PRACTICA DE LABORATORIO Nº 5.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN MUESTRAS REPRESENTATIVAS OBJETIVO.

• Cuantificar la concentración de proteínas totales utilizando curva patrón por el método

de Biuret.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMETRICO

Fundamentar en base a la colorimetría de acuerdo a la ley de Beer-Lambert, para explicar que

las soluciones coloreadas absorben la luz a diferentes longitudes de onda.

Para medir las concentraciones de una sustancia determinada se necesita un blanco y una
serie de patrones. El blanco contiene todos los componentes de la muestra, menos la sustancia
a determinar.

Puede entonces suponerse que cualquier diferencia en el color del blanco y la muestra se deba
a la muestra. Los patrones deben de presentar un rango de concentraciones conocidas dentro
de límites en la que se cumpla la Ley de Beer- Lambert. Las muestras desconocidas deben
también de medirse a distintas concentraciones con el objeto de asegurar la proporcionalidad
entre absorción y concentración. Se puede determinar directamente la concentración de una
sustancia en una muestra problema a partir de una curva patrón por medios gráficos. La
constancia de los coeficientes de extinción y el carácter lineal de la curva patrón muestran la
validez de la ley de BEER para el sistema a lo largo del rango de concentraciones estudiadas

BASE TEÓRICA.

Las proteínas constituyen la mayor proporción de solutos en el plasma. Las proteínas del suero
se dividen en dos fracciones: Albúmina y globulina. La albúmina representa el más abundante
constituyente de las proteínas, mientras que las globulinas son un grupo heterogéneo de
componentes como las inmunoglobulinas, complemento enzimas, factores de coagulación,
hormonas y proteínas de transporte específicas.

La determinación de las proteínas totales es útil en la detección de hiperproteinemia debido a

la hemoconcentración, como en las deshidrataciones y varias condiciones de hiperglobulemia
con mieloma múltiple, marcoglobulinemia de Wadenstrom, infecciones de ciertas
enfermedades hepáticas y otro estado patológico asociado con un incremento de uno o más
de las muchas proteínas encontradas en el suero. Los ensayos de proteínas totales son útiles
también en la detección de hipoproteinemia observada en la mal nutrición, enfermedades
renales asociadas con pérdida de proteínas, edema, hemorragia, procesos malignos y otras
condiciones.
Históricamente, las proteínas totales eran determinadas por el método de Kjeldahl usando
acido en la digestión, produciendo nitrógeno. Las bases de la determinación usando el reactivo
Biuret fue reportado en 1939 por Kingsley. El procedimiento de Eagle para proteínas totales es
una modificación.

FUNDAMENTO.

El procedimiento de proteínas totales es una modificación de la reacción de Biuret descrito

originalmente por Kingsley. Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio
alcalino se compleja con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxigeno de
los enlaces de todas las proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la
concentración de proteínas y es medida espectrofotométricamente a 540 nm.
MATERIALES Y REACTIVOS

• Reactivo de EDTA/Cu

• Suero patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido
de proteínas.

• Muestra Biológica: Suero sanguíneo libre de hemólisis

• Agua destilada

• Espectrofotómetro o foto colorímetro

• Pipetas

• Baño isotérmico

• Tubos de ensayo

PROCEDIMIENTO.

Utilizar 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos, como se indica en el siguiente
cuadro:

Reactivos ( μL) Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Problema

H2O (d)100 75 50 25 50

Solución Estándar - 25 50 75 -

Muestra Biológic - - - - 50

Biuret( mL) 33 3 3 3
Mezclar e incubar por 15 minutos a 37 ºC. Leer en espectrofotómetro a una longitud de onda
de 540 nm llevando a cero con el blanco.

PRECAUCIONES

El reactivo no pipetee con la boca, son tóxicos

Recomendaciones:

Usar suero sanguíneo el Plasma puede ser usado, pero se obtienen valores ligeramente altos
debido al fibrinógeno. Muestras hemolizadas no se deben usar.

Anote el estado ambulatorio o encamado del paciente. La proteína total de un paciente

ambulatorio será de 0.5 g/dl más grande que el paciente encamado.

Sustancias que interfieren.

La hemólisis debe evitarse. El color producido por 1 mg. de hemoglobina es equivalente a 1.9
de proteínas séricas. En las muestras lipémicas y control lipofilizado deberá usarse blanco.
Bromosulfoftaleina puede dar falsos resultados altos. Valores de bilirrubinas menores de 25
mg/dl no intervienen

CUESTIONARIO

1.- Realizar los cálculos correspondientes para calcular proteína total en la muestra en
investigación utilizando la curva patrón.

2.- Indique las funciones que cumplen las albuminas y globulinas dentro del organismo
humano.

 Facilita el metabolismo y la desintoxicación de diversas sustancias, como la bilirrubina,

metales, iones o enzimas.

 Potencia la eliminación de radicales libres, productos nocivos generados durante la

respiración celular.

 Transporta hormonas tiroideas y liposolubles.

 Transporta ácidos grasos libres y bilirrubina no conjugada, además de otras muchas

sustancias.

 Controla el pH.
3.- Indique las partes que tiene un espectrofotómetro.

4.- Hallar gráficamente la concentración de las proteínas totales (mg/dl) en el suero sanguíneo
utilizando la curva patrón.

5.- Hallar la concentración de las proteínas totales (mg/dl) en suero con factor de calibración
utilizando los datos del tubo estándar 2.

6.- Explique el fundamento de la reacción de Biuret con las proteínas.