UNIVERSIDAD TÉCNICA PRIVADA COSMOS

FACULTAD DE MEDICINA
CARRERA DE MEDICINA

UNIDAD: 1 “ GENERALIDADES DE HISTOLOGÍA” CAPÍTULO 3

“TECNÍCAS HISTOLOGICAS”
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

 Definir que son las técnicas histológicas.

 Describir las técnicas histológicas más utilizadas en la práctica médica.

 Identificar las técnicas comunes de tinción en histología, la detección de proteínas y

ácidos nucleicos por microscopia, así como los métodos especiales en biología celular.
 Explicar cuál es la importancia y el uso de la biopsia por congelación

1. INTRODUCCION

Con el paso de los años, muchos descubrimientos de las ciencias naturales se

relacionaron con el desarrollo de nuevos métodos analíticos. Como
ejemplos pueden nombrarse la invención y el posterior desarrollo de la
microscopia óptica, la microscopia electrónica, la difracción de rayos X, el
fraccionamiento celular, la inmunohistoquímica y la tecnología del DNA. Es
necesario contar con ciertos conocimientos sobre los principios
fundamentales de los métodos aplicados para comprender sus
posibilidades y limitaciones y para poder adoptar una postura crítica
respecto de la interpretación de los resultados alcanzados mediante los
distintos métodos. En consecuencia, para comenzar el estudio de la histología,
a continuación se revisarán los métodos histológicos en general.

Otro pilar importante en la asignatura es el descrito a continuación, ya que a lo

largo del texto, y en el sitio web complementario principalmente, se observarán
Imágenes microscópicas de los órganos, por lo que es necesario e| conocer el
método que se utiliza para que esos tejidos lleguen a nuestras manos.

La técnica histológica está conformada por varios pasos con el fin de mantener
el tejido muerto mediante reacciones químicas, y por tanto, o en lo posible, el
aspecto de las estructuras como en el organismo vivo.

2. TECNICAS HISTOLOGICAS

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¿Cómo se realiza las técnicas histológicas para su estudio en microscopia

óptica?

Se realiza por medio de un conjunto de operaciones o pasos a seguir al que se

somete una materia para poder observar al microscopio.

Las Técnicas Histológicas incluyen los siguientes pasos:

 Obtención de la Muestra.
 Fijación de la Muestra.
 Deshidratación.
 Aclaramiento
 Inclusión en Parafina.
 Obtención de cortes.
 Tinción
 Montaje

2.1. Obtención del material: La muestra puede provenir.

- Necropsias o Autopsias: Son las piezas que se obtienen de un cadáver.

- Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida
con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico
histopatológico. Las biopsias pueden ser incisionales (parte del
órgano) o escisionales (todo el órgano, por ejemplo un ganglio
linfático), o tomarse por medio de una endoscopía o durante una
cirugía; en este último caso, la llamada biopsia por congelación permite
al cirujano tener la certeza de que extirpó toda la masa patológica y
además tener un diagnóstico por parte del patólogo para determinar su
siguiente acto. La muestra también puede ser de sangre o una citología
exfoliativa

Citología exfoliativa

2.2. Fijación: Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias
químicas que tienen varias finalidades:

- Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible

a su estado in vivo.

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- Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas

películas de éste.

- Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.

- Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte

de la célula.

Fijadores químicos: son los más utilizados; pueden ser:

 Fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química.

 Fijadores compuestos, cuando varias sustancias intervienen en su
constitución.

Fijadores simples:

- Formol al 10%, es el más usado . Su empleo es aconsejable en todos los

casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando
se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.

- Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.

- Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados

(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).

Fijadores compuestos:

En su composición intervienen un número variable de fijadores simples

racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de
ellos o atenuar sus defectos.

- Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.

- Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
- Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
- Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
- Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.

Fijadores físicos:

- Desecación.
- Calor seco.
- Calor húmedo.
- Frío.
- Congelación y desecación.

Para Microscopia Electrónica se usan: Glutaraldehído al 2.5%,

Paraformaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio. Permiten
conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el
formaldehido, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.

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A la izquierda corte de riñón fijado en formol; a la derecha corte de riñón no fijado.

Obsérvese que el fijado mantiene su estructura y capta más colorante.

2.3. Deshidratación

Debido a que el agua representa una gran proporción del tejido se aplica una
serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante,
por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con
una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el
alcohol al 100 % para eliminar el agua.

2.4. Aclaramiento

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es

miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la
mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida).

La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. Se llama aclaramiento ya

que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que
cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o
Cloroformo como medios de aclaramiento.

NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al

extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.

2.5. Inclusión en parafina

A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser

observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por

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una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son:
gelatina y parafina. El objeto de la inclusión es tener un objeto lo
suficientemente duro para su manejo y corte.

La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión

en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en
el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le
agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30
minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel

o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente,
formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este
bloque se le denomina Taco.

Bloque de parafina

2.6. Obtención de cortes

El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como

para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para
microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros. Para estos
cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.

Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE

CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de
congelación llamado CRIOSTATO. La ventaja de esta técnica es que los cortes
que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material
patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el
transcurso de una operación.

Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados

ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado
medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O
DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un
diámetro de 3mm.

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Micrótomo

2.7. Tinción histológica

La tinción de hematoxilina y eosina (H & E) es el método más utilizado para
preparar portaobjetos para microscopía de campo brillante. Las estructuras
basófilas, como los núcleos celulares, se tiñen de azul oscuro o púrpura por
este método, mientras que el material acidófilo como el colágeno y muchos
citoplasmáticos las proteínas se tiñen rosa-naranja.

2.8. Montaje
Los cortes en el portaobjetos con una gota de medio de montaje
transparente, como resina sintética, para su perfecta adhesión. Se coloca un
cubreobjetos para proteger el preparado.

3. COLORANTES ÁCIDOS Y BÁSICOS

Hematoxilina y eosina
La tinción de H & E puede usarse con éxito para estudiar una amplia
variedad de tipos de tejidos y órganos.
Su estructura es la siguiente:
o Hematoxilina: anilina +, se considera un colorante básico con
carga positiva neta. Catión.
o Eosina: anilina - se considera un colorante ácido con carga
negativa neta. Anión.

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Dentro de la célula encontramos componentes aniónicos, como en los grupos

fosfato de los ácidos nucleicos en forma de heterocromatina y nucléolos, los
grupos sulfato de los glucosaminoglucanos, los grupos carboxilo de las
proteínas, la matriz del cartílago y el retículo endoplásmico rugoso. Al ser
aniones con carga negativa, presentan entonces atracción por cationes
(carga positiva) y basofilia (afinidad por las bases), y se tiñen con
hematoxilina.
De manera contraria, los componentes catiónicos de la célula, como los
filamentos citoplasmáticos, los componentes de la membrana y las fibras de
colágena, al ser cationes con carga positiva presentan entonces atracción
por aniones (carga negativa) y acidofiiia (afinidad a los ácidos), y se tiñen
con eosina.

Coloración con Hematoxilina y eosina (H&E). Esta serie de muestras de cortes de páncreas
seriados (contiguos) demuestran el efecto de la hematoxilina y la eosina utilizadas solas o
combinadas. a. En esta fotomicrografía se ve una tinción con hematoxilina sola. Si bien hay una
tinción general de la muestra, aquellos componentes y estructuras con gran afinidad por el colorante
se tiñen con una intensidad mucho mayor, por ejemplo, el ADN nuclear y el ARN citoplasmático. b.
En esta fotomicrografía, la eosina, colorante de contraste, consigue una tinción general de los tejidos
al usarse sola. Sin embargo, debe notarse que los núcleos son menos conspicuos que en la muestra
teñida sólo con hematoxilina. Después de que la muestra se colorea con hematoxilina y que se le
prepara para la tinción con eosina en solución alcohólica, la hematoxilina que no estaba unida con
firmeza se pierde, y entonces la eosina tiñe esos componentes para los que tiene gran afinidad . c.
Esta fotomicrografía muestra el efecto de la tinción con ambos colorantes (H&E). 480 Χ.

La metacromasia.
Se define como el cambio de color de un colorante básico, por ejemplo del
azul de toluidina al rojo o púrpura. Esto ocurre por la presencia de
políaniones en el tejido, que lo hacen reaccionar de modo que el colorante
se aglomera y sus propiedades cambian. Como ejemplo, la sustancia
fundamental del cartílago formada por una alta concentración de grupos
sulfato y fosfato, los granulos de heparina en los mastocitos, y el retículo
endoplásmlco rugoso de las células plasmáticas teñidas con azul de toluidina,
se verán púrpura o rojo.

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Célula cebada teñida con azul de toluldlna. Obsérvense los granulos de color púrpura
(metacromasla)

4. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA
Los procedimientos histoquímicos y citoquímicos se basan en la unión
específica de un colorante con un componente celular particular que exhibe
actividad enzimática inherente.
4.1. La eosina
Es un colorante ácido (rosa) y tiene una carga neta negativa. Reacciona con
grupos catiónicos cargados positivamente en células y tejidos, en particular
con los grupos amino de las proteínas (estructuras eosinófílas).
4.2. La hematoxilina
Actúa como un colorante básico (azul) y tiene una carga neta positiva.
Reacciona con grupos fosfato ionizados cargados negativamente en los
ácidos nucleicos (estructuras basófilas).
4.3. El ácido peryódico-reactivo de Schif
(PAS) tiñe hidratos de carbono y moléculas ricas en hidratos de carbono de
un color púrpura característico. Se utiliza para demostrar el glucógeno en las
células, moco en las células y tejidos, la membrana basal y fibras reticulares
en el tejido conjuntivo.
4.4. Reacción de Feulgen
Se utiliza para teñir DNA. Se eliminan los grupos purínicos del DNA por
medio de una hidrólisis acida suave. De esta manera se abre el anillo de la
desoxirribosa y se forma un grupo aldehido que reacciona con el reactivo de
Schiff, con la aparición del color rojo característico en el sitio del DNA.
4.5. Tricrómico de Masson.
Tiñe de azul oscuro el núcleo, de rojo las fibras de músculo, la queratina y el
citoplasma, y de azul claro la colágena y el mucinógeno.
4.6. Tricrómico de Gallego.
Tiñe de verde la colágena, de verde el músculo y de color café los núcleos.
4.7. Tinción de Wrigth.

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Se emplea para la observación de frolis sanguíneos (fig. 2-23). De rosa se

verán los eritrocitos y los gránulos de los eosinófilos; de púrpura, los
núcleos.
4.8. Colorantes Sudán.
Los colorantes Sudán disueltos en alcohol, se emplean para la determinación
histoquímica de lípidos. Después de la fijación de los lípidos en formol, la
muestra se congela y se corta para evitar su eliminación por medio de la
aclaración. La tinción se produce cuando las moléculas del colorante se
distribuyen entre los lípidos y el solvente. Para evitar la extracción del
solvente y los lípidos, después de la tinción los cortes se Incluyen en un
medio acuoso. De este modo, los colorantes Sudán, rojo Sudán y negro
Sudán tiñen con intensidad los triacilgliceroles. Tienen utilidad en el estudio
de las vainas de mielina de las fibras nerviosas, y del tejido adiposo.

4.9. La inmunocitoquímica
Se basa en la especifcidad de una reacción entre un antígeno y un
anticuerpo que está conjugado ya sea con un colorante fuorescente (para
microscopia óptica) o con partículas de oro (para microscopía electrónica).
Tanto el método inmunocitoquímico directo como indirecto se utilizan para
localizar a un antígeno diana en las células y tejidos. La hibridación es un
método de localización de ARNm o ADN mediante la hibridación de la
secuencia de interés con una sonda de nucleótidos de secuencia
complementaria. La técnica de hibridación in situ con fuorescencia (FISH),
utiliza colorantes fluorescentes combinados con sondas de nucleótidos, para
visualizar múltiples sondas al mismo tiempo. Esta técnica es muy utilizada en
pruebas genéticas. La autorradiografía utiliza una emulsión fotográfica
colocada sobre un corte histológico para localizar material radiactivo dentro
de los tejidos.

4.10. Histoquímica enzimática

El estudio de la célula no sólo se ha quedado en su morfología, sino que
también ha llegado sus funciones. Uno de los métodos que lo ha permitido es
la histoquímica enzimática, cuyo fin es la localización de una enzima en un
tejido a través de su producto. Inicialmente hay que tener especial cuidado
durante la fijación para que se preserve la actividad enzimática. La fijación
aldehídica débil suele ser el método preferido. También mediante
congelación a -10°C de tejido no fijado se mantiene la mayor parte posible
de la actividad enzimática. Se lleva a cabo mediante el uso del sustrato (AB)
y la enzima que lo escinde en el producto A + B, y se agrega un reactivo (R)
de captura que puede ser un colorante o metal pesado capaz de formar un
producto insoluble con A o B:
A B+R---------enzima -> AR+B

Las enzimas se caracterizan por la especificidad de su sustrato, lo cual permite su

localización histoquímica exacta.

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4.11. Inmunohistoquímica

La reacción entre un antígeno y un anticuerpo es en extremo específica. Un

anticuerpo, también llamado inmunoglobulina, es una glucoproteína
producida por las células plasmáticas provenientes de los linfocitos B en
respuesta a una proteína extraña, llamada antígeno.

Se puede aplicar en cortes de tejido previamente fijados o congelados. Los

anticuerpos se marcan mediante un enlace químico en una sustancia que
puede transformarse en visible (fluorocromos que absorben luz UV y emiten
luz visible verde, como la fluoresceína, roja o amarillo). Existen dos métodos
de marcado:

a. Inmunohistoquímica directa: Es un procedimiento de un solo paso en el

cual se marca el anticuerpo contra la macromolécula con un colorante
fluorescente que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. La emisión
de la señal es de poca intensidad, por lo que hoy ha sido reemplazado casi
totalmente por el método indirecto. Puede observarse con un microscopio de
fluorescencia o confocal.

b. Inmunohistoquímica indirecta: Recibe el nombre de «técnica del

emparedado» y consta de dos pasos. Se hace reaccionar la muestra con un
anticuerpo primario no marcado dirigido contra el componente que se desea
demostrar, se elimina el exceso que no se fijó y se hace reaccionar con un
anticuerpo secundario marcado dirigido contra el anticuerpo primario. De
esta forma se aumenta considerablemente la señal fluorescente emitida por
el tejido. Otra ventaja es que puede utilizarse un solo anticuerpo secundario
para localizar la unión de varios anticuerpos primarios diferentes.

En lugar de marcar el anticuerpo con fluoresceína puede conjugarse con

otras sustancias o enzimas, como la peroxidasa de rábano, que convierte
sustratos incoloros en un producto insoluble de un color específico que se
precipita. Otra variante es con ferritina, que contiene hierro para su
visualización en el microscopio electrónico de transmisión.

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Lecturas recomendadas

Gartner L, Hiatt J. Texto atlas de histología. 3a ed. México: McGraw-Hill; 2008.

Geneser Finn. Histología. 3a ed. México: Médica Panamericana; 2000.

Ross M, Pawlina WT, Histología. Texto y atlas color con biología celular y
molecular. 6a ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2013.

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