Laboratorio de Biología Molecular – Biología UPTC

Grupo de lab​:

Integrantes (Nombre y código): R​oberto Muñoz Sotelo 201721760​, ​Sandra Lucía Góngora
Monzón 201721854, Julieth Andrea Niño Mendoza 201524044, Edith Johana Pinilla Gil
201721913

RECONOCIMIENTO E INFORMACIÓN DEL USO DE EQUIPOS Y MATERIAL DE

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

1.​ O
​ BJETIVOS

·​ ​Reconocer los diferentes equipos e insumos utilizados en el laboratorio de biología molecular

·​ ​Identificar el uso de diferentes equipos del laboratorio de biología molecular

·​ ​Adquirir destrezas para la preparación de soluciones.

​3.​ P
​ ROCEDIMIENTO

3.1.​ P
​ ARTE 1:

· ​3.3. ​A
partir de la información vista en los videos y por consulta de otras fuentes, conteste el
siguiente cuestionario:

a.​ ¿​ Qué son las enzimas de restricción y cuales son sus principales usos?

Las enzimas de restricción, nucleasas de restricción o endonucleasas. Son proteínas que se

unen al ADN previamente aisladas de una bacteria que corta el ADN de doble cadena en
diferentes secuencias específicas. ​Además hidroliza un enlace fosfodiéster en cada hebra,
siempre en la misma posición. Cada enzima posee una secuencia de restricción (diana). ​De esta
manera genera fragmentos de ADN que se conocen como fragmentos de restricción ​útiles
en la clonación celular o acelular, el análisis del DNA, en elaboración de mapas físicos de
restricción la detección de polimorfismos.

Las enzimas de restricción son usadas generalmente en laboratorios de biología molecular en PCR,
creación de sondas para hibridación, laboratorios de secuenciación de ADN, ingeniería genética y
en procesos de clonación.

b. En el comercio existen diferentes tipos de DNA polimerasa (ejm: ​Taq polymerase​, ​High fidelity
polymerase)​ que se usan en los laboratorios de biología molecular. Una diferencia entre la ​Taq
 polymerase ​convencional y la ​High fidelity polymerase es que esta última tiene una actividad
exonucleasa 3’​à ​5’ mientras la ​Taq polymerase ​no. ¿Qué implicación tiene esta diferencia?

​La enzima cataliza la síntesis de ADN 5 '→ 3', no tiene actividad de exonucleasa (corrección de
prueba) detectable 3 '→ 5'. Esto quiere decir que la Taq plymerase no reconoce los errores y
realiza la replicación con los nucleótidos incorrectos y esto puede generar mutaciones en la hebra.

c. ¿Qué son los dNTPs?

Los desoxirribonucleótidos trifosfato son nucleótidos que sirven para generar nuevas cadenas de
ADN.

d. En los siguientes enlaces encontrará las presentaciones comerciales de dNPTs que se pueden
encontrar en el mercado:

mio ​I.

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10297018?SID=srch-srp-10297018#/102970
18?SID=srch-srp-10297018

​II.

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18427088?SID=srch-srp-18427088#/184270
88?SID=srch-srp-18427088

Ingrese a estos dos enlaces, y determine las diferencias entre las presentaciones de dNTP que se
ofrecen comercialmente.

Presentación comercial de dNTP Diferencias

I ● Concentración de cada nucleótido de

100 mM .
● Mezcla en agua purificada.
● Concentración de 100 mM.
● Cantidad 4x250​μL.

II ● Concentración de cada nucleótido de

10 mM.
● Mezcla en Tris- HCl 0,6 mM.
● Concentración de 40mM.
● Cantidad 1ml.

e. ¿Qué diferencias hay entre una micropipeta manual y una electrónica (o digital)?
En las micropipetas manuales el volumen a aspirar se fija girando un botón que se encuentra en su
parte superior el cual está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen. Las
micropipetas electrónicas son más precisas reduciendo la posibilidad de un error humano ya que
su sistema es digital.

3​ .5. ​PARTE 2: A partir de la información vista en el video y por consulta de otras fuentes,
conteste el siguiente cuestionario.

a. El ​Buffer TAE (Tris-acetato-EDTA) es una solución compuesta de Tris-base, ácido acético glacial
y EDTA. Este es comúnmente usado para la separación de DNA o RNA utilizando electroforesis
en gel de agarosa. La solución ​stock tiene una concentración de 50X y se prepara de la siguiente
manera:

Reactivo Peso o volumen [ ] final

Tris-base 242 g 2M

Ácido acético glacial 57.1 ml [100%] 1M

EDTA 18.61 g 50 mM

Valores para un litro. El pH se ajusta hasta alcanzar los 8.6.

La solución de trabajo es de 1X. En el laboratorio le solicitan que a partir del ​stock de 50X prepare
dos soluciones de trabajo. La primera es de un litro y la segunda es de 250 ml. Realice los cálculos
para preparar estas dos soluciones.

ml de solución ​stock ml de agua desionizada

1 L [1X] 20ml 980ml

250 ml [1X] 8ml 242 ml

b. Los geles de agarosa se utilizan para separar ácidos nucleicos. Estos se preparan mezclando
agarosa (polisacárido formado por galactosas que se extrae de las algas de los géneros ​Gellidium y
Gracillaria​) y un ​Buffer que puede ser TAE o TBE. La agarosa es soluble en agua a temperaturas
superiores a los 65 °C, a temperatura ambiente se solidifica formando una matriz porosa por
donde los ácidos nucleicos migran durante la electroforesis. El tamaño del poro varía conforme se
aumenta la cantidad de agarosa. Fragmentos de DNA de más de 1 a 1.5 Kb (kilobases, equivalente
a 1000 - 1500 pares de bases (pb)) se resuelven bien en geles de 0.7% a 1%. Fragmentos de 800 a
500 pb se resuelven bien en geles de 1.5% a 2%, mientras fragmentos menores a los 500 pb
podrían requerir geles más concentrados (hasta del 3%).

Usted realizó una extracción de DNA y desea saber si su procedimiento fue exitoso. Para esto correrá
la muestra en un gel de agarosa. Realice los cálculos para preparar un gel de 25 ml al 0.7%
(Peso/volumen)

% del gel gramos de agarosa ml de TAE

0.7 0,175 g 25 ml

Posteriormente realizó un procedimiento con enzimas de restricción (proteínas que cortan los ácidos
nucleicos) de un fragmento de DNA de 2000 pb. Los fragmentos generados varían entre los 200 pb y
las 700 pb. Usted debe realizar un gel de agarosa para separar estos fragmentos. Determine el
porcentaje del gel que considere más apropiado para esta tarea, y realice los cálculos para preparar un
gel de 50 ml al porcentaje seleccionado.

% del gel gramos de agarosa ml de TAE

3 0,15 g 50 ml

c. El medio SOB (del inglés ​Super Optimal Broth - caldo súper óptimo) es un medio de crecimiento
rico en nutrientes utilizado para el cultivo de bacterias, comúnmente utilizado para generar
mayores eficiencias en protocolos de transformación con plásmidos. Un litro de medio SOB se
prepara de la siguiente manera:
 Tris-base 20 g

Extracto de levadura 5g

NaCl 0.5 g

Llevar a 1000 ml con agua destilada

Una vez disueltos todos lo componentes, este se lleva a la autoclave. Después de enfriarse, y en
cabina, se agregan 10 ml de MgCl​2 [1M] y 10 ml de MgSO​4 [1M]. Finalmente el medio SOB se
utiliza para preparar el medio SOC, al adicionar D-Glucosa a una concentración final de 0.4%.

En el laboratorio se realizará una trasformación con un plásmido en ​E. coli​. Le piden preparar 15 ml
de MgCl​2 [1M], 15 ml de MgSO​4 [1M] y 100 ml de D-Glucosa al 20%. Realice los cálculos para
preparar estas soluciones. (La presentación del MgCl​2​, MgSO​4​ y de la D-Glucosa es liofilizada)

Solución [ ] final gramos de soluto ml de agua destilada

MgCl2​ 1M 1,43g 15 ml

MgSO​4 1M 1,80g 15 ml

D-Glucosa 20% 20g 100 ml

Posteriormente le piden preparar medio SOB. Ya que este se contamina fácilmente, le solicitan sólo
preparar 50 ml de este medio. Realice los cálculos para preparar 50 ml de SOB

Tris-base 1g

Extracto de levadura 0,25 g

 NaCl 0,025 g

Llevar a 50 ml con agua destilada

¿Cuantos ml de D-glucosa al 20% debe adicionar a la solución de SOB que acaba de preparar (50ml),
para preparar SOC?

D-glucosa al 20% ml a adicionar

10 g

d. Los dNTPs (del inglés, ​Deoxynucleotidos Triphosphates)​ son los nucleótidos en su forma
trifosfato. Estos son necesarios para protocolos de PCR. Los dNTPs vienen en diferentes
presentaciones y concentraciones. En el laboratorio se compraron dNTPs individualmente (dATP
(Adenina); dCTP (Citosina), dGTP (Guanina), dTTP (Timina)), cada uno a una concentración de
100 mM. Para el protocolo de PCR le solicitan preparar un Mix (mezcla) de los 4 dNTPs, los
cuales deben quedar a una concentración de 1.25 mM cada uno. Realice los cálculos para preparar
100 μL de dNTPs Mix a la concentración indicada.

Reactivo Volumen μL

dATP 1,25

dCTP 1,25

dGTP 1,25

dTTP 1,25

Agua libre de nucleasas 95

e. En esta oportunidad el laboratorio compró un vial de dNTPs Mix (mezcla de los 4 dNTPs) con
una concentración de 10 mM. Para un protocolo de PCR le solicitan preparar una solución de 50
μL de dNTPs a una concentración de 5mM. Realice los cálculos para preparar esta solución.

mililitros de solucion mix μL Volumen μL

agua libre de
nucleasas

25 25

5.​ R
​ EFERENCIAS

Doudna JA, Charpentier E. (2014). Genome editing. The new frontier of genome
engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346(6213):1258096.

Flowers, L.O. (2011). Investigating the Effectiveness of Virtual Laboratories in an

Undergraduate Biology Course. The Journal of Human Resource and Adult Learning.
7(2): 110-116.

Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase

Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in
trans. The Plant Cell. 2 (4): 279–289.

Ronaghi M.; Karamohamed S.; Pettersson B.; Uhlen M.; Nyren P. (1996). Real-time DNA
sequencing using detection of pyrophosphate release. Analytical Biochemistry. 242 (1):
84–9.
Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H.
(1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science 239 (4839): 487-491.

Sanger F; Nicklen S; Coulson AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463–7.

Špernjak A; Šorgo A (2018). Differences in acquired knowledge and attitudes achieved with
traditional, computer-supported and virtual laboratory biology laboratory exercises.
Journal of Biological Education 52 (2): 206-220

Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by
gel electrophoresis, J Mol Biol., 98:503-517.

Mills Verne M. (1981). The Investigative Laboratory in Introductory Biology Courses: A

Practical Approach. The American Biology Teacher; 43 (7): 364–367.