TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y

CARACTERIZACIÓN: SEPARACIÓN Y
SECUENCIACIÓN
José Eduardo Cruz Pinzón
David Ignacio Gutiérrez González
Cristian Palacio Méndez
Karla Guadalupe Villanueva Maldonado
SEPARACIÓN SECUENCIACIÓN
 SEPARACIÓN
La ingeniería genética está también soportada por
un conjunto de métodos que permiten aislar, caracterizar y
manipular el DNA
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
• Enzimas que cortan en un punto específico
dentro de una secuencia de DNA
• Rompen el enlace fosfodiéster que une a los
nucleótidos adyacentes de una cadena de
DNA
• Se encuentran principalmente en bacterias
 RUPTURA MECÁNICA
• Ruptura de DNA en condiciones
controladas para generar fragmentos
de DNA no homólogos
• Se obtienen fragmentos más largos
 TRANSCRIPCIÓN INVERSA

• Se obtienen fragmentos específicos

de DNA a partir de moléculas de
RNAm para producir una copia de
DNA complementario (DNAc).
 SECUENCIACIÓN
Con la secuenciación de DNA se busca conocer la secuencia exacta de
nucleótidos que forman parte de una molécula de DNA
 SECUENCIACIÓN DE SANGER
La plantilla del DNA se mezcla con un cebador
complementario al extremo 3 de una cadena de
la región a secuenciar.
La mezcla de la reacción también contiene la
DNA polimerasa Taq termoestable,
desoxirribonucleótidos y una baja concentración
de didesoxirribonucleótidos o ddNTP. La reacción
de secuenciación comienza, como la PCR.
Cuando se completan todos los ciclos, los productos de reacción se separan mediante
electroforesis en geles capilares muy delgados.
 SECUENCIACIÓN DIDEOXY AUTOMATIZADA
Los métodos automatizados
por ordenador separan los
fragmentos de DNA
utilizando un gel capilar. Se
utilizan un láser y un
detector para detectar la
fluorescencia de cada
didesoxinucleótido.
 SECUENCIACIÓN MASIVAMENTE PARALELA
• Se las en la síntesis de DNA dependiente de la polimerasa, pero no
utilizan la terminación prematura de la cadena ni requieren la
separación por electroforesis
• Logran la identificación directa de los nucleótidos individuales a medida
que son incorporados por las polimerasas en tiempo real
 SECUENCIADORES DE TERCERA GENERACIÓN
• Utilizan estrategias mecanísticas para creación
de poros artificiales de membrana por los
cuales se hace pasar la secuencia del ácido
nucleico a secuenciar
• La mayoría actúan sobre moléculas de DNA
individuales
• Generan lecturas largas
• Operan a un costo menor y tasas más rápidas