Microbiología de Alimentos

Unidad 2: Microbiología del agua

Reporte de práctica 1. Mesófilos aerobios

Profesor: Miguel Ángel Díaz Alday

Equipo 2. Integrantes:
Flores Villalba Israel de Jesús 18321239
Gutiérrez López Odalis 18320364
Hernández Solís Andrómeda Rigel 18321243
Ríos de la Rosa Gilbert Aldhair 18320426
Ruíz Espinosa Yamil Guadalupe 18320431
Salazar Peralta Axel Manuel 18320432

IB1 Ingeniería bioquímica

Periodo: Agosto-Diciembre 2021

Fecha: 25-Octubre-2021
ÍNDICE.

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 4
OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 6
MARCO TEORICO ........................................................................................................................ 6
TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO ....................................................................................... 6
1. MEDIOS SIMPLES .................................................................................................. 6
2. MEDIOS ENRIQUECIDOS .................................................................................. 6
3. MEDIOS SELECTIVOS ......................................................................................... 7
4. MEDIOS DIFERENCIALES ................................................................................. 7
LABORATORIO ............................................................................................................................. 8
Materiales y reactivos .............................................................................................................. 8
Preparación de medio de cultivo ........................................................................................ 8
METODOLOGIA...................................................................................................................... 10
RESULTADOS ............................................................................................................................. 12
10^-4ANÁLISIS DE RESULTADOS .................................................................................. 12
CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 13
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 14
ANEXOS .......................................................................................................................................... 15

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1…………………………………………………………………………6
Fig. 2…………………………………………………………………………6
Fig. 3…………………………………………………………………………7
Fig. 4…………………………………………………………………………8
Fig. 5…………………………………………………………………………8
Fig. 6…………………………………………………………………………9
Fig. 7…………………………………………………………………………9
Fig. 8 Diagrama de flujo de la metodología…………………………….10
Fig. 9………………………………………………………………………..11
Fig. 10………………………………………………………………………11
Fig. 11………………………………………………………………………11
Fig. 12……………………………………………………………………….11

2
 Fig. 13……………………………………………………………………….11
Fig. 14. Resultado de cultivo de bacterias a 10^-4…………………….12
Fig. 15………………………………………………………………………12
Fig. 16………………………………………………………………………12
Fig. 17………………………………………………………………………12
Fig. 18 Diagrama de flujo del método de siembra en placa por
vaciado……………………………………………………………………..18
Fig. 19 Esquema de trabajo para dilución de las muestras………….18

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Materiales y reactivos……………………………………………8

3
INTRODUCCIÓN
La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios
de ecología microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer
al responsable de un efecto benéfico o identificar al microorganismo potencial
de causar alguna infección severa, sino también es importante saber el número
de microorganismos implicados, para establecer si éstos serán capaces de
desarrollar una función benéfica o perjudicial. Distintas han sido las estrategias
para contabilizar a los microorganismos cultivables en muestras ambientales y
de laboratorio; las cuales presentan ventajas y desventajas. El conteo de
bacterias podría realizarse mediante el método del Número Más Probable
(NPM), éste es útil para contabilizar bacterias que son difíciles de aislar de una
muestra, pero que pueden ser detectadas por la actividad de alguna
característica metabólica. Por ejemplo el conteo de las especies bacterianas
que son capaces de captar nitrógeno atmosférico, bajo condiciones
microaerofílicas (Cavalcante y Döbereiner, 1988) se ha realizado mediante el
método NPM usando medios semigelificados carentes de nitrógeno; las tablas
de Mac Grady son útiles en estos casos. La metodología de recuento en placa
por plaqueo es una metodología ampliamente utilizada (Hoben y
Somasegaran, 1982), que consiste en realizar diluciones seriadas 1:10 y
extender 100µl de cada dilución en una placa; las placas se incuban hasta que
las colonias son apreciables para su recuento. Esta metodología tiene la
ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo consume mucho
tiempo durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento de bacterias a
partir de muestras cuya población se desconoce se requiere realizar el
extendido de 7 diluciones y la muestra original (para cada conteo) lo que
significa consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para los
plaqueos, sin tomar en consideración repeticiones. Para disminuir el tiempo de
procesamiento de muestra, la metodología ha sufrido modificaciones al paso
del tiempo y en la actualidad se usan bolitas de acrílico en lugar de un asa de
vidrio para extender las muestras. Otra técnica recuento de bacterias utilizada
es la de vaciado en placa, que consiste en colocar 1 ml de muestra de cada
una de las diluciones seriadas en las placas, donde se vacía posteriormente el
medio de cultivo a punto de gelificar (agar aproximadamente a 45°C); ésta se

4
usa ampliamente para determinar el número de Coliformes presentes en
muestras de agua y alimentos, sin embargo el método podría ocasionar la
muerte selectiva de algunas cepas sensibles a calor (Clarck, 1967), en este
método se evita el plaqueo de las diluciones pero el número de placas y medio
de cultivo requerido es equivalente. Una de las técnicas cuyo uso se ha
intensificado para el recuento bacteriano, es la técnica de goteo en placa
(Herigstad et al., 2001; Hoben y Somasegaran, 1982), debido a que ésta es
fácil, rápida y económica. El goteo en placa consiste en colocar gotas de 20 µl
de cada una de las diluciones seriadas, en placas de medio; después de su
crecimiento se cuenta el número de colonias presentes y se realizan los
cálculos requeridos. La metodología de goteo en placa requiere de 1 a 2 pacas
de cultivo para monitorear todas las diluciones seriadas de cada muestra, lo
que facilita elevar el número de repeticiones experimentales y aumentar el
tamaño de muestra para comparaciones estadísticas. La eficiencia del método
ha resultado muy similar a las técnicas de recuento por plaqueo (Hoben and
Somesagarán, 1982). Cuando se desea cuantificar el número de bacterias
presentes en múltiples muestras, los procedimientos de rutina suelen consumir
mucho tiempo. En ese periodo las muestras podrían sufrir modificaciones en
su población. Una metodología más económica que el recuento por goteo en
placa y que puede manejar mayor cantidad de muestras es la metodología de
goteo en placa 6X6 (Chen et al., 2003). En este método se realizan diluciones
seriadas (base 10) de las muestras líquidas originales contenidas en una placa
multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal, por lo que se trabajan 6
muestras a la vez. Las diluciones realizadas son dispensadas con la misma
pipeta multicanal en una misma placa; razón por la que se ha designado a esta
metodología como cuantificación simultánea. La única desventaja es que hay
que tener un buen manejo de la pipeta multicanal a la hora de dispensar en el
medio de cultivo pues de otra forma el goteo podría mezclarse con diluciones
vecinas. La dispensación de cada una de las diluciones implica la toma de
puntas con la pipeta multicanal, la absorción de muestra y su colocación en el
medio de cultivo.

5
OBJETIVOS
Objetivo general: aprender la técnica de vaciado en placa.
Objetivo específico: contar las colonias que se forman en las muestras
después de un cierto tiempo de ser sembrada e inoculadas.

MARCO TEORICO
Un medio de cultivos es el conjunto de nutrientes factores de crecimiento y
otros cocmponentes que crean las condiciones necesarial para el desrrollo de
los microorganismos. La deversida metabolica de estas es tan grande que la
variedad de medios de cultivos es muy grande, no existe un medio de cultivo
universal adecuados para todos ellos, ni siquiera refiriéndonos a las bacterias
con exclusividad

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

1. MEDIOS SIMPLES
Poseen los requisitos nutricionales para permitir el desarrollo bacteriano
general, emeplos: agar nutritivo, caldo nutritivo, entre otros

Fig. 1

2. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios simples o comunes a los que se les añade ciertos elementos como
sangre, suero, liquido ascítico, huevo, glucosa, vitaminas, etc. Lo que permite
el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes
inhibidores del crecimiento de bacterias existentes nutricionalmente, entre
algunos ejemplos: agar sangre, medio de Lowensteim-Jean enriquecido con
huevo para facilitar el crecimiento de Mycrobacterium; agar desoxicolato-
lactosa(DLA) enriquecido con lactosa y desoxicolato.

Fig. 2

6
 3. MEDIOS SELECTIVOS
Se consiguen añadiendo al agar nutritivo compuestos químicos nocivos para
algunas bacterias cuyo crecimiento no es de interés o también mediante una
alteración de las condiciones físicas del medio entre algunos ejemplos
tenemos:
• El agar Mac Conkey que contiene cristal violeta
• Thayer-Martin medio selectivo para Neissar, ya que este contiene
antibióticos como la vancomicina colistina y nistatina
• Caldo lactosado bilis verde brillante donde bilis inhibe el crecimiento de
bacterias gran positivas
• Lowenstein-Jensen con verde de malaquita es selectivo para
Mycobacterium

Fig. 3

4. MEDIOS DIFERENCIALES
A estos medios se le adicionan sustancias para que solo crezcan ciertas
bacterias y estas al actuar sobre algunas de las sustancias adicionadas
permiten observar macroscópicamente ciertas propiedades de crecimiento que
ayudan a diferenciar sus colonias de otras especies diferentes, entre algunos
ejemplos contamos:
Agar eosina azul de metileno: diferencia E. coli (color verde metálico brillante)
de colonias enterobacter aerogenes (color rosado, consistencia mucosa y
crecimiento abundante)
Agar sangre diferencia variedades de Streptococcus pyogenes en
streptococcus beta hemolíticos de streptococcus alfa hemolíticos y gama
hemolítica.

7
Agar salmonella-shigella tiene lactosa y un indicador de pH que permite
diferenciar las colonias de bacterias fermentadoras de este disacárido

Fig. 4

LABORATORIO
Materiales y reactivos
4 cajas Petri Cofia
Matraz Desinfectante
Tubos de ensaye Algodón
Pisetas Cinta para etiquetar
Pipetas Cubre bocas
Mechero Agar
Jeringas Pancha para calentar
Guantes- Gasas- Papel destraza Agua destilada
Tabla 1. Materiales y reactivos

Fig. 5

Preparación de medio de cultivo

En la actualidad la mayoría de los medios de cultivos se encuentran
comercializados normalmente bajo la forma de liofilizados a lo que es preciso
rehidratar. En estos casos la preparación de medio de cultivo se reduce
sencillamente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua
8
destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termo-
lavables se esterilizan por filtración y se añade el resto de los componentes
después de que estos hayan sido previamente esterilizados en una autoclave
y enfriados a temperatura ambiente o a 40 o 50 ºC si se trata de medios con
agar.
Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes
adecuados tubos o matraces si es un medio sólido y sea de distribuir en tubos
o en matraces será necesario difundir el agar en un baño maría, una vez
fundido y homogenizado se distribuye en caliente en los tubos o matraces se
tapa y se esteriliza en una autoclave. Una vez finalizada la esterilización los
medios se dejaran enfriar a temperatura ambiente y en caso de medios solidos
contenidos en tubos se deberán en su caso inclinarse para que al solidificarse
adopte la forma del agar inclinado en otro caso las cajas Petri se preparar
vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ella y en un ambiente aséptico
por ejemplo cerca del mechero es conveniente homogenizar el medio en el
transcurso de la operación para evitar que el agar sedimente en el fondo del
recipiente y se distribuya por igual en toda la placa.
Los caldos y medios solidos pueden conservarse una vez esterilizados a
temperatura ambiente para así reducir su deshidratación y el consiguiente
cambio en las concentraciones de sus componentes es preferible conservarlos
a 4ºC.

Fig. 6

Fig. 7
9
METODOLOGIA
1. Esterilizar el material que utilizaremos a baño maría (autoclave)
mientras este proceso se realiza se desinfectara el área de trabajo en
el cual se aplicara la técnica de arrastre con alcohol y algodón.
2. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la
inoculación, la adición del medio de cultivo y homogenización se pueda
realizar cómoda y libremente, marcar las cajas en las tapas con sus
datos previamente a su inoculación
3. Preparar nuestro medio de cultivo.
4. Dejamos reposar unos minutos donde no se contaminen nuestras
muestras deben estar tibio para poder vaciarlo y se tapa.
5. Lo destapamos con la técnica de dedos y con la mano izquierda se
agarra nuestra caja de Petri de forma que solo se abra un extremo para
poder realizar el vaciado todo esto sin que entre ningún contaminante
en la muestra.
6. Tomar la muestra de los tubos de ensaye con una pipeta y re procede
a destapar la caja con la técnica de dedos, se vierte la muestra en el
medio se debe cuidar el no tocar las paredes y homogenizar.
7. Se deja reportar unos minutos a temperatura ambiente y esperar a que
se solidifique o también se puede meter a un refrigerador para que este
proceso sea más rápido.

Fig. 8. Diagrama de flujo de la metodología

10
 Fig. 9

Fig. 10

Fig. 11

Fig. 12

Fig. 13

11
RESULTADOS

Fig. 14. Resultado de

cultivo de bacterias a 10^-4
Ya que solo fue una práctica para aprender la técnica de vaciado, podemos
observar que los resultados no fueron los esperados ya que se observa mucha
contaminación en la muestra y no se pueden apreciar adecuadamente las
colonias o bacterias que se contemplaban en esta práctica. Sin embargo, se
observó un leve crecimiento de bacterias en una de las cajas Petri. Pudimos
obtener el conocimiento de esta técnica para el después realizarlo de una
manera más cuidadosa y adecuada.

10^-4

Fig. 15 Fig. 17
Fig. 16

12
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Interpretación de los resultados:
A las 24 horas de haber realizado el vaciado en placa se observó crecimiento
de bacterias en la parte superior derecha de la caja Petri con disolución 10^-4.
Cabe destacar que se contabilizo un total de 35 colonias.
Comparación con los resultados teóricos: Distintas han sido las estrategias
para contabilizar a los microorganismos cultivables en muestras ambientales y
de laboratorio; las cuales presentan ventajas y desventajas. El conteo de
bacterias en esta práctica se realizó mediante el método del Número Más
Probable (NPM), éste es útil para contabilizar bacterias que son difíciles de
aislar de una muestra, pero que pueden ser detectadas por la actividad de
alguna característica metabólica.

CONCLUSIONES
Es importante tomar en cuenta que la temperatura de esterilización sea la
adecuada según lo planteado por la teoría proporcionada por el profesor.
Debido al mal manejo de los materiales y el poco tiempo disponible para
realizar la práctica se obtuvieron resultados diferentes a los teóricos, pues no
todas las cajas Petri solidificaron, a excepción de la que contenía la disolución
10^-4, en la cual se observó crecimiento en la parte superior derecha, con un
total de 35 colonias.

13
BIBLIOGRAFÍA
Referencias de libros:
• PRESCOTT et al. “Microbiología. 5ª Edición. Editorial Mc. Graw
• Hill Interamericana. 2004.
• INGRAHAM AND INGRAHAM. “Introducción a la
• Microbiología”. Editorial Reverté. 1998.

Referencias de artículos:
• Métodos económicos para la cuantificación de microorganismos
• December 2016
• DOI:10.5281/zenodo.5525235
• In book: Instituciones de Educación Superior. La labor investigadora e
innovadora en México (pp.67-82)Edition: 1Chapter: 5Publisher: Science
Associated Editors L.L.C. SCASED

Referencias de sitios web:

• https://www.google.com/search?q=vasiado+en+placa&sxsrf=AOaemvJ
yp3AAjTLKVZe6ZkgidCF6U5kaDw%3A1635184957036&ei=PfF2YfzM
AcKuqtsPrJmv8AY&ved=0ahUKEwi834XUkubzAhVCl2oFHazMC24Q4
dUDCA4&uact=5&oq=vasiado+en+placa&gs_lcp=Cgdnd3Mtd2l6EANK
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14
ANEXOS

Fig. 18 Diagrama de flujo del método de siembra en

placa por vaciado.

Fig. 19 Esquema de trabajo para dilución de las muestras

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