TECNOLOGÍA DEL ADN

RECOMBINANTE,
SISTEMAS DE EXPRESIÓN
DE PROTEÍNAS
EUCARIOTAS
 Price Per Gram

Bovine Growth Hormone $14

Gold $48

The Value Insulin $60

of Proteins Growth Hormone $227,000

Granulocyte Colony $1,357,000

Stimulating Factor

*Prices in 2011 US Dollars

 • Las células bacterianas son extremadamente
útiles para la traducción activa de proteínas de
mamíferos relativamente poco complejas.
¿SE PUEDEN • La expresión de genes de mamíferos en
bacterias necesita resolver los problemas
EXPRESAR siguientes:
PROTEÍNAS 1. Las proteínas producidas por estos métodos no
presentan modificaciones post-traduccionales.
HUMANAS O 2. los promotores eucariotas no son reconocidos por
las ARN polimerasas bacterianas.
DE 3. los genes eucariotas contienen intrones.
4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo
MAMÍFEROS traducidos por los ribosomas bacterianos.
EN 5. las proteínas presentes en grandes cantidades en
las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles
BACTERIAS? 6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas
como cuerpos extraños por las proteasas de la
bacteria y ser degradadas.
 Expression Choices

Cell type: E. coli Yeast Mammalian

CHO
 Expression Choices
Parameter Bacteria Yeast Mammalian

Contamination risk Low Low High

Cost of growth Low Low High

medium

Product titer High High Low

(concentration)

Folding Sometimes Probably Yes

Glycosylation No Yes, but different pattern Full

Relative ease to grow Easy Easy Difficult

Relative ease of Difficult Easy Easy

recovery
Deposition of product Intracellular Intracellular or extracellular Extracellular

Product Intracellular Often secreted into media Secreted

PROTEIN: USED IN THE Cell
TREATMENT OF: Production
Insulin Diabetes E. coli
Human growth hormone Growth disorders E. coli
Granulocyte colony stimulating factor Cancers E. Coli
Erythropoietin Anemia CHO cells
Tissue plasminogen activator Heart attack CHO cells
Hepatitis B virus vaccine Vaccination Yeast
Human papillomavirus vaccine Vaccination Yeast
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Regiones reguladoras

• La unión del promotor es muy

diferente en las bacterias en
comparación con los eucariotas. En
las bacterias, la ARN polimerasa
central requiere un factor sigma
asociado para el reconocimiento y la
unión del promotor. Por otro lado, el
proceso en eucariotas es mucho más
complejo. Los eucariotas requieren
un mínimo de siete factores de
transcripción para que la ARN
polimerasa II (una ARN polimerasa
específica de eucariotas) se una a un
promotor. La transcripción está
estrictamente controlada tanto en
bacterias como en eucariotas. Los
promotores están controlados por
varias secuencias reguladoras de ADN
que incluyen potenciadores,
elementos de contorno, aislantes y
silenciadores.
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA
• Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el
plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas
eucarióticos.
• Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha
integrado a uno ó más cromosomas eucariotas.

CO-TRANSFECCION
La co-transfección es la transfección simultánea de varios
plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la
transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se co-
transfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una
reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha
sido bien transfectado.
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
 Recovery
• Separation of protein from
other molecules
Purification
• Separation of the protein of
interest from other proteins

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Chromatography
Basics
• Mobile phase (solvent and the molecules to be
separated)

• Stationary phase (through which the mobile

phase travels)
• paper (in paper chromatography)
• glass, resin, or ceramic beads (in column
chromatography)

• Molecules travel through the stationary phase at

different rates because of their chemistry.
Types of Column
Chromatography

• Ion Exchange (protein charge)

• Size Exclusion (separates on size)

• Hydrophobic Interaction (hydrophobicity)

• Affinity:
• Protein A
• His-tagged
• Biotin
 His tags
• His tags are typically a
series of 6 histidines
• His tag and column interaction
added
Histidine
to the C or N terminus of a
-OOC N3H+ recombinant Ni protein

Resin

His-tagged
Recombinant
Protein

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 Microprojectile bombardment:
shooting DNA-coated tungsten
Methods of or gold particles into plant cells.
production
of Electroporation: use of a short
Transgenic burst of electricity to put the
plants DNA into cells.

Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation
A. tumefaciens
• A. tumefaciens is a soil
bacterium responsible
for crown gall disease
of dicotyledonous
plants. The galls or
tumors are formed at
the junction between
the root and the stem
of infected plants.
• The ability of A. tumefaciens to induce crown galls in plants
is controlled by genetic information carried on Ti plasmid
(tumor-inducing plasmid).
• Ti plasmid has two components the T-DNA (Transferred
DNA) and
• the vir region, which are essential for the transformation of
plant cells.
• During the transformation process, the T-DNA is excised
from the Ti plasmid, transferred to a plant cell, and
integrated into the DNA of the plant cell.
• The integration of the T-DNA occurs at random
chromosomal sites. In some cases, multiple T-DNA
integration events occur in the same cell.