NOMBRE:JEREMI DAVID QUISPE CALLAÑAUPA

CODIGO:183410
Solventes Eutécticos
Naturales

Introducción

Los solventes eutécticos naturales (NADES) forman parte de la nueva generación de

solventes sustentables. Estos constituyen una alternativa verde frente a los solventes
orgánicos para la extracción de compuestos bioactivos a partir de matrices vegetales. Entre
las mezclas más ampliamente estudiadas para ésta aplicación, se encuentran las
combinaciones de ácidos orgánicos y azúcares o cloruro de colina (Anexo Tabla 1) .
Asimismo, la incorporación de agua al sistema eutéctico es un factor que afecta no solo a
las propiedades fisicoquímicas sino también influye en el rendimiento de extracción . En
este sentido, resulta necesario optimizar el contenido de agua para cada combinación de
solvente teniendo en cuenta la estructura química de los analitos que se busque extraer. En
general, se ha reportado que bajos contenidos de agua son más adecuados para compuestos
de baja polaridad; mientras que para compuestos polares se obtienen resultados
satisfactorios con mayores contenidos de agua .

Si bien se conoce que en la red supramolecular de los NADES intervienen enlaces

puente hidrógeno y fuerzas de Van der Walls, aún existen escasos reportes que evalúen
estas interacciones y su comportamiento en presencia de agua o de otros analitos. Entre las
técnicas que se han utilizado con este fin, se encuentra la espectroscopia de resonancia
magnética nuclear (RMN). En particular, el estudio del “Efecto Nuclear de Overhauser”
(NOE) evalúa la proximidad espacial a la que se encuentran dos moléculas, lo que permite
confirmar la existencia de enlaces puente hidrógeno y fuerzas de Van der Walls . Esto
resulta de especial interés en el análisis estructural del sistema eutéctico para comprender
su comportamiento como solventes.

Teniendo en cuenta lo expuesto, en esta primera etapa se propuso optimizar la síntesis

de un solvente natural con características adecuadas para la extracción de compuestos
fenólicos polares y de baja polaridad. Para ello, se evaluaron tres combinaciones de
NADES
constituidos por ácidos orgánicos y azúcares (ácido láctico, ácido cítrico, fructosa, glucosa).
Una vez obtenidas las combinaciones óptimas, se realizaron estudios de resonancia
magnética nuclear (RMN) y modelado molecular, con el fin de conocer las interacciones
que ocurren en estos sistemas y así poder comprender su comportamiento como solventes.
Finalmente, se estudió la capacidad del NADES óptimo para estabilizar compuestos
fenólicos por un periodo de 60 días a diferentes temperaturas.

2.1 Materiales y métodos

2.1.1 Reactivos y soluciones

Para la obtención de agua ultrapura (conductividad 18.3 MΩcm) se utilizó un sistema

Milli- Q (Millipore, Billerica, MA, USA). El metanol (MeOH) y el acetonitrilo (ACN) de
grado cromatográfico se obtuvieron de J. T. Baker (USA), mientras que el ácido fórmico se
obtuvo de Sintorgan (Bs. As., Argentina).

Para la preparación de los NADES se utilizó: glucosa anhidra, ácido cítrico anhidro, D
(-) fructosa, L (+) ácido láctico obtenidos de Biopack (Bs.As., Argentina). Se empleó un
agitador magnético con control de temperatura Fisatom (model 752A, Brasil).

Estándares analíticos: 3-hidroxitirosol, p-ácido cumárico, apigenina, oleuropeína, ácido

cinámico y ácido cafeico fueron obtenidos de Sigma Aldrich. Quercetina dihidrato y ácido
trans-ferúlico se obtuvieron de Alfa Aesar y Flukaand SAFC, respectivamente.

Las soluciones madres de los estándares se prepararon disolviendo cada fenol en

metanol grado HPLC para obtener una concentración final de 1000 mg L-1. Las soluciones
resultantes se almacenaron a 4 °C en frascos de vidrios color caramelo. Las soluciones de
trabajo de diferentes concentraciones se prepararon diariamente por dilución de las
cantidades apropiadas de soluciones madre en agua, metanol o NADES. Antes de su uso,
todas las soluciones se filtraron a través de filtros de nylon 0,22 μm.
 Para los análisis por RMN se utilizó: óxido de deuterio (99,9 %) y 3-sal sódica del ácido
trimetilsililpropanoico 2,2,3,3-d4 (TMSP, 98 % grado deuterio) obtenidos de Sigma-
Aldrich.

2.1.2 Optimización de la preparación de NADES

Las combinaciones de NADES seleccionadas para la optimización fueron: ácido láctico-

glucosa, (5:1, LGH); ácido cítrico-glucosa (1:1, CGH) y fructosa-ácido cítrico (1:1, FCH).
Se prepararon siguiendo el método de agitación y calentamiento propuesto por Dai et al; la
mezcla de componentes se colocó en un vial color caramelo de 20 mL y posteriormente fue
agitada y calentada en un agitador magnético con control de temperatura por 60 minutos
(Figura 2.1).

La preparación de los NADES se optimizó utilizando herramientas quimiométricas con

el fin de determinar tanto la combinación más apropiada (LGH, FCH, CGH); como también
los valores óptimos de: temperatura de síntesis, porcentaje de agua y concentración de
buffer. Para determinar cómo influyen estos parámetros, el efecto de ellos sobre los
NADES se evalúo en términos de estabilidad y densidad en tres niveles (-1, 0 y +1). La
densidad (qs = ms/Vs) se calculó pesando un volumen conocido de cada NADES (1 mL).
Finalmente, la estabilidad del sistema eutéctico se evalúo observando que no se forme
precipitado y que no presenten separación de fases. Esta fue monitoreada cada 24 horas, y
los solventes se consideraron estables cuando la mezcla permaneció en fase líquida por un
periodo de 5 días.

Figura 2.1. Los Solventes eutécticos naturales se prepararon siguiendo la metodología de

agitación y calentamiento [7].
2.1.2.1 Diseño Experimental y Análisis Estadístico

Para optimizar la preparación de los NADES, se aplicó un Diseño Central

Compuesto y Metodología de Superficie Respuesta (RSM), utilizando el software
Design Expert, v 7.1 (Stat Ease, Minneapolis, USA). Los resultados se validaron
estadísticamente mediante análisis de la varianza (ANOVA) con un nivel de
significancia de p= 0,05. La adecuación del modelo se evaluó por medio del
coeficiente de determinación (R2) y el p valor del modelo. Asimismo, se establecieron
modelos matemáticos que permitieran describir la influencia de los parámetros
individualmente y/o de las interacciones entre los parámetros en cada respuesta
investigada. Los gráficos de superficie-respuesta se realizaron con el mismo software,
y se representaron seleccionando la función de dos factores, dejando el tercero
constante. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando los programas Statgraphics
Centurion XV v15.2.06 y GraphPad Prism v5.01. Todos los datos se reportaron como
la media ± SD para tres réplicas.