicas del SELEX y generó la idea de utilizar este método con la intención de
seleccionar oligonucleótidos de hebra simple con fines aplicados y comerciales, a los cuales se
les denominó aptámeros(33). El método de SELEX describe en su nombre su principio de
trabajo: “Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial”. En este se
utiliza una biblioteca químicamente sintetizada de ARN o ADN de hebra simple que posee una
zona central aleatoria y dos extremos fijos complementarios a sondas específicas para
amplificar el ácido nucleico. La hipótesis bajo la que trabaja todo SELEX es la siguiente: En una
biblioteca tan diversa existe al menos una secuencia de alta afinidad a la molécula blanco(34).
Esta biblioteca es incubada con moléculas blanco en condiciones controladas con la finalidad
de separar aquellas secuencias capaces de unirse al blanco de aquellas que no. Las secuencias
capaces de unirse son luego amplificadas a través de PCR, con sondas específicas a los
extremos fijos de la secuencia, generando una nueva biblioteca menos diversa y más
enriquecida con secuencias capaces de unir el blanco. Este proceso de incubación y
amplificación que se realiza de manera repetitiva se conoce como ciclo de SELEX y las
condiciones durante estos ciclos se vuelven cada vez más estrictas con la finalidad de
aumentar el enriquecimiento y afinidad de los oligonucleótidos al blanco. Finalmente, a partir
de las bibliotecas enriquecidas se obtienen potenciales aptámeros a través de
secuenciamiento, los cuales son evaluados para determinar su capacidad de unión y
cinética(32)(35). La metodología convencional establecida por Tuerk en 1990 requería de 20
ciclos a más. Sucesivamente se reportaron variaciones del método con la finalidad de acortar
el tiempo de trabajo requerido para seleccionar un aptámero(36)(37). Métodos como SELEX
usando electroforesis capilar, SELEX basado en partículas magnéticas, Cell-SELEX, in vivo-
SELEX, etc. (revisado en estudios de Ruml (35)). Dentro de estos uno de los más utilizados es el
SELEX con partículas o beads magnéticos, ya que facilita el proceso de separación (Figura. 2).
En este método se unen las moléculas blanco a beads magnéticos los cuales son enfrentados a
la biblioteca, luego de un periodo de incubación se procede a la separación con un imán, que
facilita el retiro de las moléculas que no fueron capaces de unirse al blanco. SELEX usando
beads llevó obtener aptámeros para moléculas como 4-cloroanilina, 2,4,6-tricloroanilina and
pentaclorofenol L(38).

Figura 2.- Esquema de SELEX basado en beads magnéticos. La biblioteca es incubada con beads
magnéticos cubiertos de moléculas blanco, luego se utiliza fuerza magnética para separar las
secuencias unidas de las no unidas y se procede a amplificarlas por PCR. Esto se repite hasta
obtener enriquecimiento, momento donde se secuencia y analiza los potenciales aptámeros.
Fuente: Darmostuk et al., 2014

Definición de aptámero: El término Aptámero fue utilizado por primera vez en el trabajo de
Ellington y Szostak en 1990(39), que desarrolló de manera independiente la misma estrategia
que Tuerk y Gold del mismo año(32). Este viene del griego Aptus y Meros, cuyas acepciones en
inglés son “to fit” y “particle” que en español se traduciría a “partícula que une” o “partícula
que encaja”. Un aptámero es una secuencia corta de ARN o ADN de hebra simple con ̴15- 100
nucleótidos cuya configuración 3D le otorga afinidad y especificidad con otras especies
químicas. El rango de posibles blancos de unión es amplio, iones(40), pequeñas moléculas(41)
hasta células(42) han sido utilizadas exitosamente para la selección de aptámeros. Aunque los
estudios iniciales seleccionaron aptámeros de ARN(32)(39), aptámeros de ADN de hebra
simple también han sido seleccionados exitosamente(38)(43). El gran avance de los primeros
se debe a dos aspectos: son biológicamente relevantes, como en el fago T4(32), y son
estructuralmente más versátiles. Los aptámeros presentan grandes ventajas al ser poco
costosos, simples de sintetizar y de mayor estabilidad, por lo que su selección se encuentra en
aumento(44).

Propiedades de los aptámeros: Evidencia estructural obtenida por cristalografía permitió

verificar que los aptámeros deben su capacidad de unión a su estructura terciaria(45). Estos
poseen motivos estructurales conocidos como horquillas, tallos, lazos y Gcuádruplex(46)(44)
que permiten la formación de bolsillos de unión, donde se producen interacciones de unión
débiles con la molécula blanco(33). Se han identificado enlaces van der Waals, puentes de
hidrógeno, fuerzas electrostáticas entre grupos cargados, interacciones hidrofóbicas y
apilamientos(44). Además, algunos aptámeros generan cambios conformacionales adaptativos
una vez unidos al blanco que les permiten la unión con gran afinidad(47). La especificidad
lograda con aptámeros ha permitido discriminar moléculas estructuralmente muy similares
como teofilina y cafeína(48), que sólo difieren en un grupo metilo, y enantiómeros como L-
arginina y D-arginina(49).

Ventajas sobre otros biosensores: Los aptámeros presentan ciertas ventajas respecto a otros
biosensores, como anticuerpos. Estas ventajas son debido a su naturaleza química, su método
de selección y la forma de producción (Tabla 1). Al ser ácidos nucleicos poseen bajas
probabilidades de generar inmunogenicidad y poseen alta estabilidad, especialmente los
aptámeros de ADN. A diferencia de las proteínas, pueden pasar por procesos cíclicos de
denaturación y renaturación(50), característica que les permite ser transportados a
temperatura ambiente y mantenerse en almacenamiento por largos periodos de tiempo(51).
Poseen una fácil y costo-efectiva producción, al ser sintetizados químicamente, lo cual genera
una nula o mínima variación entre lotes de producción en comparación con tejidos y animales
como es el caso de anticuerpos. Además, facilita realizar modificaciones que aumenten la
resistencia a nucleasas, incorporen fluoróforos u otros grupos químicos, permitiendo generar
biosensores rápidamente(44).

Por último, el método de selección permite una gran variedad de condiciones ambientales,
posibilitando la selección de aptámeros estables en condiciones variables, a diferencia de las
condiciones fisiológicas propias de anticuerpos. Por otro lado, el abanico de posibilidades es
amplio ya que permite la selección de aptámeros afines a moléculas no inmunogénicas, tóxicas
u otras especies químicas. En su conjunto, las propiedades arriba mencionadas convierten a los
aptámeros en biosensores muy versátiles.
Aplicaciones de los aptámeros En salud los aptámeros tienen dos aplicaciones de principal
interés, en diagnóstico y terapia. Como biosensores permiten el desarrollo o adaptación de
métodos diagnósticos de enfermedades, ya que poseen afinidades en el rango nM-µM y una
alta estabilidad. Los apta sensores hasta ahora probados, explotan reacciones electroquímicas,
fluorescentes y colorimétricas(53). Como herramientas terapéuticas, los aptámeros pueden
actuar como drogas, inhibir directamente o indirectamente de manera específica proteínas o
moléculas vitales(54). Además, pueden facilitar el transporte específico de drogas en unión con
micelas(52). Otras aplicaciones posibles son en bio-imágenes, detección de toxinas, análisis de
muestras en agricultura, ganadería, entre otras.

BIBLIOGRAFIA

Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to

bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990 Aug 3;249(4968):505–10.

Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature.
1990 Aug 30;346(6287):818–22.

Jayasena SD. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin
Chem. 1999 Sep;45(9):1628–50

Bruno J. Predicting the Uncertain Future of Aptamer-Based Diagnostics and Therapeutics.

Molecules. 2015 Apr 16;20(4):6866–87.