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Biotecnologa y Biologa Molecular de Levaduras

Introduccin
Biotecnologa:
Exploracin de los sistemas biolgicos

Biologa molecular:
El estudio y manipulacin de los sistemas biolgicos a nivel molecular.

Saccharomyces cerevisiae
Organismo ms exitosamente explotado
Organismo eucariota mas caracterizado molecularmente Proporciona una visin sin precedentes en la funcin celular estructura y la

Adems de sus funciones tradicionales, la levadura S. Cerevisiae desempea un papel importante en la biotecnologa de produccin de protenas recombinantes , al igual que Pichia Pastoris

Ambas son utilizadas en vas de la ingeniera donde la tecnologa bsica de produccin de protenas recombinantes provee las herramientas para el desarrollo de tecnologas de clonacin recombinante mucho mas sofisticadas. Finalmente, el anlisis post-genmico de la biologa molecular de S. cerevisiae proporciona un paradigma de la clula eucariota. La biotecnologa y la biologa molecular de levaduras, por lo tanto abarca: Produccin de productos de protenas recombinantes para la explotacin de seres humanos El desarrollo de vas de ingeniera y anlisis post genmicos que facilitan un profundo entendimiento de la biologa celular

Produccin Heterloga de protenas de levadura.

Heterlogas o recombinantes, las protenas son producidas cuando la


tecnologa del DNA recombinante se usa para asegurar la expresin de un producto gnico en un organismo en el que normalmente no se puede hacer

Los huspedes de levadura


Las levaduras son los eucariotas ms simples y comparten
muchos de los atributos de bacterias: son unicelulares, crecen rpidamente, se pueden transformar con ADN y pueden formar colonias en una placa.

Conduccin y transformacin adecuados de DNA en el husped


Construccin del DNA:

Vectores lanzadera: secuencias de ADN que aseguran la apropiada expresin de las protenas en las clulas huspedes.

*Transformacin y seleccin
Hay procedimientos que logran la transformacin eficiente de la levadura.
Clulas de crecimiento se pueden tratar enzimticamente para eliminar sus paredes celulares y los esferoplastos resultantes expuestos al DNA en presencia de iones de calcio y polietilenglicol, antes de ser embebido en agar hipertonico selectivo para falicitar la regeneracin de la pared celular y la formacin posterior de colonias.

Los transformantes se identifican por seleccin

*Garantizar la ptima expresin de la protena deseada


Asegurar altos niveles de mRNA Asegurar altos niveles de protena

Reingeniera de genomas para la construccin de novedosas seales y vas bioqumicas

Contribucin

Biotecnologa y Biologa Molecular

Uso de levaduras

Se extiende mas halla de la produccin de protenas recombinantes

Fcil uso de la manipulacin gentica.

Uno de los sistemas mas verstiles sistemas de clonacin eucariota.


Sistema homlogos recombinacin de levaduras
Por lo tanto, facilita gran manipulacin de material gentico.

S. cerevisiae

Una simple eucariota unicelular

Muchas de las vas bsicas bioqumicas

Encuentran en organismos multicelulares complejos

Adems de su uso como clula husped para la manipulacin de molculas grandes de ADN

Puede ser genticamente modificada para generar nuevas seales y vas bioqumicas

Ejemplos
Utilizacin reingeniera gentica Anlisis in vivo de interacciones protena.protena Vas metablicas para la produccin de nuevos productos bioqumicos Glucosilacion protena recombinante humanizada Indicadores biolgicos faciliten el anlisis de receptores de hormonas Receptores de cerebro

6.3.1 Manipulacin gran escala de ADN de mamferos y bacterias


Conocimientos levadura junto versatilidad manipulacin gentica condujo a creacin poderosos vectores de clonacin.

6.3.1.1 Clonacin de Grandes Segmentos de ADN


YAC son vectores especializados capaces agregar grandes fragmentos de ADN. Se construye a partir de un plsmido.

Los fragmentos del vector as abiertos son sometidos a la accin de la fosfatasa alcalina para impedir que se vuelvan a unir. Cada uno de los 3 fragmentos porta un marcador de seleccin (verde) y cada uno de os brazos porta un telmero (azl).

Forma adapta

Lineales

Circulares

Indispensable herramienta para el mapeo de complejos genomas

Rompen con enzimas de restriccin.

6.3.1.2 Manipulacin de Mamferos


Una vez que son transformados pueden ser explotados in vivo para la
manipulacin de vectores de secuencia.

La recombinacin homologa puede ser usada para reequipar marcadores


seleccionables de mamferos dentro de los brazos del vector y/o introducir mutaciones especificas dentro una secuencia genmica llevada a YAC.

Asi se generan cromosomas artificiales que pueden ser usados para la


produccin de ratones transgnicos.

Fragmento de DNA lineal consiste en gen de resistencia a neomicina y genes


LYS2

Construccin Organismos Sintticos


Generar cromosomas artificiales. Recombinacin transformacin asociada
(TAR). Primer tipo de cromosoma totalmente sinttico.

6.3.2 Novedosos Sistemas Reporteros Biolgicos

6.3.2.1 Un Reportero a base de levadura para receptores actividad del cerebro humano

6.3.2.2 Un Reportero a base de levadura para receptores actividad de esteroides humano

6.3.2.3 Un Reportero a base de levadura para deteccin interacciones protena- protena

6.3.3 Novedosos Productos Bioqumicos EPO humanizados


Permite cientficos modificar existentes vas bioqumicas suprimiendo genes nativos
y incluyendo nuevo material gentico que codifica una nueva funcin bioqumica.

Secuestrar el metabolito central de la levadura para producir metabolitos


secundarios normalmente sintetizados de las plantas.

Detallado conocimiento de la bioqumica y la biologa celular de la levadura para


redisear la clula de manera que se puede sintetizar los restos de azcar complejas necesaria para producir glicoprotenas producidas normalmente en clulas de mamferos.

6.3.3.1 Ingeniera Gentica De Productos Secundarios de Metabolitos


Amplia variedad de organismos que producen segundos metabolitos.
Comnmente son aislados para uso como medicamentos, fragancias y sabores.

Estos son bastante limitados y su purificacin suele ser difcil. Una alternativa
es la transferencia de los genes que codifican las enzimas necesarias para su sntesis. Usa la levadura S. cerevisiae

6.3.3.2 Humanizando la Glucosilacion de Protenas en P. pastoris


Agregacion de manosa. Reticulo endoplamatico igual. Golgi diferente.

La levadura como paradigma de la biologa celular bacteriana

Las funciones celulares fundamentales se conservan de las levaduras a los humanos. Se utiliza la recombinacin homologa para noquear cada marco de lectura individual para identificar lo que hace cada gen. S. Cerevisiae se usa como modelo eucariota en que se desarrollan mtodos de monitoreo global de las molculas celulares.

Conocimientos genmicos
Muchas enfermedades genticas humanas tienen su homologo en las clulas de levadura

La Condrodisplasia Punctata Rizomlica presenta sntomas de calcificaciones en zona epifisial y retraso mental. Se encontr que los pacientes con esta condicin presentan mutaciones que conducen a defectos en la biognesis de peroxisomas.

Adems es un excelente modelo para muchas otras enfermedades humanas, incluyendo el cncer, las enfermedades neurodegenerativas y varios trastornos metablicos.

Por otra parte, la levadura tambin facilita los estudios fundamentales de los mecanismos moleculares como la apoptosis.

La secuenciacin del genoma ha allanado el camino para el uso del potente sistema de recombinacin homloga en levaduras para producir un conjunto de cdigo de barras de las cepas de levadura cada uno llevando un marco de lectura abierto eliminado precisamente .

Transcriptomas, proteomas, metabolomas y desarrollo de frmacos


La levadura es el organismo en el que se desarrollaron ms tecnologas genmicas posteriores de alto rendimiento: tecnologia de micro arreglos proporciona informacin sumamente sensible en los niveles de transcripcin en la clula para cada gen en un momento dado en el tiempo .

La tecnologa 2 - hbrido mencionado anteriormente y la tecnologia complementaria desplegable se han utilizado para proporcionar informacin sobre la protena protena. Un catlogo de todos los metabolitos celulares constituye el metaboloma. Todos ellos proporcionan perspectivas globales que pueden ser utilizados para determinar cmo esta clula eucariota responde a la perturbacin gentica y / o ambiental. Mediante la alteracin de uno (o ambos ) , los biotecnlogos ahora pueden monitorear las respuestas de clulas eucariotas a una variedad de insultos celulares y nuevos agentes teraputicos .

Sistemas biolgicos
Las clulas son entidades dinmicas y el siguiente reto es obtener una idea de los flujos dinmicos dentro de la clula con el fin de elaborar modelos matemticos e informticos de las clulas y los organismos multicelulares. La biologa de sistemas se est aplicando actualmente en muchos sistemas biolgicos y se compone de los mismos principios bsicos: Un modelo informtico del sistema se ha diseado utilizando todos los datos disponibles El modelo se utiliza para predecir cmo las clulas respondern Si el modelo no puede predecir el resultado en el laboratorio entonces cualquier discrepancia crea nueva informacin

Los objetivos actuales de la biologa de sistemas son desarrollar biolgicamente descripciones cuantitativas significativas de las clulas vivas y para generar nuevas herramientas computacionales para facilitar esto.
S. cerevisiae se ha estudiado intensamente durante dcadas y , con los datos adicionales de los analisis post-genmica de alto rendimiento , proporciona un organismo modelo ideal en el que llevar a cabo el proceso reiterativo de construccin de modelos, prediccin , la perturbacin , el anlisis y el nuevo modelo .

La biologa de sistemas puede ser de levadura en sus inicios, pero promete proporcionar una visin sin precedentes en funciones bsicas de la clula y , por supuesto, cmo las clulas responden a los cambios en los sustratos , los cambios genticos y las agresiones ambientales .

Prospectos futuros
LA levadura ha tenido una muy exitosa historia en el campo de la biotecnolgica y la biologa molecular. Se volvi el organismo de eleccin cuando se necesitaba una clula eucariota para expresar las protenas recombinantes. Su sistema de recombinacin homloga permite que sea utilizado para disear la totalidad de los cromosomas de la biologa sinttica. Sabemos ms de lo que cualquier otra clula eucariota , por lo que se establece para guiarnos hacia el futuro como organismo modelo para el desarrollo de la biologa de sistemas.

El futuro prximo veremos: Nuevos avances en la clonacin va metablica Generacin de un nuevo anfitrin entero de las protenas recombinantes. Clonacin TAR facilitar el estudio de la organizacin y la evolucin de los genomas complejos. La creacin de nuevas formas de vida con la capacidad de hacer frente a los problemas mundiales de limitaciones de energa y el cambio climtico. En resumen , la biotecnologa y la biologa molecular de levaduras apenas estn madurando y lo mejor est por venir.

GRACIAS