26-4-2022

Prácticas de laboratorio
bioquímica

Pertenece A: Julisa Magdiel

Vilca Laura

Docente: Dr. Ronald Navarro

Oviedo

PRACTICA N° 7
EXTRACCION E
IDENTIFICACION DE DNA
I. OBJETIVOS

• Extracción del DNA a partir de un tejido vegetal

II. MARCO TEÓRICO

La Biología Molecular contemporánea se centra en:

1) como la información está ordenada en el cromosoma
2) como se procesa la información
3) como se reproducen a sí mismas la información cada vez que la célula se divide
4) como puede modificarse la información para generar nuevas instrucciones.
La regulación y el control de cada una de estas transacciones de información constituyen
otro aspecto de la biología molecular, disciplina que nos permite conocer la vida al
facilitarnos la comprensión de las funciones que desempeñan las macromoléculas.

Hoy se sabe que una sola molécula, el DNA, puede explicar en su totalidad los
fenómenos de codificación, procesamiento, replicación y modificación de la
información. El DNA por lo tanto es el responsable de la transmisión de la información
de una generación a otra para conservar la continuidad genética entre progenitores y
descendientes Uno de los procedimientos básicos en la biología molecular es la
extracción y purificación de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer
paso a posteriores análisis.

Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA, todos ellos por lo general
tienen el mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido por una
remoción de proteínas y por último la obtención del DNA de alta pureza por
precipitación etanólica.
Entre las técnicas más comunes de extracción de DNA, se considera:
• Hervir la muestra en agua destilada
• Acción de detergentes
• Acción de NaOH
• Acción de enzimas proteolíticas
• Uso de solventes orgánicos
• Sonicación
• Congelamiento y descongelamiento
Después de la extracción y purificación del DNA, el paso siguiente es la cuantificación
del DNA. Esta cuantificación es importante para posteriores análisis como PCR,
secuenciación hibridación, etc. Tres son los métodos más utilizados para la
cuantificación, los cuales se diferencian en la precisión, así como en la cantidad de
muestra requerida. Dichos métodos son:
• Espectrofotometría
• Fluorometría
• Fluorescencia en Bromuro de Etidio
Otros métodos sólo nos determinan la presencia de bases nitrogenadas
(espectrofotometría), la identificación de desoxirribosas y la identificación de grupos
fosfato
 III. PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. EXTRACCION DE DNA DE TEJIDO VEGETAL (A PARTIR DE BULBO

DE CEBOLLA)
REACTIVOS
• Solución de lisis
• Alcohol etílico al 95%
• Reactivo de difenilamina

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Solución de lisis: mezclar 0.1% Reactivo de difenilamina: Disolver 1 g

de dodesilsulfato de sodio de difenilamina en 100 ml de ácido
(detergente SDS) en 25 mmol/L acético glacial y adicionar 2.75 ml de
de EDTA pH 8.0 ácido sulfúrico concentrado

PROCEDIMIENTO

Descascarar una cebolla de tamaño medio y Pesar unos 50 g de cebolla rallada y

rallar la cebolla con un rallador común. Es adicionar 100 ml de la solución de lisis.Dejar
importante que no haya grandes pedazos de la mezcla a temperatura ambiente por 10 a
cebolla 20 minutos

Filtrar la suspensión a través de un embudo En un tubo de ensayo colocar 4 ml del

que contiene algodón, y recoger el filtrado
en una probeta. Anotar el volumen
Transferir el material de la varilla de vidrio a
otro tubo de ensayo y disolverlo en 0.5 ml de
agua. A esta solución, adicionar 1.5 ml de
reactivo de difenilamina.
filtrado. Adicionar 2 volúmenes de etanol
al 95%, procurando no mezclar las dos
soluciones. Observar en la interface, la
formación de un precipitado blanquecino.
Con la ayuda de una varilla de vidrio
enrollar el material blanquecino

En otro tubo de ensayo adicionar 0.5 ml de

El filtrado restante (ítem 5) debe ser
agua y 1.5 ml de reactivo de difenilamina.
transferido a un beaker y a esta solución
Colocar los dos tubos en baño maría
se le añade 2 volúmenes de etanol al 95%.
hirviente por 10 minutos. Comparar los
El material blanquecino formado en la
resultados obtenidos.
interface de las dos soluciones debe ser
enrollado en una varilla de vidrio y
transferido a otro tubo de ensayo.
Disolver el precipitado en 5 ml de agua con el
auxilio de la varilla de vidrio. Dividir esta solución
en dos tubos para observar cambios de
El otro tubo debe ser mantenido en baño maría
viscosidad en diferentes condiciones. (11)
hirviente por 10 minutos. Después del periodo de
Pipetear la solución de uno de los tubos con una
calentamiento, proceder como en el ítem 11,
pipeta graduada de 0.2 ml y cronometrar el
anotando el tiempo de desplazamiento. Enfriar la
tiempo de desplazamiento de la solución a partir
solución en hielo por 15 minutos y repetir el
de la marca 0 ml hasta la marca 0.15 ml.
procedimiento (11).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Las plantas, como las cebollas, tienen paredes celulares que protegen a los orgánulos
(las mitocondrias) y mantienen la estructura de la planta. El jabón para traste y líquido
y la sal rompen las paredes celulares, de manera que los orgánulos quedan expuestos.
El alcohol para uso externo disuelve todo, excepto el ADN

V. CONCLUSIONES

Se logro extraer de un tejido vegetal el DNA a partir de la desnaturalización.

VI. CUESTIONARIO

a) ¿Cuál es los componentes de la solución de lisis y para que se usan cada uno
de ellos?

• SDS (sodio dodecil sultafo): Es un detergente aniónico que solubiliza

los lípidos y proteínas, y desestabiliza la estructura de la membrana
celular (Rocha, 2002).
• Sucrosa: Esta provoca una desestabilización de la estructura celular a
través del cambio de la presión osmótica (Rocha, 2002).
• NaCl (cloruro de sodio): Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia
a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN
en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la
molécula. La capa hidratante se rompe en presencia de etanol y quedan
expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones, se favorece la
unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre
las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN se precipite
(Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989).
• Tris (hidroximetil amino metano): Es un tampón biológico usado para
estabilizar el pH de la solución (entre 7,0 y 8,0) (Rocha, 2002).
• EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético): Una vez el ADN es liberado
del núcleo, queda expuesto a las enzimas DNAsas de la célula que
degradan el ADN. Para evitar la degradación se usa el EDTA, agente
quelante que atrapa los iones Mg2+ usados por las DNAasas como
cofactores ( Sambrook, Fritsch & Maniatis, 2001). La inhibición de las
enzimas también puede realizarse mediante métodos físicos, como la
desnaturalización por calor (a temperaturas de 65 °C) (Rocha, 2002).
HCl (ácido clorhídrico): Sólo se usa si es necesario para ajustar el pH a
8,6. Teniendo en cuenta que el ADN puede ser destruido (depurinado)
a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5,6 pero soluble a pH 8,0.
Por lo tanto, los procesos de extracción, purificación y almacenamiento
del ADN deben mantener el pH óptimo y brindar una alta concentración
iónica (Rocha, 2002).

b) ¿A qué se debe la diferencia de viscosidad del DNA observada en los

experimentos?
 Al pH que tiene cada uno, si su pH es acido genera una viscosidad mas fuerte.

c) ¿Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas?. Si su respuesta es

afirmativa, explique a que componente podría reemplazar o en que paso sería
apropiada utilizarla durante la extracción de DNA.

Los métodos que utilizan la hidrólisis con proteinasas tienen como principio
básico el uso de la proteinasa K, la cual digiere proteínas y remueve
contaminantes a partir de las preparaciones de ácidos nucleicos. Se debe
degradar las proteínas principalmente las unidas al ADN y las del citoplasma
para esto se puede usar la proteasa K.

d) ¿Qué condiciones físicas conducen a la desnaturalización del DNA?. ¿Por qué

se observa un incremento en la absorción de luz UV (efecto hipercrómico) al
desnaturalizarse el DNA?

Otro agente desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de

algunos grupos que forman parte de los puentes de hidrógeno.

VII. BIBLIOGRAFÍA

• Cristina Cadavid, I., & F. Gómez, G. (s. f.). Preparación de solución de lisis para
extracción de ADN descrito por Collins et al. PDF. Recuperado 21 de junio de 2022, de
https://dspace.tdea.edu.co/bitstream/handle/tdea/1476/Preparaci%C3%B3n%20de%
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crito%20por%20Collins%20et%20al.%20%281987%29.pdf?sequence=1&isAllowed=y
• Extracción de DNA de células vegetales | manual de practicas de laboratorio de
bioquímica, 3e | AccessMedicina | McGraw Hill Medical. (s. f.). AccesMedina.
Recuperado 21 de junio de 2022, de
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1496§ionid=100110399
• Extracción del ADN de una cebolla. (s. f.). Museum Natural. Recuperado 21 de junio de
2022, de https://mnch.uoregon.edu/sites/mnch2.uoregon.edu/files/inline-
files/DNA%20Extraction%20Experiment%20SPANISH.pdf