TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE LÍPIDOS PRESENTES EN ALIMENTOS Y MUESTRAS AMBIENTALES

Los lípidos son sustancias que presentan muy baja solubilidad en solventes acuosos, dada por su
estructura molecular. Tanto para fines analíticos como desde el punto de vista metabólico, se los
puede clasificar en lípidos neutros (acilgliceroles y ésteres de colesterol) y lípidos que poseen una
cabeza polar y una “cola” hidrocarbonada no polar (fosfolípidos, glicolípidos y colesterol libre
entre otros). Los métodos de aislamiento de ambas clases de lípidos se basan en la facilidad con
que estas sustancias hidrofóbicas (aun las que poseen una cabeza polar), pueden extraerse de
materiales biológicos mediante homogeinización en mezclas de solventes orgánicos. Tanto los
fosfolípidos, como los acilgliceroles y distintos tipos de colesterol pueden extraerse con buena
eficiencia en mezclas de cloroformo:metanol, en proporciones 2:1 (método de Folch) o 1:1
(método de Bligh-Dyer).
Una vez homogeneizado el tejido en el solvente seleccionado, se separa el extracto mediante
centrifugación.
El tipo de extracto descripto puede realizarse sobre diferentes materiales, por ejemplo: tejidos
frescos enteros, un homogenado realizado en buffer, una fracción enriquecida en membrana
plasmática, etc.
A continuación es necesario realizar una serie de lavados al extracto, para eliminar
completamente el agua presente en el mismo y concentrarlo mediante evaporación a 40 °C bajo
corriente de N2 y posterior resuspensión en un pequeño volumen del solvente empleado para la
extracción.
Seguidamente, el extracto orgánico obtenido es utilizado para realizar la separación
cromatográfica de las diferentes fracciones de lípidos bajo estudio.

Objetivos:
Extraer y separar glicéridos presentes en diferentes materiales biológicos (muestras de
alimentos, tejido vegetal y muestras de suelos)

1º Parte:
Preparación de extractos lipídicos empleando solventes orgánicos.

Reactivos:
- cloroformo: metanol (2:1 o 1:1)
- agua destilada
- cloruro de potasio 0,88 %

Método:
Extraer los lípidos de diferentes muestras según se indica en la tabla del anexo I:

1) Agregar a la muestra (previamente homogeneizada /mortereada) la cantidad indicada de

solventes.
2) Mezclar vigorosamente durante 3 minutos empleando un vórtex.
3) Centrifugar durante 5 minutos a 5000 rpm para permitir la separación de las dos fases. La
fase clorofórmica (sobrenadante) debe quedar por encima de la fase sólida remanente
(pellet). Aclaración: Si las fases quedan invertidas, y queda material sólido sin precipitar se
deberá agregar metanol (como se indica en el anexo I).
 4) Separar fase orgánica (superior) en un Falcon limpio. Si se agregó metanol, agregar la
cantidad suficiente de cloroformo para mantener la proporción inicial.
5) Realizar 2 lavados agregando 0,2 volúmenes de KCl 0,88 %.
6) Centrifugar durante 5 minutos a 5000 rpm para permitir la separación de las dos fases.
7) Descartar la fase acuosa superior.
8) Realizar otros 2 nuevos lavados con 0,2 volumenes de una mezcla de
cloroformo:metanol:KCl 0,88% (3:48:47), denominada “Fase Superior Teórica” (FST).
9) Centrifugar durante 5 minutos a 5000 rpm para permitir la separación de las dos fases.
10) Descartar la fase acuosa superior.
11) Concentración de muestras: evaporar bajo corriente de N2, y en baño termostatizado a
40°C. Una vez que se haya evaporado todo el solvente y quede un residuo oleoso en el
fondo del tubo, resuspenderlo en 50 ul de mezcla de Cloroformo: metanol 2:1.

2º Parte:
Separación de los lípidos neutros presentes en los extractos, mediante Cromatografía en capa fina.

Materiales:
- Sc estándar (de glicéridos, ácidos grasos y/o fosfolípidos)
- hexano
- éter etílico (dietil éter)
- ácido acético concentrado
- placas de sílica gel 60 de 20 x 20 cm, en soporte de vidrio
- Cubas de vidrio para TLC
- Cuba para revelado con I2
- secador para cabello o similar

Método:
1) Preparar el solvente de corrida obteniendo una mezcla de hexano: éter etílico: ácido
acético (60:40:2,5). Colocar en las cubas c.s.p. tener una columna de solvente de
aproximadamente un cm de alto.
2) Dejar estar en las cubas tapadas, para que se saturen con los vapores de la mezcla.
3) Sembrar las muestras en 3 placas de sílica gel. (Volúmenes y puntos de siembra sugeridos
en el anexo II y III).
4) Una vez que las muestras sembradas estén bien secas, colocar las placas en la cuba
conteniendo el solvente de corrida.
5) Dejar correr hasta que el frente del solvente llegue hasta unos pocos centímetros antes
del borde superior.
6) Retirar las placas de las cubas y secarlas con secador bajo campana.
7) Colocarlas en una cuba conteniendo I2, hasta que se puedan observar las bandas
correspondientes a los lípidos presentes en los extractos.

Se muestra a modo de ej, la separación de lípidos neutros a partir de extractos de un tejido animal
(ovocitos de sapo Rinellaarenarum), sometidos a un tratamiento con un plaguicida organoclorado.
Análisis de los resultados:
Calcular las relaciones de frentes (Rf) para los estándares y todas las sembradas. Describir la forma
e intensidad de las diferentes bandas. Discutir la mejor forma de analizar los resultados de la
separación de lípidos neutros por Cromatografía en capa fina.

Lecturas recomendadas
- Gómez-Ullate Ricón R y Serrano Alvarez A. Cromatografía. Principios y Aplicaciones.
https://es.scribd.com/doc/11642417/Cromatografia-Fundamentos-y-Aplicaciones
- Ledea Lozano OE, Martínez Force E, Garcés Mancheño R, Alaiz M, Díaz Gómez M,
Dobarganes C, Moleiro Mirabal J, Hernández Castro C, Rosado Pérez A, Correa Vidal T
(2005) Aplicación de MetodosCromatograficos en el estudio de la Composición Química
del Aceite de Girasol Ozonizado "OLEOZON"® Revista CENIC. Ciencias Químicas, vol. 36.
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181620511012
- Pino Bovey FJ, Noriega Rodríguez JA (2011) Análisis de Clases de Lípidos por
Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución. INVURNUS 6 (2): 38-43.
Anexo I – Tratamientos a realizar con las muestras de acuerdo a sus diferentes orígenes

masa material molido en

Muestra sólida (tejidos) mortero o cortado (g) Mezcla de sv Vol mezcla (ml)
mejillón 0,5 C:M (1:1) 5
hojas (ver nota) 1 C:M (1:1) 5
Realizar lavados,
Suelo 1 1 C:M (2:1) 5
evaporar y
Suelo 2 1 C:M (2:1) 5
resuspender en
arroz 0,5 C:M (2:1) 5 50 l
avena 0,5 C:M (2:1) 5
Leche en polvo 1 C:M (1:1) 5

Muestra líquida volumen ( ml) Sv Vol Sv (ml)

Aceites 0,5 C 0,5 sembrar
Manteca fundida 0,5 C 0,5 directamente

Nota: Método a emplear para lograr precipitar los sólidos y que la fase clorofórmica quede por encima. Una vez realizada la extracción en la mezcla C:M (2:1 o
1:1), agregar 4 ml de metanol, agitar, centrifugar con el resto de las muestras. Separar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo, agregar cloroformo suficiente
para mantener en el extracto la proporción de solventes de la mezcla original. Continuar procesando la muestra, al igual que el resto de las muestras.
 Anexo II- Esquema de la siembra

Placa 1 Placa 2 Placa 3

St St St
Aceite de Chia Planta Avena
Aceite de Sésamo Suelo 1 Leche
Aceite de Girasol Suelo 2 Arroz
Manteca Mejillón
St St St

Punto
de
siembra
Anexo III - Volúmenes para la siembra

Muestra Volumen sugerido (l) Volumen sembrado (l)

Estándar 1 25
Estándar 2 25
mejillón 20
hojas 20
avena 20
suelo 20
arroz 20
Leche en polvo 20
manteca 20
Aceite de chía 7,5
Aceite de sésamo 7,5
Aceite de girasol 7,5