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Extracción
de DNA
genómico
EQUIPO 3

DANIEL QUEN CANTO

KARLA G. VILLANUEVA M.
 Objetivo

E xtra er D NA ge nóm ic o de l í ne a s
c e lul a r es a t ravé s de mé t od os
q uí mi c os .

E xtra c ci ó n de D NA

Haga clic para agregar foto Pr o ce s o d ond e se o bt ie ne el A DN a

p a r ti r d e m at e ri a l b io lóg i co ut il i z a ndo
t é cni ca s f í s i ca s y q uím i ca s . Cons is t e
e n s u:

Separación Purificación Análisis

Título de la presentación
DNA genómico

To do el AD N ( m ater ia l g en ét i co ) q u e s e
e n cu e n tra de n t ro d e l a s cé l ul a s de l o s
s er e s v iv o s

3
 Materiales

1 Mi cr op i pe t a de 1 0 5 Cha r ol as pa ra ba l an z a Punt as p a ra Mi c rop i pe t a d e 1 0 ,

2 0 0 y 1 0 0 0 ( pr e via m e nte
1 Micr op ip e ta d e 2 0 0
es t er i li z a d as )

1 Mi cr op i pe t a de 1 0 0 0

8 Tubo s ep p end or f
1 Scra pe r ( g e nda r m e)
( p r ev ia m ent e e st e r il iz ad os )
1 Pi pe ta de 5 ml

4
Equipo

Ce ntr i f ug a Ter m om ixe r

Vor t ex

Mi cro ce ntr í f uga

5
Sustancias

B u ff e r Tr i s - B u ff e r E D TA B u ff e r N a C l B u ff e r S D S 2 0 %
B u ff e r T E 100
Base 1M 0.5M 2.5M (p /v)

Tris mezclando Tris Es un agente Las sales Detergente Protege al DNA

con HCI, evita quelante, secuestra aumentan el aniónico que de la
sobrepasar el rango iones metálicos poder iónico de solubiliza los d e g r a d a c i ó n ya
de pH optimo divalentes y la solución y lípidos y que contiene
trivalentes (Ca y ocasionan la proteínas, y Tr i s - H C l ( p H 8 -
Mg). Evitando la precipitación desestabiliza la 8 . 3 ) y d e E D TA
degradación del del ADN estructura de la como agente
ADN membrana quelante de Mg
celular

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 Sustancias

Alcohol Etanol (grado Is o p r o p a n o l ( G r a d o Fenol cloroformo

Proteinasa K 20
i s o a m í l i c o 1% Técnicas técnicas 25% (v/v)
mg /mL
(v/v) moleculares) 70 moleculares) 1 mL
Junto con el
Junto con el Se usa para Va a p r e c i p i t a r alcohol Es una enzima que
fenol cloroformo precipitar el al ADN isoamílico se sirve para
se usan para ADN y eliminar usan para romper/degradar a
eliminar los los restos de eliminar los las proteínas que
residuos isopropanol y de residuos están unidas al ADN.
(lípidos, reactivos que (lípidos,
proteínas, sales han intervenido proteínas, sales
y detergentes en la extracción y detergentes
que acompañan que acompañan
al ADN) al ADN)

7
Buff er de lisis
Es u n a s o l u ci ó n qu e s e u ti l iza c o n e l fi n
d e r o m pe r cé lu l a s pa ra po d er an a l iza r
l as ma c ro m o l éc u l as l áb i l es d e l as cé lu l a s
Co n t i en e su s t a n ci as q u e ay u d a n a
r e gu l a r el p H del li sa d o.

8
Procedimiento

A NT ES D E COMENZ A R : R EC O R DA R Q U E :

• Li mp i ar pe r fe c ta m ent e l a m es a d e • D u ra n t e e l p ro c e d i m i e n t o t o d o s l o s

t ra ba j o con et a nol a l 7 0 % p a ra re a c t i vo s d e b e rá n ma n t e n e rs e f rí o s

e vi ta r c ont a mi na r l a mue s t ra a
¿ Por qu é f r í os ?
p r oce s a r.
La a c t i vi d a d e n z i má t i c a e s s e n s i bl e a l a
• Ant e s d e ma ni pul a r c ual q uie r te m p e ra t u ra ( y p H ) p o r l o t a n t o, p a ra
m at e r ia l l im p ia los g ua nt es de op t i mi z a r l a e x t ra c c i ó n d e D N A s e d e b e
t ra ba j o con et a nol a l 7 0 % re a l i z a rs e a b a j a t e m p e ra t u ra . L a b a j a
t e mp e ra t u ra ra l e n t i z a la actividad
en z i m á t i c a , evitando que el DNA se
d eg ra d e .

9
Procedimiento

• P r e p a ra c i ó n d e l b u ff e r d e l i s i s , e n u n • P r e p a ra c i ó n de solución PCI
tubo eppendorf de 1ml m e z c l a : Tr i s - ( Fe n o l c l o r o fo r m o / a l c o h o l isoamílico)
B a s e 1 M p H 8 . 0 , N a C l 2 . 5 M y E DTA 0 . 5 M e n u n a r e l a c i ó n 2 5 : 1 p a ra p r e p a ra r 1
en una relación 1:1:1 p a ra p r e p a ra r ml
1ml

10
La muestra

Se us a l a c ap a d e l euc oc it os
d e una m ues t ra de s a ngr e
que ha s i d o c ent r i f ug a d a

¿ Leu c o c i to s ?

El l os cont i ene n un núcl e o,

l os er i tr o ci to s o g l ób ul os
r oj os c a r ec en d e e st e , d ond e
se gua r d a el ma t er i al
g ené t ic o.

11
Procedimiento

• Escrapear (raspar) las células de cada una • Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min
de las cajas de cultivo y recolectarlas con 1
• Desechar el sobrenadante y resuspender en
ml de medio de cultivo, colocarlas en un
1 m l d e b u ff e r d e l i s i s ( f r i o ) e i n c u b a r p o r
tubo eppendorf de 1.5 mL (este paso se
10 min en hielo.
cambia por la centrifugación de una
muestra de sangre)

12
Procedimiento

• Añadir 100 microlitros de SDS al 20% y • Añadir 1000 microlitros de solución

2 m i c r o l i t r o s d e p r o te i n a s a K . I n c u b a r P CI y c o l o c a r e n te r m o m i x e r a 4 0 0 r p m
a 42ºC en agitación constante (80 rpm) y 25ºC por 10 min
por 30 min
• C e n t r i f u g a r a 1 5 , 0 0 0 g d u ra n t e 5 m i n

13
Procedimiento

• Tra n sfe r i r l a f a s e a c u o s a a u n n u e vo • Re p e t i r el paso 5 (añadir 1000

tubo eppendorf de 1.5 ml microlitros de solución PCI y colocar en
termomixer a 400 rpm y 25ºC por 10
min)

14
Procedimiento

• Añadir 20 microlitros de NaCl 2.5M o el • Desechar el sobrenadante y añadir de 100

volumen necesario p a ra l l e va r l o a una a 200 microlitros de isopropanol frío
c o n c e n t r a c i ó n fi n a l d e 0 . 1 M c o n c e n t ra d o e i n c u b a r a - 2 0 º C p o r 3 0 m i n

• Centrifugar a 15,000 g por 5 min • Centrifugar a 15,000 g por 5 min

15
Procedimiento

• D e s e c h a r e l s o b r e n a d a n te y a ñ a d i r 1 0 0 v u e l va a r e p e t i r e s t e p a s o .
microlitros de Etanol al 100%. Incubar
• D e s e c h a r e l s o b r e n a d a n te y r e s u s p e n d a
por 10 min en frio
el DNA genómico en 100 microlitros de
• C e n t r i f u g a r a 1 5 , 0 0 0 g d u ra n te 5 m i n y T E o a g u a i n ye c t a b l e

16
Procedimiento

• Re a l i c e dos a l i c u ot a s , una p a ra
cu a n ti fi c a r el DNA por
e s p e c t r o fo m e t r í a y la segunda
a l i c u o ta p a ra e va l u a r la integridad
p o r e l e c t r o fo r e s i s .

17
Cuantifi cación de DNA por
espectrofotometría

Funda m ent o:

20XX 18
Análisis de integridad

E le ctr ofor e si s

Funda m ent o:

D ura nte e l aná l is i s de i nte g r id a d de lo s á c id os

n ucl ei cos , se e s p era ob s er va r b an da s s ob r e el g el
con ci e r ta int ens i da d y a l to pe s o m ole c ula r
r e ve la d o p or e l us o de un m a rc a do r d e r e fe r enc ia .
L a p r es en ci a d e ba r r id o o ma nc ha s , es i ndi c at i vo
d e D NA de gra da d o, fra gm e nta d o o pr e s enc i a de
R N A con ta mi na nt e.

20XX 19
 Fuentes

Alejos, L., Aragon, M., & Cornejo, A. (s. f.). Extracción y purificación de ADN . Herramientas moleculares aplicadas en ecología. Recuperado 13 de agosto

de 2021, de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

A m a r u , R . ( 2 0 0 6 ) . D N A - U M S A g e n , E X T R A C C I Ó N D E D N A G E N Ó M I C O PA R A D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R : M É T O D O R Á P I D O Y E C O N Ó M I C O . S c i E L O .

h t t p : / / w w w. s c i e l o . o r g . b o / s c i e l o . p h p ? s c r i p t = s c i _ a r t t e x t & p i d = S 1 6 5 2 - 6 7 7 6 2 0 0 6 0 0 0 2 0 0 0 0 1

Extracción de ADN. (2017, 25 mayo). Conogasi. http://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn-2/

Ma rcos-Merino. (2 019). Extracción de ADN con material cotidiano: desarrollo de una estrategia interdisciplinar a partir de sus fundamentos científicos .

S c i E L O . h t t p : / / w w w. s c i e l o . o r g . m x / s c i e l o . p h p ? s c r i p t = s c i _ a r t t e x t & p i d = S 0 1 8 7 - 8 9 3 X 2 0 1 9 0 0 0 1 0 0 0 5 8

N i e l s e n , S . S . ( 2 0 2 0 , 11 s e p t i e m b r e ) . S t u d y Q u e s t i o n s M i n e r a l A n a l y s i s . R e s e a r c h G a t e . h t t p s : / / w w w. r e s e a r c h g a t e . n e t / p o s t / T h e - e f f e c t - o f - s a l t - c o n c e n t r a t i o n -

on-the-pH-of-aqueous-solution

N o d a r s e , F. J . ( 2 0 0 4 ) . C o m p a r a c i ó n e n t r e 5 m é t o d o s p a r a l a e x t r a c c i ó n d e A D N d e Tr i a t o m í n e o s : s u u t i l i z a c i ó n e n l a t é c n i c a d e A D N p o l i m ó r f i c o a m p l i f i c a d o

al azar (RAPD). SciELO. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-07602004000300010

Ve l a s c o , L . ( 2 0 0 5 , 1 0 f e b r e r o ) . M A R C A D O R E S M O L E C U L A R E S Y L A E X T R A C C I Ó N D E A D N . E s p e c i a l i s t a e n B i o t e c n o l o g í a , G r u p o d e I n v e s t i g a c i ó n

ASUBAGROIN FCA Unicauca .

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