UNIVERSIDAD MAYOR, REAL Y PONTIFICIA DE SAN

FRANCISCO XAVIER DE CHUQUISACA

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 6.2

MATERIA: FUNDAMENTOS DE LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA

SIGLA: PRQ 218

DOCENTE: ING. FRANCISCO JAVIER CAMACHO CALDERÓN

UNIVERSITARIOS:

1. Machaca Gallardo Maribel

2. Valdés Mancilla Maribel
3. Soria Lero Claudia
4. Saavedra Soliz Marco Antonio

FECHA: jueves 4 de mayo de 2023

SUCRE – BOLIVIA
 Fig. Universidad Nacional Autónoma de Mexico. (2014).

Principales clases de inmovilización de enzimas. C=carrier o soporte,

B=biocatalizador (enzima). Adaptado de (Hartmeier, 1985)
TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS.

a. INMOVILIZACIÓN POR RETICULADO O ENTRECRUZAMIENTO

RETICULADO PURO

¿QUÉ ES?

También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido

ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del
reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones
intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se
pueden emplear di aldehídos, diaminoésteres, diisocianatos, sales de bis diazonio e,
incluso, diaminas. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y
temperatura.
¿CÓMO SE HACE?

El proceso de reticulado puro de inmovilización de enzimas consiste en la unión

covalente entre la enzima y el soporte, para lo cual se producen reacciones
reversibles o irreversibles entre grupos funcionales electrofílicos del soporte
y grupos nucleófilos de la enzima. Para llevar a cabo el reticulado puro, se pueden
utilizar reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las
moléculas de enzima, como el glutaraldehído.

CUIDADOS A TENER EN CUENTA Y REQUERIMIENTOS

En la técnica de reticulado puro, es importante tener en cuenta algunos cuidados y

requerimientos. Es necesario elegir el agente entrecruzante adecuado para evitar la
desnaturalización de la enzima y asegurar su estabilidad y actividad catalítica.
Además, es importante controlar la concentración del agente entrecruzante y el
tiempo de reticulación para evitar la formación de enlaces cruzados no específicos
que puedan afectar la actividad de la enzima. También es importante controlar la
temperatura y el pH durante el proceso de reticulado para evitar la desnaturalización
de la enzima. En general, la técnica de reticulado puro de inmovilización de enzimas
requiere un cuidadoso control de las condiciones experimentales para asegurar la
estabilidad y actividad catalítica de las enzimas inmovilizadas.
CO-RETICULADO

¿QUÉ ES?

El co-reticulado de inmovilización de enzimas es una técnica que permite eliminar las

pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el
entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en
residuos de lisina, como la albúmina bovina.

¿CÓMO SE HACE?

Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la

enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico
(con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el
reactivo bifuncional.

La técnica de co-reticulado de inmovilización de enzimas se realiza entrecruzando

las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina, lo
que permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos
difusionales. El co-reticulado hace que sea más difícil que las enzimas se
desnaturalicen y se desplieguen, lo que aumenta su estabilidad y actividad catalítica.
 CUIDADOS A TENER EN CUENTA Y REQUERIMIENTOS

Para realizar esta técnica, se deben elegir los agentes entrecruzantes adecuados y
controlar la concentración del agente entrecruzante y el tiempo de reticulación para
evitar la formación de enlaces cruzados no específicos que puedan afectar la
actividad de la enzima. También es importante controlar la temperatura y el pH
durante el proceso de reticulado para evitar la desnaturalización de la enzima. En
general, la técnica de co-reticulado de inmovilización de enzimas requiere un
cuidadoso control de las condiciones experimentales para asegurar la estabilidad y
actividad catalítica de las enzimas inmovilizadas.

b. INMOVILIZACIÓN POR ATRAPAMIENTO (RETENCION FÍSICA)

Los métodos de inmovilización por retención física son aquellos en que la enzima
queda retenida por el soporte utilizando fuerzas físicas. Es decir, ninguna parte de la
enzima reacciona con el soporte. Dentro de este grupo de métodos se distinguen
diferentes opciones.

ATRAPAMIENTO DE GELES – EN POLIMEROS

¿QUÉ ES?

Es un método que consiste en la retención física de la enzima en las cavidades

interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por pre polímeros
fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato
o resinas de poliuretano. (ARROYO, 1998)

EN UN GEL, POLÍMERO O MATRIZ POROSA:

 Es la formación de un polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima.
Esta queda atrapada en los poros de la matriz polimérica formada. En los geles, la
Enzima se queda encerrada dentro de su estructura. (Gomez, 2020)

GELES HIDROFILICOS. –

El carácter hidrófilo del gel, lo hace compatible con las especies

inmovilizadas y la estructura porosa de la red permite el paso fácil de los reactivos
hasta las especies inmovilizadas. Se ha demostrado que la actividad de las enzimas
inmovilizadas en geles hidrófilos, en los que se ha variado clínicamente la
temperatura, es mayor que en los soportes tradicionales. (Tareas, 2015)

Debido a su propiedad de absorber agua y otras moléculas de tamaño reducido

cuando se expanden, pueden utilizarse también como agentes auxiliares en
procesos de separación, bien sea para concentrar disoluciones o para extraer
selectivamente algún soluto de las mismas y recientemente, se ha investigado el
usos de estos materiales como vehículos para el transporte de drogas o pesticidas.
La posterior liberación de estas sustancias se produce de forma homogénea y
controlada.
Los geles se pueden clasificar en dos tipos, en función de la naturaleza de las
uniones de la red tridimensional que los constituyen:

GELES FÍSICOS.
Presentan una redtridimensional formada por uniones que no son completamente
estables a ciertos cambios físicos (pH, temperatura, etc.), sino que están asociadas a
una formación y disociación de enlace, que se puede dar en los dos sentidos.
Generalmente, las uniones son del tipo de van der Waals y puentes de hidrógeno,
estos tipos de uniones son mucho más débiles que las uniones covalentes. (Tareas,
2015).

GELES QUÍMICOS.

Son aquéllos en los que la red está formada a través de enlaces covalentes. Este

tipo de enlace es muy Esferas de gel de alginato conteniendo enzimas

fuerte y su ruptura inmovilizadas en su estructura

conduce a la degradación del gel. Por este motivo se dice que los geles químicos no
son reversibles con la temperatura, una vez rotos los enlaces no se pueden volver a
formar. (Tareas, 2015)

¿COMO SE HACE?

El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en

una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio
de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. (ARROYO, 1998)
El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que
los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel,
mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las
microcavidades de una fibra sintética. (ARROYO, 1998)

El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere

poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la
enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. (ARROYO, 1998)

Las enzimas pueden quedar atrapadas dentro de polímeros reticulados formando

una red de polímero altamente reticulada en presencia de una enzima como no hay
modificación química de la enzima sus propiedades intrínsecas de la enzima no se
alteran. Sin embargo, la enzima puede desactivarse durante la formación del gel. La
fuga de enzimas también es un problema. El polímero entrecruzado más
comúnmente empleado es el sistema de gel de poliacrilamida. Esto se ha utilizado
para inmovilizar alcohol deshidrogenasa, glucosa oxidasa, aminoácido oxidasa,
hexocmasa, glucosa isomerasa, ureasa y muchas otras enzimas. (Dutta, 2008)

CUIDADOS A TENER EN CUENTA Y REQUERIMIENTOS

 Se requiere controlar las condiciones de polimerización para que no se

produzcan alteraciones en la molécula enzimática.
 Se puede perder proteína lentamente.
  Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas Gel de
poliacrilamida.
 De aplicación general Polímeros conductores.
 Al controlar bien las distintas condiciones favorece su estabilidad contra
desnaturalizantes químicos y térmicos.

ATRAPAMIENTO EN LIPOSOMAS

¿QUE ES?

Los liposomas son vesículas que se forman cuando películas de fosfolípidos son
dispersadas en un medio acuoso; al igual que los liposomas son selectivamente
permeables a iones que las membranas naturales.

Un tipo de cápsula con más propiedades versátiles y menos fragilidad que aquellas
hechas de grasa es el de los liposomas. Estos han sido empleados para la liberación
de vacunas, enzimas y vitaminas en el cuerpo y consisten de una o más capas de
lípidos no tóxicos y aceptables en alimentos; la permeabilidad, estabilidad, actividad
superficial y afinidad pueden variar con el tamaño y la composición del lípido.

¿COMO SE HACE?

Los liposomas se forman cuando una solución acuosa de sustancia activa es

mezclada con la película del lípido. Estructuralmente existen tres tipos de liposomas:
multilamelar, vesículas de un compartimiento y macro vesículas. La sonicación
permite la formación de un solo compartimiento de vesículas, mientras que las
macrovesículas son formadas por inyección de soluciones de lípido en un bufferde
fosfatos.Los liposomas pueden ser obtenidos con cargas positivas por la adición de
aminas o con cargas negativas por la adición de fosfatidil serina o diacetil fosfato.
Materiales hidrofílicos e hidrofóbicos pueden ser atrapados en liposomas. Los
compuestos hidrofílicos son disueltos en agua y mezclados con una película lípidica
para formar liposomas, mientras que los materiales hidrofóbicos son embebidos en
una delgada película de lípido. La liberación del principio activo se realiza por
difusión a través de la bicapa, por destrucción de la vesícula, por medio de una
concentración crítica de iones calcio o por un cambio de pH. El colesterol y los
tocoferoles pueden ser incorporados para reducir la permeabilidad de la membrana e
incrementar la estabilidad de los lípidos en la bicapa. Las sustancias activas solubles
en agua presentan una mejor eficiencia de encapsulamiento que las hidrófobas. Los
liposomas son usados con éxito en la encapsulación de sistemas enzimáticos. Sin
embargo, el uso de disolventes orgánicos limita su uso en aplicaciones en alimentos.

Saborizantes Es ecias aceites edulcorantes

sazonadores
Líquidos Ac linoleico
Agentes redox Blanquedores,madurados
Enzimas o microorganismos
Antioxidantes Ac.ascorbico cítricos
Colorantes
¿Por qué usar liposomas?

• Componentes no toxicos

• Biodegradables

 Capacidad para contener, transportar y ceder principios activos terapéuticos

Liposomas y Farmacos

• Fácil producción

• Dirección

• Duración

• Protección

ATRAPAMIENTO POR MICRO-ENCAPSULACIÓN.

¿QUE ES?

El método puede ser de dos tipos: por microencapsulación en soportes porosos

(con un diámetro de 2<50 nm), que posteriormente pueden ser
recubiertos con un revestimiento nanocompuesto, atrapan la enzima en su
interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura 4A); por
microemulsión o liposomas, combinando la enzima con agentes emulsificantes y
agitando para formar micelas que la protegen de medios ácidos/alcalinos,
proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al., 1999; Kuiper
et al., 2008) (Figura 4B).

¿Cómo SE HACE?

En la microencapsulación las partículas porosas (esferas de sílice con

nanoporos, micropartículas de CaCO3, etc.) son puestas en suspensión con la
enzima por un tiempo dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada es
monitoreada por espectroscopía. La desventaja radica en la inclusión de la enzima
en el interior de la matriz, ya que generalmente queda atrapada en la superficie
exterior y puede desprenderse paulatinamente debido al tipo de interacciones
presentes o tras varios ciclos de uso (Volodkin et al., 2004). Sin embargo, esto
se ve solucionado al controlar el tamaño de poros de las esferas y al dar un
tratamiento con un agente que encapsule la proteína (ej. policloruro de
dialilamonio, nanopartículas de sílice, polihidrocloruro de alilamina o
poliestirensulfonato) evitando su fuga y protegiéndola de proteasas, además, este
método por su naturaleza de interacción suave, permite una alta actividad y
resistencia a cambios de pH y temperatura (Wang y Caruso, 2004; 2005).

CUIDADOS A TENER EN CUENTA Y REQUERIMIENTOS

La microemulsión tiene la ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para

permitir que la enzima funcione en un sistema en solución, pero al mismo
tiempo protegida del ambiente degradante. También puede llevarse a cabo
repetidas veces (emulsión múltiple), agregando agentes emulsificantes
secundarios y espesantes (ej. goma arábiga, Tween 80,
polestireno40<b<poili(isocianoalanina(2<thiophen<3<il<etil)amida)50, entre otros),
para proporcionar una mayor protección. Además, por la naturaleza de los
reactivos utilizados, puede tener uso farmacológico en la administración oral de
inmunoglobulinas. La desventaja de este método radica en la pérdida de
actividad ante la inmovilidad de la proteína al quedar atrapada en la interface
agua/aceite, o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de corte generado durante la
preparación de las micelas (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008). El diámetro
de las micelas puede variar de 100 a 250 nm, dependiendo de los emulsificantes
utilizados, de la fluidez del copolímero y de la habilidad de la enzima para ser
adsorbida en la membrana.
BIBLIOGRAFIA

Universidad Nacional Autónoma de Mexico. (2014). “Enzimas aplicadas en procesos industriales” en

revista digital universitaria. [En línea]. vol.15, No.12. diciembre, Mexico, disponible en:
https://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art96/[accesado el 27 de abril de 2023]

Capitulo 6. Inmovilización de Enzimas. (s. f.).

Scribd. https://es.scribd.com/document/516182568/Capitulo-6-Inmoilizacion-de-
Enzimas

Inmovilización de Enzimas - PDF free.

(s. f.). https://scribd.vdownloaders.com/document/289316721/Inmovilizacion-de-
Enzimas

https://www.researchgate.net/publication/
271836989_Aplicaciones_biotecnologicas_de_la_microencapsulacion

GA Reineccius, Alimentos Technol. 144. (1991).

ZH Qi, y ML Romberger, Estructura Alimentaria 17, 207 (1998).

La encapsulación y microencapsulación son técnicas utilizadas por la industria de

alimentos para proteger partículas como enzimas, vitaminas, minerales, aceites y

sustancias aromáticas, entre otros aditivos alimenticos, de la degradación de sus

propiedades biológicas y fisicoquímicas. La microencapsulación es definida como una

técnica de empaquetamiento de materiales sólidos, líquidos o gaseosos a través de la

aplicación de una cubierta delgada denominada pared, sobre partículas de tamaño del
orden de los micrones.

De esta forma se obtienen microcápsulas que consisten de una membrana

semipermeable, fuerte y delgada de un material polimérico que rodea y contiene a la

sustancia de interés, denominada centro o núcleo activo. Estas microcápsulas pueden

liberar su contenido a velocidades controladas bajo condiciones específicas a la vez que

protege al compuesto encapsulado de factores ambientales y de proceso, incluyendo la

luz, el oxígeno, la temperatura, humedad y acidez, entre otros, cumpliendo de esta

manera su función de conservación de propiedades biológicas o fisicoquímicas. Se utiliza

de igual manera el término de microencapsulación, cuando se encapsulan sustancias de

bajo peso molecular o en pequeñas cantidades, aunque los dos términos, encapsulación y
microencapsulación, suelen emplearse indistintamente.

La técnica de encapsulación de partículas se da a través del uso de agentes que recubren

las partículas de manera superficial que forman la membrana; los materiales más

utilizados para este proceso son los hidrocoloides como goma arábiga, alginato de sodio,
goma gelana, gelatina y goma xantan. También se utilizan almidones de distintas fuentes

como almidón de papa, almidón de maíz y almidón de trigo. Otros materiales utilizados
son grasas como ácido esteárico, mono y diglicéridos, aceites, proteína y lecitina de soya,

proteína de lactosuero, caseinato de sodio y maltodextrina. Es importante destacar que la

calidad del material a utilizar para la encapsulación debe ser alta ya que de ella

dependerá el obtener los mejores resultados en la técnica.