Informe - Grupo2 - Cultivo y Aislamiento de Microrganismos de Interes Biotecnologico

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL
BIOTECNOLOGÍA
INFORME DE LA PRACTICA N° 02
“CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICRORGANISMOS DE
INTERES BIOTECNOLOGICO”
INTEGRANTES:
CATACORA CCALLATA, Ernesto Elías
CCALLI PARIA, José Fernando
CHUCUYA TICONA, Sarai Antonia
FLORES PACXI, Dalila
LOSNO PAMO, Leonidas León
MÁRQUEZ COAQUIRA, Yesabella Milagros
DOCENTE:
DR. SOTO GONZALES, Hebert Hernan
Mayo del 2022

ILO – PERÚ
I
ÍNDICE DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION ................................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 2
2.1. Objetivo General .............................................................................................................. 2
2.2. Objetivo Especifico .......................................................................................................... 2
3. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 3

3.1. Cultivo de microorganismos ............................................................................................ 3
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 3

4.1. Equipos, Materiales, Sustrato y Reactivos ....................................................................... 3
4.1.1. Equipos ..................................................................................................................... 3
4.1.2. ........................................................................................................................................ 3
4.1.3. Materiales.................................................................................................................. 3
4.1.4. Sustratos .................................................................................................................... 5
4.1.5. Reactivos ................................................................................................................... 5
4.2. MÉTODO ......................................................................................................................... 6
Técnica de diluciones seriadas y recuento en placa. ............................................ 6

4.3. PROCEDIMIENTO ......................................................................................................... 6
4.3.1. DIA 1: PREPARACION DE AGARES ................................................................... 6
4.3.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS .......................................................................... 7
4.3.3. DIA 3: RECUENTO DE COLONIAS ..................................................................... 9
5. RESULTADOS .................................................................................................................... 10
5.1.1. DIA 1 ...................................................................................................................... 10
Materiales de trabajo auto clavados ................................................................... 10

5.1.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS ........................................................................ 10
Medios de cultivo (8) ............................................................................................. 11

Caldo nutritivo inoculado..................................................................................... 11
II
5.1.3. DIA 3 ...................................................................................................................... 11
6. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 14
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 15
8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 16
9. ANEXOS............................................................................................................................... 17
ÍNDICE DE FIGURAS
Técnica de diluciones seriadas y recuento en placa. ............................................ 6
Materiales de trabajo auto clavados ................................................................... 10
Medios de cultivo (8) ............................................................................................. 11
Caldo nutritivo inoculado..................................................................................... 11
III
1. INTRODUCCION
Un creciente interés de los productores por extender la superficie establecida con viñedos y
mejorar la calidad de los vinos producidos (avq, 2011). la falta de mercados es uno de los
factores principales que limita el desarrollo de esta agroindustria, porque los vinos carecen de
calidad y tipicidad. ello se debe, en parte, a una acidez alta e insuficiente graduación alcohólica
potencial en los mostos, en particular de uvas tintas, lo cual obliga a retrasar la vendimia para
aumentar la concentración de los azúcares, causando la pérdida de compuestos aromáticos y la
formación de sabores indeseables (ribereau-gayon et al., 2006).
La calidad del vino está fundamentada en el aspecto sensorial, relacionado con los compuestos
químicos presentes y su equilibrio, para derivar en una experiencia organoléptica agradable al
consumidor (charters y pettingrew, 2007). este concepto está sujeto al criterio personal de los
consumidores y es difícil enfocarlo objetivamente, pero se reconocen y se han establecido
rangos aceptables de concentración de ciertos compuestos que inciden directamente en la
calidad, tales como etanol, acidez volátil, so2, así como clasificaciones y recomendaciones
para el contenido de azúcares residuales y acidez total (oiv, 2009).
En la elaboración de los vinos, una etapa fundamental es la fermentación alcohólica (fa) la cual
es una conversión bioquímica de los azúcares en etanol por acción de las levaduras (pasteur,
1857). Durante este proceso intervienen géneros de levaduras, como hanseniaspora,
brettanomyces y candida, aportando distintas características sensoriales al vino. El género
saccharomyces destaca por su mayor eficiencia en la conversión de azúcares y su tolerancia a
concentraciones elevadas de etanol y so2, y es el género fermentativo por excelencia (rainieri
y pretorius, 2000).
La fa puede ocurrir de tres formas:
1) espontánea, desde la microbiota presente de manera natural en el epicarpio de la uva o en
equipos y superficies de la bodega; ésta realza la tipicidad del vino debido a las características
únicas aportadas por los microorganismos nativos.
2) adicionando levadura seca activa (lsa), lo cual brinda un proceso reproducible y controlable,
pero le resta tipicidad al producto.
1
3) inoculación con levaduras nativas seleccionadas, las cuales permitirán procesos controlables
y reproducibles, sin que los vinos pierdan el carácter único y típico que los microorganismos
nativos proporcionan (fleet, 2003; santamaría et al., 2008).
Los criterios de interés general para seleccionar cepas de levaduras enológicas incluyen buena
eficiencia fermentativa, baja producción de so2 y h2s, resistencia al factor killer o bien
presencia de éste y tolerancia a niveles altos de etanol y so2 (pretorius, 2000). Durante el
proceso de selección deben considerarse las necesidades particulares de la región y, una vez
evaluadas las bondades tecnológicas generales, considerar criterios particulares como la
adaptación a bajas temperaturas y producción de aromas (torija et al., 2003), mostos con
concentraciones altas de azúcares (mercado et al., 2007) o requerimientos bajos de nitrógeno
asimilable (manginot et al., 1998).
En contraste con la situación mundial, hay estudios acerca de la selección de levaduras
enológicas, por lo cual los productores locales inducen la fermentación con cepas comerciales
importadas.
Esto implica costos adicionales, fuga de divisas y usar microorganismos que no necesariamente
responden a las necesidades de los vitivinicultores locales.
La hipótesis de este estudio fue que es posible obtener levaduras provenientes de viñedos de la
región vitivinícola con potencial enológico, para mejorar los rendimientos alcanzados por
cepas comerciales. El objetivo del estudio fue aislar, determinar el potencial enológico y
fermentativo, e identificar cepas de levaduras saccharomyces spp. nativas de viñedos.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Desarrollar las principales técnicas de aislamiento, selección, conservación, mantenimiento

de cepas microbianas de importancia biotecnológica, manejo de equipos de laboratorio y
preparación de medio de cultivo.
2.2. Objetivo Especifico
 Fomentar el trabajo en equipo para facilitar el cumplimiento de objetivos de los proyectos.

 Motivar al estudiante en temas de investigación aplicada a la biotecnología ambiental.
 Conocer la infraestructura de los laboratorios de la EPIAM asociados a los principios de
las buenas prácticas de laboratorio (BPL) con responsabilidad.
2
 Inicio del punto de partida de los proyectos biotecnológicos encargados a cada grupo.
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Cultivo de microorganismos
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con

condiciones apropiadas. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos
y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrientes deben
proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista
metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar
macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los
factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura,
aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio (Geo. F. Brooks, 2014).
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Equipos, Materiales, Sustrato y Reactivos
4.1.1. Equipos
Ítem Equipo Cantidad

1 Balanza analítica 1
2 Autoclave 1
3 Cámara de flujo laminar 1
4 Agitador magnético 1
5 Contador de colonias 1
6 Incubadora 1
4.1.2.
4.1.3. Materiales
Ítem Materiales Cantidad

1 Paquete de bolsas ziploc (grandes) 1
2 Paquete de bolsas ziploc (pequeñas) 1
3 Rollo de papel higiénico 1
4 Rollo de papel craft 1
3
5 Plumón indeleble 1
6 Paquete de mondadientes 1
7 Rollo de pabilo 1
8 Rollo de papel aluminio 1
9 Cinta masking tape 1
10 Cinta adhesiva 1
11 Cúter 1
12 Tijera 1
13 Encendedor 1
14 Alcohol 70° de 1000 ml 1
15 Mortero y pilón 1
16 Agua destilada -
17 Mechero bunsen 1
18 Espátula 1
19 Espátula de drigalski 1
20 Placa Petri 15
21 Tubos de ensayo 8
22 Gradilla 1
23 Micropipeta 1000 µl 1
24 Micropipeta 100 µl 1
25 Punta desechable 2
26 Pipeta 10 ml 2
27 Frasco tipo schott 1000 ml 1
28 Matraz Erlenmeyer 500 ml 3
29 Vaso precipitado 100 ml 1
30 Vaso precipitado 1000 ml 1
31 Probeta 1000 ml 1
4
4.1.4. Sustratos

1 Pasas 3
2 Uva 3
3 Higo seco 1
4 Mango 1
5 Plátano 1
6 Durazno 1
4.1.5. Reactivos

1 Nutrient Broth 6.5 g
2 Sabouraud Dextrose Agar 32.5 g
3 Agua filtrada Tipo – II libre de sales 250 ml
5
4.2. MÉTODO
Técnica de diluciones seriadas y recuento en placa.

4.3. PROCEDIMIENTO
4.3.1. DIA 1: PREPARACION DE AGARES
– Primero se realizó la preparación de los medios de cultivo en dos fases, medio solido
(Sabouraud Dextrose Agar) y medio liquido (caldo nutriente).
– Se procedió a realizar los cálculos para preparar los medios de cultivo y diluirlos en agua
tipo 2 en 500 ml y 250 ml respectivamente.
– En el caso de el SDA se utilizaron 32,5 gr y en CD 6.5 gr
– Luego en el interior de la capsula de flujo laminar class tipo II se esterilizo el ambiente con
rayos ultravioleta (UV).
6
– Luego se procedió a realizar el rociado de alcohol en manos y toda la superficie de trabajo

– Se vertió el SDA en 15 placas Petri 5 minutos después de su solidificación, se rotularon y
empaquetaron en bolsas zipo.
– Finalmente colocarlas en la incubadora hasta el día siguiente.
Dilución de agar nutritivo y caldo ntriente
4.3.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS

Todos estos procesos/pasos a excepción de la inoculación del caldo nutritivo se llevaron a cabo
dentro de la cámara de flujo laminar y para ello es necesario la desinfección de las manos.
PASO 1
 Se rotuló 8 tubos de ensayo con los nombres -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 y -8.
 Con la micropipeta de 1000 µl se colocó 1 ml de agua tipo-II en los 8 tubos de ensayo.
PASO 2
 Con la micropipeta de 1000 µl se vertió 5 ml de agua tipo-II en el mortero para facilitar el
proceso de molienda.
 Se colocó dentro del mortero dos uvas, tres pasas, tres arandanos y 1/3 del higo.
 Debido a su tamaño, se cortó una pequeña parte de una zona demasiado madura (mancha
oscura) de el plátano, mango y durazno. (siendo el plátano la única fruta a la que se le retiró
la cáscara)
7
 Se comenzó a moler con el pilón.

 Se vertió 5 ml adicionales de agua tipo-II en el mortero porque la cantidad de agua era
insuficiente para moler las frutas presentes en el mortero y se terminó de moler.
Una vez terminada la molienda de frutas, se guardó las frutas restantes en el refrigerador de
laboratorio.
PASO 3
 Con la micropipeta de 100 µl se extrajó 100 µl de las muestras de frutas ya molidas.
 Se vertió los 100 µl de las muestras de frutas molidas en el tubo de ensayo “-1”.
 Se agitó el tubo de ensayo “-1”.
 Se extrajo 100 µl de la mezcla de 1 ml de agua tipo-II y 100 µl de la muestra de frutas
molidas presentes en el tubo de ensayo “-1”.
 Se vertió los 100 µl extraídos del tubo de ensayo “-1” al tubo de ensayo “-2”
 Se extrajo 100 µl del tubo de ensayo “-2”.
 Se vertió los 100 µl extraídos del tubo de ensayo “-2” al tubo de ensayo “-3”
Se repitió este proceso hasta llegar al tubo de ensayo “-8”, a este proceso/técnica se le denomina
como diluciones seriadas.
PASO 4
 Se vertió alcohol 70° en una placa Petri y se mantuvo una distancia prudente entre esta
placa Petri y el mechero bunsen.
 Se encendió el mechero bunsen con el encendedor.
 Se extrajo 100 µl de la dilución del tubo de ensayo “-1”.
 Se vertió en una de las 14 placas Petri restantes, no sin antes rotular la que se va a utilizar
con el mismo nombre del tubo de ensayo del cual se ha utilizado la dilución.
 Se sumergió la parte superior de la espátula de drigalski en el alcohol 70° de la placa Petri
y se calentó con el mechero bunsen, con el fin de esterilizar dicho instrumento.
 Se esparció los 100 µl de la dilución del tubo de ensayo “-1” por toda la superficie de la
placa Petri con ayuda de la espátula de drigalski.
8
Se repitió este proceso con el resto de diluciones presentes en los tubos de ensayo.
PASO 5
 Se guardó las 8 placas Petri que contienen las muestras inoculadas en una bolza ziploc.
 Por último, se almacenaron las 8 placas Petri en la incubadora por tres días.
PASO 6
 Con la micropipeta de 1000 µl se extrajo 1 ml de la muestra de frutas molidas y se vertió
en el caldo nutritivo contenido en el matraz Erlenmeyer de 500 ml.
4.3.3. DIA 3: RECUENTO DE COLONIAS

Después de permanecer más de 48 horas en la incubadora, las 8 placas Petri fueron
analizadas visualmente y se procedió a contar el número de colonias cultivadas.
- En primera instancia se observo que en las placas -1 y -2 había una notable proliferación
de colonias que eran imposible su recuento, por lo que no fueron incluidas en el recuento
de colonias. (Figura 5)
- También se observó que la cantidad de proliferación de colonias bajaba en forma
ascendente conforme con el rotulado del -1 a -8 de las placas, como se sospechaba.
- En un contador de colonias estándar se comenzó colocando la placa -3 y con un plumón
indeleble se procedió a contar el número de colonias.
- Solo se consideraron las colonias aisladas o separadas.
Terminado el conteo y análisis de resultados, se procedió nuevamente a encender la cámara de

flujo laminar.
- Todos los siguientes procedimientos se realizaron dentro de ella.
- El siguiente paso fue seleccionar las colonas aisladas y particulares para poder extraerlas
en las placas Petri con medio de cultivo
- Para este procedimiento se utilizo palitos mondadientes previamente esterilizadas
- Con la ayuda del mondadientes se extrajo las colonias seleccionadas para colocarlos en
forma de barras en las placas Petri
- En total llenamos dos placas Petri
- Estas dos placas fueron llevados nuevamente en la incubadora para su análisis luego de 2
dias.
9
5. RESULTADOS
5.1.1. DIA 1
Materiales de trabajo auto clavados

5.1.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS
10
Medios de cultivo (8)
Caldo nutritivo inoculado
5.1.3. DIA 3
11
Placa Petri Imagen Conteo

Dilución -3 78
Dilución -4 29
Dilución -5 21
12
Dilución -6 5
Dilución -7 5
Dilución -8 13
13
Figura 5: Placas Imposibles de contar
6. DISCUSIÓN
Las frutas son fuentes importantes de levaduras debido a su gran cantidad de azúcares queestá
compuesta comúnmente de levaduras y hongos.
En esta práctica se encontró una gran riqueza de especies en los diferentes tipos de fruta (uva,
higo seco, plátano, mango, durazno, pasa y arándano) mientras sea mayor la cantidad de frutos
utilizados existe la posibilidad de aislar una gran cantidad de diferentes especies delevaduras.
Adicionalmente, varias de las especies reportadas tienen un gran potencial biotecnológico.
En los frutos que hemos utilizado poseen una alta cantidad de azúcares que se procedió a
macerar y dándonos como resultado en las tres primeras placas Petri una mayor concentración
de levaduras.
El interés fundamental de la práctica de laboratorio ha sido obtener levaduras autóctonas,
principalmente Saccharomyces, para la producción de alcohol.
El método empleado para el muestreo ha sido sencillo y ha cumplido con su función, la cual
era tomar levaduras del campo.
14
7. CONCLUSIONES
 En las placas Petri enumeradas por -1, -2 y -3 existía una abundante concentración de
levaduras por ello no se procedió con el conteo de colonias.
 En las placas enumeradas del -4 hasta el -8, se pudo realizar el conteo de colonias debido
a que su concentración de levaduras no era tan alta y se encontraban separas/aisladas lo que
nos facilitó el conteo.
 Dentro del aislamiento de levaduras se obtuvieron una gran diversidad de microorganismos

de cada muestra. No obstante, se logró aislar 32 levaduras provenientes de los frutos
utilizados
15
8. BIBLIOGRAFÍA
GEO. F. Brooks, J. S. (2014) Microbiología médica (26 ed.). INTERAMERICANA

EDITORES, S.A. Obtenido de
https://accessmedicina.mhmedical.com/book.aspx?bookid=1507
Artigas F., Machado V., (2017) Aislamiento, Selección e Identificación de levaduras Nativas
conpropiedades Enológicas en uvas Tannat., Universidad ORT Uruguay Facultad
de Ingeniería.
https://dspace.ort.edu.uy/bitstream/handle/20.500.11968/3600/Material%20completo.
pdf?sequence=-1&isAllowed=y
16
9. ANEXOS
Anexo 1.
Material preparado para esterilizar en un Autoclave.
Anexo 2.
Explicación algunas recomendaciones sobre el uso del Autoclave.
17
Anexo 3.
Preparar los medios de cultivo según las instrucciones del fabricante.
Anexo 4.
Explicación por parte del docente encargado del uso del contador de colonias y consideraciones.
18
Anexo 5.
Frutas dulces siendo molidas en un mortero.
Anexo 6.
Aplicación de la disolución al cultivo en la cámara de flujo laminar.
19
Anexo 7.
Resultados obtenidos pasado 3 días.
20

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ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

Mayo del 2022

2.2. Objetivo Especifico .......................................................................................................... 2

3. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 3

4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 3

4.1.1. Equipos ..................................................................................................................... 3

4.1.4. Sustratos .................................................................................................................... 5

4.1.5. Reactivos ................................................................................................................... 5

4.2. MÉTODO ......................................................................................................................... 6

Técnica de diluciones seriadas y recuento en placa. ............................................ 6

4.3.1. DIA 1: PREPARACION DE AGARES ................................................................... 6

4.3.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS .......................................................................... 7

4.3.3. DIA 3: RECUENTO DE COLONIAS ..................................................................... 9

Materiales de trabajo auto clavados ................................................................... 10

Medios de cultivo (8) ............................................................................................. 11

2.1. Objetivo General

Desarrollar las principales técnicas de aislamiento, selección, conservación, mantenimiento

 Fomentar el trabajo en equipo para facilitar el cumplimiento de objetivos de los proyectos.

3.1. Cultivo de microorganismos

El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con

4.1. Equipos, Materiales, Sustrato y Reactivos

Ítem Equipo Cantidad

Ítem Materiales Cantidad

Ítem Equipo Cantidad

Ítem Equipo Cantidad

Técnica de diluciones seriadas y recuento en placa.

4.3.1. DIA 1: PREPARACION DE AGARES

– Luego se procedió a realizar el rociado de alcohol en manos y toda la superficie de trabajo

Dilución de agar nutritivo y caldo ntriente

4.3.2. DIA 2: DILUCIONES SERIADAS

 Se comenzó a moler con el pilón.

4.3.3. DIA 3: RECUENTO DE COLONIAS

Terminado el conteo y análisis de resultados, se procedió nuevamente a encender la cámara de

Materiales de trabajo auto clavados

Medios de cultivo (8)

Caldo nutritivo inoculado

Placa Petri Imagen Conteo

Figura 5: Placas Imposibles de contar

compuesta comúnmente de levaduras y hongos.

Adicionalmente, varias de las especies reportadas tienen un gran potencial biotecnológico.

El interés fundamental de la práctica de laboratorio ha sido obtener levaduras autóctonas,

principalmente Saccharomyces, para la producción de alcohol.

era tomar levaduras del campo.

levaduras por ello no se procedió con el conteo de colonias.

a que su concentración de levaduras no era tan alta y se encontraban separas/aisladas lo que

nos facilitó el conteo.

 Dentro del aislamiento de levaduras se obtuvieron una gran diversidad de microorganismos

GEO. F. Brooks, J. S. (2014) Microbiología médica (26 ed.). INTERAMERICANA

Material preparado para esterilizar en un Autoclave.

Explicación algunas recomendaciones sobre el uso del Autoclave.

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