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Universidad de Zaragoza
Métodos en Biotecnología
CULTIVOS CELULARES
I.-
I.- PRINCIPIOS Y MÉ
MÉTODOS BÁ
BÁSICOS
II.-
II.- TÉCNICAS Y APLICACIONES
TEMARIO
1.-
1.- Monitorizació
Monitorización animal
2.- Cultivo celular I
3.- Cultivo celular II
4.-
4.- Separació
Separación celular
5.-
5.- Viabilidad celular
6.-
6.- Clonació
Clonación, transformació
transformación y transfecció
transfección
7.-
7.- PCR, tipos. Secuenciació
Secuenciación
8.-
- Separació
8. Separaci ó n de proteí
proteínas y proteí
proteínas recombinantes
9.-
9.- Western, Southern,
Southern, Northern blot y marcaje radioactico
10.-
10.- Inmunohistoquí
Inmunohistoquímica,
mica, inmunocitoquí
inmunocitoquímica
y enzimoinmunoensayo
1
Bibliografía
• Cultivo de células animales. Morgan and
Darling. (Ed Acribia)
• Casas comerciales: Sigma (www.Sigma-Aldrich.com)
Invitrogen (www.invitrogen.com)
• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/tecnicas_
de_cultivo_celular.htm
• http://www.protocol-
online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/
http://www.unizar.es/depfarfi/unidad_fisiologia/
DOCENCIA
METODOS EN BIOTECNOLOGÍ
BIOTECNOLOGÍA
TEORÍ
TEORÍA
PROGRAMA
CULTIVOS CELULARES I Y II
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CULTIVOS CELULARES
INTRODUCCIÓN
3
Concepto de cultivo celular
Conjunto de té técnicas que permiten el mantenimiento de las
células “in vitro”
vitro”, conservando el má
máximo de sus propiedades
fisioló
fisiológicas, bioquí
bioquímicas y gené
genéticas
Evolución histórica
.
European Collection of cell cultures: http://www.ecacc.org.uk
http://www.ecacc.org.uk /
4
Aplicaciones del cultivo celular
, Efecto proteí
proteína-
na-proteí
proteína)
na)
5
VENTAJAS DESVENTAJAS
- Control preciso del medio - Técnica sensible (asepsia)
ambiente extracelular - Cantidad y coste
- Homogeneidad de la muestra - Inestabilidad (pasajes)
- Economí
Economía - Validez del modelo “in vitro”
vitro” (ECVAM
- Motivaciones éticas European Center for Validation of
Alternative Methods,
Methods, etc)
ASPECTOS TÉCNICOS
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Tipos de cultivos
- Órganos
- Explantes primarios
- Cultivo celular
• Centrifugación
• Capacidad de adherencia al vidrio o
plástico
• Mediante unión a anticuerpos específicos
para determinados componentes
celulares
• Unión a anticuerpos acoplados a marcaje
fluorescente
• Microdisección de captura por láser
7
Separació
Separación de cé
células marcadas
por fluorescencia utilizando lá
láser
y campo elé
eléctrico
1.-
1.- Selecció
Selección por disgregació
disgregación, adhesió
adhesión y proliferació
proliferación
2.-
2.- Selecció
Selección por tasa de crecimiento hasta confluencia
8
EQUIPAMIENTO Y PRÁCTICA GENERAL
9
EQUIPAMIENTO BÁSICO:
10
ESTUFA - INCUBADOR DE CO2
11
PIPETEADORES
MATERIAL PLÁSTICO
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MEDIOS DE CULTIVO
Características:
Medio nutritivo tamponado e isotónico
Composición:
Sales inorgánicas (Ca2+ y Mg2+)
Fuente de energía y aminoácidos
Suplementos : Suero, glutamina y antibióticos
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Tipos de líneas celulares establecidas
1.- Adherentes: derivadas de órganos
músculo
hígado
células nerviosas
epitelios renal e intestinal
origen neuronal
2.- Suspensión: células inmunitarias
CULTIVOS PRIMARIOS Y
LÍNEAS PRIMARIAS
Cultivo primario. Cultivo establececido a partir de un tejido u órgano.
Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y no
se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción
en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos :
hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc...
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Cultivo primario Lí
Línea primaria
15
Cultivo primario / linea primaria y
linea estable
Finita Continua
Ploidia Diploide / Euploide Heteroploide / Aneuploide
Transformació
Transformación Normal Transformada
Tumorogenicidad No-
No-tumorogé
tumorogénica Tumorogé
Tumorogénica
Dependencia de anclaje Si No
Inhibició
Inhibición por contacto Si No
Limitació
Limitación de crecimiento
Si No
por densidad
Posible mantenerlas
Mantenimiento Cíclico
quiescentes
Requerimientos de suero Elevados Bajos
Eficiencia de clonaje Baja Elevada
Pueden expresar Cromosomales,
Cromosomales,
Marcadores
marcadores especificos enzimá
enzimáticos.. se pierden
Funciones especializadas Se mantienen Se suelen perder
Baja (24 a 96 h tiempo de
Tasa de crecimiento Rápida (12 a 24 h)
replicació
replicación)
Bajo (<10E6 cé
células/ ml, Alto (>10E6 cél/ml, >10E5
Rendimiento en cultivo
<10E5 cél/cm2) cél/cm2)
PROTOCOLO BÁSICO
Extracció
Extracción del órgano o discriminació
discriminación tisular
Disgregació
Disgregación celular mecá
mecánica y enzimá
enzimática (tripsina)
Selecció
Selección por centrifugació
centrifugación
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1.- Métodos de aislamiento:
específicos de cada tipo celular
A.-
A.- Aislamiento de fibroblastos de pollo
- 10-
10-12 embriones
- Se extrae el embrió
embrión y se eliminan los órganos internos y la cabeza
- Trituració
Trituración y agitació
agitación con tripsina
- Centrifugació
Centrifugación y el precipitado se resuspende con SFB y medio
- Incubació
Incubación en hielo para dispersió
dispersión mecá
mecánica
- Filtració
Filtración con tamiz y se centrifugan y el precipitado se resuspende en DMEM
DMEM
y 10%SFB
- Recuento y siembra
B.-
B.- Aislamiento de hepatocitos de pollo (supervivencia corta)
- Disgregar el hí
hígado por digestió
digestión enzimá
enzimática y EDTA (perfusió
(perfusión)
- Extracció
Extracción y corte mecá
mecánico
- Centrifugació
Centrifugación y el precipitado contiene alta tasa de hepatocitos (Separació
(Separación
de hepatocitos de cé
células de Kupffer,
Kupffer, endoteliales y biliares)
- Lavado y recuento de hepatocitos y siembra
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2.- Inmortalización de células primarias
Fibroblastos humanos
18
Células en cultivo. A) Micrografías de
contraste de fase de fibroblastos en
cultivo. B) Micrografías de mioblastos
en cultivo mostrando las células
fusionadas para formar células
musculares multinucleadas. C) Células
precursoras de oligodendrocitos en
cultivo. D) Células de tabaco en cultivo
QUERATINOCITOS
19
HEPATOCITOS DE RATA
HEPATOCITOS DE PERRO
20
HEPATOCITOS DE MONO
HEPATOCITOS HUMANOS
21
EPITELIO PIGMENTARIO
HUMANO DE LA RETINA
CELULAS ENDOTELIALES DE
CORDON UMBILICAL HUMANO
22
CELULAS DE MUSCULATURA
LISA HUMANA
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Protocolo de manejo
1.-
1.- Preparació
Preparación
2.-
2.- Control de los cultivos celulares
Protocolo de manejo
3.-
3.- Disgregació
Disgregación y Recuento de cé
células
-Células en suspensió
suspensión: Dilució
Dilución 1:1 con Tripá
Tripán Azul
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SECUENCIA DE DESPEGUE DE LAS CÉ
CÉLULAS
Nº de cé
células = 10.000 x dilució
dilución x cé
células contadas
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Protocolo de manejo
4.-
4.- Subcultivo de cé
células
suspensión: 105/ml-
- Células en suspensió /ml-8x105/ml
- Células adherentes entre 2,5x105 y 5x105 para una caja de 25 cm2
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Congelación de las células
de un determinado pasaje
Concentració
Concentración celular: entre 1 y 3 x106 células/1,5 ml
Protocolo de manejo
5.-
5.- Elaboració
Elaboración de una curva de crecimiento
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Protocolo de manejo
5.-
5.- Elaboració
Elaboración de una curva de crecimiento
28
3T3-SA FIBROBLASTOS DE RATÓN
29
M6 CARCINOMA DE COLON
30
SH-SY5Y NEUROBLASTOMA
HepG2-HEPATOMA
31
Células COS (riñón mono)
32
ECV-304 (endoteliales)
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