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CÓDIGO: FO-DOC-112

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS


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PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016

LABORATORIO DE QUIMICA

UNIDAD ACADEMICA: Medicina Veterinaria y Zootecnia


CURSO: Bioquímica
PRACTICA Nº 6: EXTRACCIÓN DEL ADN DE LA CEBOLLA

1. OBJETIVOS
 Extraer y purificar el ADN de células vegetales.
 Observar la estructura fibrilar del ADN.
 Identificar la presencia de pentosas (ribosa. Desoxirribosa) mediante el reactivo de Bial.
 Identificar la presencia de grupo fosfato mediante prueba específica para este grupo.

2. CONSULTA PREVIA
Indagar en un libro de bioquímica sobre la estructura, composición y función de los ácidos nucleicos.

3. FUNDAMENTO TEORICO
Los nucleótidos desempeñan una amplia variedad de funciones en el metabolismo celular. Constituyen la
moneda energética en las transacciones metabólicas, son los nexos químicos en los sistemas celulares, en
respuesta a hormonas y otros estímulos extracelulares, y son también componentes estructurales de una serie
de cofactores enzimáticos e intermedios metabólicos. Son los constituyentes de los ácidos nucleicos: acido
desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA), los depositarios moleculares de la información genética.
La estructura de todas las proteínas y en última instancia de todas las biomoléculas y de cada uno de los
componentes celulares, es producto de la información programada en la secuencia de nucleótidos de los ácidos
nucleicos de la célula.
Los ácidos nucleicos son polinucleótidos, o polímeros de nucleótidos. Los nucleótidos tienen tres componentes:
un azúcar con cinco carbonos, uno o más grupos de fosfatos y un compuesto nitrogenado débilmente básico
llamado base, las bases que se encuentran en los nucleótidos son pirimidinas y purinas sustituidas. La pentosa
suele ser ribosa (D-ribofuronosa) o 2-desoxirribosa (2-desoxi-D-ribofuranosa). Los N-glicósidos pirimidina o
purina de estos azucares se llaman nucleósidos. Los nucleótidos son los ésteres de fosfato de los nucleósidos;
los nucleótidos comunes contienen desoxirribosa se llaman desoxirribonucleótidos.
El DNA, como se conoce actualmente, es el portador de la información genética de todas las formas de vida
celular, así como en michos virus. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo
de información. Muchas veces, el ADN es comparado con un plano o una receta, o un código, ya que contiene
las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las células, como las proteínas y las
moléculas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta información genética son llamados genes, pero las
otras secuencias de ADN tienen propósitos estructurales o toman en la regulación del uso de esta información
genética.
Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Un polímero
es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre sí, como si fuera un largo tren
formado por vagones. En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está formado por
un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→ A, timina→ T, citosina→ C o
guanina→ G) y grupo de fosfato que actúa como enganche de cada vago con el siguiente. Lo que distingue a
un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica
nombrando solo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo d la
cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo tren) es la que codifica la información
genética: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC. En los organismos vivos, el ADN
se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas
conexiones denominadas puentes de hidrogeno figura 1.

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Figura 1. Estructura quimica del ADN

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS


Equipos Materiales Sustancias y/o Reactivos
Vasos de precipitado de 50 mL
Baño de maría Cebolla grande y fresca (traer)
(1), de 250nmL (1)
Cronometro (traer) Tubos de ensayo (10) Agua desionizada
Varilla de vidrio (1) EDTA
Pipetas de 5 mL (2), 1 mL (2), 2 SDS al 0.1% (dodecilsulfato de
mL (1), 10 mL (1) sodio)
Gasa (1) Difenilamina
Probeta de 100 mL (1) Etanol al 95% frío
Embudo (1) Ácido molíbdico
Cuchillo (1) Ácido ascórbico
Licuadora (1) Reactivo de Bial

5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA
SOLUCION DE LISIS: Mezclar SDS 0.1% con una solución 25 mM deEDTA pH=8.
Alternativa: 120 mL de H₂O + 1.5 g NaCl + 5 g de bicarbonato de sodio + 5 mL de detergente.

REACTIVO DE DIFENILAMINA: Disolver 1 g de difenilamina en 100 mL de ácido acético glacial y adicionar 2.75
de ácido sulfúrico concentrado.

1. Remover la cascara de la cebolla


2. Partir la zona central de la cebolla en cuadros pequeños, pesar 50n g de cebolla.
3. En una licuadora adicionar la cebolla (previamente pesada) y adicionar 100 mL de la solución de lisis.
4. Filtrar en un embudo que contenga gasa, recogiendo el filtrado en una probeta, anotar el volumen.
5. Transferir 4 mL del filtrado y colocar en un tubo de ensayo. Adicionar 8 mL de etanol al 95% frio (gota
a gota) procurando no mezclar. Observe la formación de un precipitado blanco, con la ayuda de una
varilla de vidrio enrollar el precipitado. Proceder de la siguiente manera para la identificación de DNA
en la tabla No. 1:

Tabla No. 1 Resultados de formación de precipitado

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Reactivo Tubo A Tubo B


Agua 1 mL -
Extracto (precipitado) - 1 mL
Difenilamina 2 mL 2 mL

Colocar ambos tubos en baño de maría fuerte por 10 minutos, compare y analice el resultado obtenido.
6. Repetir el procedimiento 5 y el precipitado utilizarlo para la siguiente prueba:

IDENTIFICACION DE PENTOSAS:
Tabla No. 2 Identificación de pentosas
Reactivo Tubo A Tubo B
Agua 1 mL -
Extracto (precipitado) - 1 mL
Reactivo Bial 2 mL 2 mL

Colocar ambos tubos en baño de maría fuerte por 10 minutos, enfriar y observar la aparición de la coloración
verde. Compare y analice el resultado obtenido.

7. Repetir el procedimiento 5 y el precipitado utilizarlo para la siguiente prueba:

IDENTIFICACION DE GRUPO FOSFATO:

Tabla No. 3 Identificación de grupo fosfato


Reactivo Tubo A Tubo B
Agua 0.1 mL -
Extracto (precipitado) - 0.1 mL
Ácido molíbdico 0.5 mL 0.5 mL
Mezclar y esperar 30
segundos
Ácido ascórbico 0.5 mL 0.5 mL

Mezclar, dejar actuar por 15 minutos y observar la aparición de coloración azul- verdoso.
8. Transferir 10 mL del filtrado y colocarlos e un beaker. Adicionar 20 mL de etanol 95% frio (gota a gota)
procurando no mezclar. Observe la formación de un precipitado blanco, con la ayuda de una varilla de
vidrio enrollar el precipitado y colocarlo en un tubo de ensayo.
9. Disolver el precipitado en 5 mL de agua, agitar, dividir el contenido en dos tubos para observar la
viscosidad en diferentes condiciones.
10. Pipetear 0.2 mL de uno de los tubos cronometrar el tiempo de salida (dejar caer por gravedad 0.15
mL).
11. El otro tubo debe estar calentado en un baño de maría por 10 minutos. Después de calentar proceder
como en el punto anterior.
12. Tomar lo restante del material sin utilizar en el paso 9 y enfriar en hielo por 15 minutos y repetir el
procedimiento del punto 10, interpretar los resultados de cada caso.

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6. RESULTADOS
Los resultados deben ser reportados en tablas con su respectivo análisis.
¿Cuál es la función de los componentes de la solución de lisis? Explique.
¿A qué se debe la diferencia de viscosidades del DNA observada en los experimentos?

7. BIBLOGRAFIA
 Nelson, D. L., & Cox, M.M (2009). Lehninger principios de bioquímica (No. 577. 1 LEH). Omega.
 Bohinski, R. C., Melius, P., & Friedman, M. E. (1991). Bioquímica quinta edición. Addison- Wesley
iberoamericana, Wilmington, Delaware, E.U.A.
 Stryer, L. (2014). Bioquímica curso básico. Editorial Reverté, Barcelona.
 UNIVERSIDAD FEDERAL DO PARANÁ, DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA. Bioquímica: aulas prácticas.
6. Ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178p.

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