Infertilidad debida a flagelos espermáticos defectuosos

causados por una deleción intrónica en DNAH17 que

perturba el empalme
Adela Noskova´ ,1,† Maya Hiltpold,1,† Fredi Janett,2 Thomas Echtermann,3 Zih-Hua Fang ,1 Xaver Sidler,3
Christin Selige,4 Andreas Hofer,4 Stefan Neuenschwander,5 and Hubert Pausch 1,*

1Animal Genomics, Institute of Agricultural Sciences, ETH Zu¨ rich, 8315 Lindau, Switzerland
2Clinic of Reproductive Medicine, Vetsuisse Faculty, University of Zurich, 8057 Zurich, Switzerland
3Division of Swine Medicine, Vetsuisse Faculty, University of Zurich, 8057 Zurich, Switzerland
4SUISAG, 6204 Sempach, Switzerland
5Animal Genetics, Institute of Agricultural Science, ETH Zu¨ rich, 8092 Zu¨ rich, Switzerland †These authors
contributed equally to this work.
*Corresponding author: Animal Genomics, Institute of Agricultural Sciences, ETH Zu¨ rich, EHB E21,
Eschikon 27, 8315 Lindau, Switzerland.
hubert.pausch@usys.ethz.ch

Resumen
La inseminación artificial en la cría de cerdos (Sus scrofa domesticus) implica la
evaluación de la calidad del semen de los verracos reproductores. Los eyaculados que
cumplen unos requisitos de calidad predefinidos se procesan, se diluyen y se utilizan para
las inseminaciones. En poco tiempo, en un centro de recogida de semen se detectaron ocho
verracos blancos grandes suizos que producían esperma inmóvil y presentaban múltiples
anomalías morfológicas de los flagelos del esperma. Los ocho verracos eran consanguíneos
de un ancestro común, lo que sugiere que el nuevo defecto de los flagelos espermáticos es
un rasgo recesivo. Los cortes transversales de microscopía electrónica de transmisión
revelaron que los espermatozoides inmóviles tenían axonemas flagelares desorganizados.
Las pruebas de asociación basadas en el haplotipo, que incluían genotipos derivados de
microarrays en 41.094 SNPs de seis verracos afectados y 100 fértiles, arrojaron una fuerte
asociación (P¼4,22 _ 10_15) en el cromosoma 12. El mapeo de autocigosidad nos permitió
localizar la mutación causal en un haplotipo de 1,11Mb situado entre 3.473.632 y
4.587.759bp. El haplotipo lleva una deleción intrónica de 13 pb (Chr12:3.556.401-
3.556.414 pb) que es compatible con la herencia recesiva. La deleción de 13 pb extirpa el
tracto de polipirimidina aguas arriba del exón 56 de DNAH17 (XM_021066525.1: c.8510-
17_8510 5del) que codifica la cadena pesada axonemal de dineína 17. El análisis del
transcriptoma de los testículos de dos verracos afectados reveló que la pérdida del tracto de
polipirimidina provoca la omisión del exón, lo que resulta en la pérdida en el marco de 89
aminoácidos de DNAH17. La alteración de DNAH17 perjudica el ensamblaje del axonema
flagelar y se manifiesta en múltiples anomalías morfológicas de los flagelos espermáticos.
El análisis directo del gen puede ser implementado ahora para monitorear el alelo
defectuoso en la población suiza de Large White y prevenir la frecuente manifestación de
un desorden de cola de esperma esterilizante en los verracos de cría.

Introducción
La inseminación artificial es el método más frecuente de reproducción en el ganado
porcino. El semen de los verracos reproductores se recoge una o dos veces por semana en
los centros de recogida de semen. Los rasgos que se miden rutinariamente en todos los
eyaculados incluyen el volumen del eyaculado, la concentración de esperma, la motilidad y
la morfología. Sólo los eyaculados que cumplen los requisitos de calidad predefinidos se
procesan, se diluyen y se utilizan para las inseminaciones (Colenbrander et al. 1993; Holt et
al. 1997; Broekhuijse et al. 2011). La calidad del semen y el éxito de la inseminación varían
dentro y entre los verracos debido a los efectos ambientales, ambientales permanentes y
genéticos (Marques et al. 2017). El acceso a los datos longitudinales sobre los rasgos
estandarizados del semen para grandes cohortes de machos es único para las poblaciones
ganaderas (Thibier y Wagner 2002; Knox 2016). Los verracos adecuados para la cría se
seleccionan en función de la calidad del semen y de las predicciones genómicas derivadas
de los genotipos densos derivados de los microarrays de SNP. Los genotipos densos y las
mediciones repetidas de los rasgos del semen de miles de machos son requisitos previos
para desentrañar la arquitectura genética de la fertilidad masculina.
El análisis genético exhaustivo de la fertilidad masculina es un reto en la mayoría de las
especies distintas del ganado. Por ejemplo, el análisis de la fertilidad masculina en los seres
humanos suele basarse en fenotipos indirectos correlacionados, como el tamaño de la
familia y la tasa de natalidad (Kosova et al. 2012), pequeñas cohortes de machos (Sato et al.
2018; Sato et al. 2020) y observaciones de una sola eyaculación por individuo (Rahban et
al. 2019). La calidad del semen de los verracos está positivamente correlacionada con el
éxito de la inseminación y el tamaño de la camada (Holt et al. 1997). Los rasgos del semen
que se miden en los centros de recogida de semen tienen una heredabilidad media (Marques
et al. 2017). Por lo tanto, son variables de respuesta muy adecuadas en los estudios de
asociación de todo el genoma para el rendimiento reproductivo de los machos (Diniz et al.
2014; Hiltpold et al. 2020). Los estudios de asociación de todo el genoma sobre la fertilidad
masculina llevados a cabo en el ganado descubrieron nuevas asociaciones fenotipo-
genotipo que mejoraron nuestra comprensión biológica de la fertilización en los mamíferos
(Pausch et al. 2014; Hiltpold et al. 2020; Lamas-Toranzo et al. 2020; Ni et al. 2020; Noda
et al. 2020; Noskova et al. 2020).
Los eyaculados de cientos de verracos se evalúan cada año en los centros de recogida de
semen como servicio a la industria de la cría de cerdos. Este rico recurso de registros de
calidad del semen facilita la investigación de los defectos espermáticos que se producen
esporádicamente utilizando pruebas de asociación de casos y controles (Sironen et al. 2006;
Sironen et al. 2011; Noskova et al. 2020). Una vez que se hayan identificado las variantes
causantes, se podrán implementar pruebas genéticas directas y estrategias de apareamiento
basadas en el genoma para evitar el nacimiento de machos infértiles. Además, el
descubrimiento de genes que albergan alelos patógenos que comprometen la fertilidad de
los machos es importante para mejorar el rendimiento diagnóstico de las pruebas genéticas
también en especies distintas del ganado (Xavier et al. 2020).
Aquí investigamos un defecto autosómico recesivo de la cola de los espermatozoides de los
verracos Large White suizos. Utilizando pruebas de asociación de todo el genoma,
mapeamos el trastorno en el cromosoma 12 porcino. El análisis de los datos de
secuenciación de ADN y ARN de todo el genoma de los verracos afectados reveló que la
pérdida de un tracto intrónico de polipirimidina del ADNH17 porcino es causal de las
anomalías morfológicas de los flagelos del esperma.

Material y métodos

Aprobación ética y consentimiento de participación

Los técnicos de laboratorio recogieron muestras de semen de cinco verracos reproductores
en un centro de recogida de semen autorizado como parte de su servicio habitual a la
industria suiza de cría de cerdos. Las muestras de semen de tres verracos se extrajeron del
epidídimo post mortem. Los testículos se recogieron tras el sacrificio regular en un
matadero autorizado. Nuestro estudio fue aprobado por la oficina veterinaria del Cantón de
Zúrich (permiso de experimentación animal ZH 070/20).

Consentimiento para la publicación

SUISAG, el centro suizo de cría y competencia porcina, dio su consentimiento por escrito a
los análisis realizados y aceptó publicar los resultados y datos.

Animales
En nuestro estudio se consideraron ocho verracos Large White suizos con un defecto en la
cola de los espermatozoides (Tabla 1). Cinco de ellos fueron detectados en el centro de
recogida de semen de SUISAG porque sus eyaculados contenían espermatozoides
inmóviles que presentaban múltiples anomalías morfológicas de los flagelos. Como los
cinco verracos estaban sanos y el análisis del pedigrí indicaba que eran consanguíneos de
un ancestro común, se sospechó de la herencia recesiva del defecto de la cola de los
espermatozoides. Se realizó un apareamiento entre dos animales presuntamente portadores
en el campo para evaluar las manifestaciones fenotípicas en su descendencia. La cerda
preñada fue adquirida y mantenida en el establo de investigación de la División de
Medicina Porcina de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zurich. La cerda parió
una camada con once lechones (ocho hembras y tres machos). Uno de los lechones macho
(Boar_1246) murió a la edad de 200 días debido a un síndrome intestinal hemorrágico
(Grahofer et al. 2017). Los otros dos verracos machos (Boar_1249, Boar_1254) fueron
sacrificados a la edad de 17 meses en un matadero habitual. Los tres lechones machos del
apareamiento de los animales sospechosos de ser portadores expresaron el defecto de la
cola de los espermatozoides (véase más adelante). Los registros del pedigrí se analizaron
utilizando el paquete de software PYPEDAL (Cole 2007).

Fenotipos
Las muestras de semen de cinco verracos reproductores fueron evaluadas macro y
microscópicamente por técnicos de laboratorio como parte del servicio rutinario de
SUISAG a la industria suiza de cría de cerdos. Los espermatozoides de tres verracos
(verraco_1246, verraco_1249, verraco_1254) se extrajeron del epidídimo post mortem. Las
muestras de semen de un verraco fértil fueron proporcionadas por SUISAG. La
concentración de esperma, el recuento total de espermatozoides y la motilidad espermática
se determinaron con un sistema IVOS II CASA (Hamilton Thorne Inc. Beverly, EE.UU.)
utilizando portaobjetos de 2 cámaras de Leja (Leja, Nieuw- Vennep, Países Bajos). Para el
examen morfológico, el semen se fijó en una solución salina tamponada con formol
(Na2HPO4 4,93 g, KH2PO4 2,54 g, formaldehído al 38% 125 ml, NaCl 5,41 g, agua
destilada c.s. 1000 ml) y se prepararon frotis (Hancock 1956). A continuación, se evaluaron
al menos 200 espermatozoides mediante microscopía de contraste de fase por inmersión en
aceite (Olympus BX50, UplanF1 100_/1.30, Olympus, Wallisellen, Suiza).
La evaluación de la viabilidad de los espermatozoides se realizó mediante el método de
tinción con eosinnigrosina (Blom 1950). En los portaobjetos teñidos se evaluaron al menos
200 espermatozoides bajo inmersión en aceite en un microscopio de luz (Olympus BX50,
UplanF1 100_/1.30, Olympus, Wallisellen). Para preparar los espermatozoides extraídos
del epidídimo para la microscopía electrónica de transmisión (TEM), las muestras se
lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y posteriormente se
centrifugaron a 300 g. Una muestra de semen de un verraco no afectado se centrifugó
primero a 300 g para aumentar la concentración de espermatozoides y luego se lavó en
PBS. El pellet se fijó con un volumen igual de glutaraldehído al 6%, se resuspendió
suavemente y se centrifugó a 6000 g. Después de eliminar el sobrenadante, los
espermatozoides se fijaron por segunda vez con glutaraldehído al 3% y finalmente se
pelletearon a 6000 g.

Los gránulos se lavaron tres veces en PBS, se posfijaron en tetróxido de osmio al 1%, se
lavaron en ddH2O, se tiñeron con acetato de uranilo al 1%, se deshidrataron en series
graduadas de etanol (25, 50, 75, 90 y 100%) y se incrustaron en resina epoxi a través de
concentraciones crecientes (25, 50, 75 y 100%) utilizando el procesador de tejidos PELCO
Biowaveþ, y luego se curaron a 60 _C durante 3 días. Los bloques incrustados se
seccionaron utilizando el microtomo Leica FC6 y una cuchilla de diamante DIATOME con
un ángulo de 45_ en secciones de 60nm y se montaron en rejillas de cobre Quantifoil con
películas de carbono formvar. Las secciones se tiñeron posteriormente con acetato de
uranilo al 2% seguido de citrato de plomo. Las rejillas se visualizaron con el microscopio
electrónico FEI Morgagni 268 operado a 100 kV con 20 k de aumento.

Genotipos e inferencia de haplotipos

Los genotipos de 9955 verracos Large White (incluidos seis verracos con el defecto de la
cola de los espermatozoides) y cerdas fueron proporcionados por SUISAG. Todos los
cerdos fueron genotipados utilizando los chips Illumina PorcineSNP60 Bead, que
comprendían entre 62.163 y 68.528 SNPs. Sólo se consideraron los SNPs autosómicos. Las
posiciones físicas de los SNPs correspondían al ensamblaje Sscrofa11.1- del genoma
porcino (Warr et al. 2020). El control de calidad de los genotipos se llevó a cabo mediante
el software PLINK (versión 1.9) (Chang et al. 2015). Los animales y los SNPs con más de
un 10% de genotipos perdidos fueron excluidos de los análisis posteriores. Se eliminaron
los SNPs con frecuencia alélica menor (MAF) inferior a 0,005 y los SNPs para los que la
distribución de genotipos observada se desviaba significativamente (P<0,00001) de las
proporciones de Hardy- Weinberg. Tras el control de calidad, nuestro conjunto de datos
contenía 9848 cerdos y genotipos en 43.254 SNPs autosómicos.
Los genotipos esporádicamente perdidos se imputaron y los haplotipos se infirieron
utilizando 12 iteraciones del algoritmo de desfase implementado en el software BEAGLE
(versión 5.0) (Browning et al. 2018), asumiendo un tamaño de población efectivo de 500,
mientras que todos los demás parámetros se establecieron en valores predeterminados.

Pruebas de asociación de todo el genoma

Seis verracos que produjeron esperma con múltiples anomalías morfológicas de los flagelos
fueron considerados como grupo de casos para un estudio de asociación de todo el genoma.
El grupo de control estaba formado por 100 verracos seleccionados al azar que producían
esperma normal y eran fértiles, es decir, cada uno de ellos engendró al menos una camada
en la unidad de cría de Swiss Large White. Se comprobó la asociación entre el estado de
afección de los verracos y 41.094 SNPs autosómicos para los que la frecuencia del alelo
menor era superior al 5%. Las pruebas de asociación de casos y controles basadas en un
único marcador se realizaron mediante las pruebas exactas de Fisher de asociación alélica
implementadas en el software PLINK (versión 1.9) (Chang et al. 2015). Para tener en
cuenta la estratificación de la población, también realizamos un estudio de asociación
basado en modelos lineales mixtos basados en SNP utilizando el método mlma del software
GCTA (versión 1.92.1) (Yang et al. 2011).
Se implementó un modelo de asociación lineal basado en haplotipos como se describe en
(Venhoranta et al. 2014) y (Hiltpold et al. 2020). Desplazamos una ventana deslizante
consistente en 25 SNPs contiguos correspondientes a una longitud media de haplotipos de
1,2860,65Mb a lo largo de los cromosomas en pasos de 5 SNPs. Dentro de cada una de las
8583 ventanas deslizantes consideradas, se comprobó la asociación de entre 1 y 10
haplotipos que tenían una frecuencia superior al 5% con el defecto de la cola de los
espermatozoides utilizando el modelo lineal y ¼ l þP30 j ¼ 1 ajPCj þ bHT þ e, donde y es
un vector de fenotipos (1-fértil, 2-infértil), l es el intercepto, PCj son los 30 componentes
principales principales de una matriz de relación genómica construida en base a los
genotipos de 43.254 SNPs autosómicos utilizando el software PLINK, a y b son los efectos
de los componentes principales y el haplotipo (HT) probado, respectivamente, y e es un
vector de residuos que se supone que se distribuye normalmente. En total, se analizaron
47.685 haplotipos en busca de su asociación con el defecto de la cola de los
espermatozoides.
Los SNPs y haplotipos que superaron el umbral de significación corregido por Bonferroni
(PSNP¼1,22 x 10_6, PHAPLO¼1,05 x 10_6) se consideraron significativamente
asociados. Los factores de inflación de los estadísticos de la prueba se calcularon utilizando
la función estlambda() del paquete GENABEL R (Aulchenko et al. 2007).

Análisis de los genes candidatos posicionales

La principal señal de asociación reveló un segmento de 1,11Mb de homocigosidad
extendida en el cromosoma 12. Los genes localizados dentro del segmento de
homocigosidad se obtuvieron de la anotación Refseq del genoma porcino (versión 106,
disponible en ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_mammalian/Su
s_scrofa/annotation_releases/106/GCF_000003025.6_Sscrofa11.1/GCF_000003025.6_Sscr
ofa11.1_genomic.gff.gz). Utilizando datos de secuenciación de ARN disponibles
públicamente (BioProject PRJNA506525, números de acceso de muestra SAMN10462191-
SAMN10462197) de (Robic et al. 2019), cuantificamos la abundancia de ARNm de los
genes candidatos posicionales en los testículos porcinos. Para ello, descargamos entre 47 y
58 millones de lecturas de secuenciación de extremo pareado (2 x 100 y 2 x 125 pb) que se
generaron a partir del ARN extraído del tejido testicular de siete verracos púberes de las
poblaciones europeas Pie' train y Pie' train x Large White. Las lecturas de secuenciación de
ARN se pseudoalinearon con un índice del transcriptoma porcino (Refseq versión 106) y se
cuantificó la abundancia de transcripciones utilizando el software KALLISTO (Bray et al.
2016). Se utilizó el paquete R TXIMPORT (Soneson et al. 2015) para agregar las
abundancias de los transcritos a nivel de genes.

Secuenciación del genoma completo y genotipado de variantes de secuencia

Secuenciamos cinco verracos suizos de raza blanca grande que produjeron espermatozoides
que presentaban múltiples anomalías morfológicas de los flagelos del esperma utilizando
lecturas de 2_150 pb de extremo pareado. Se prepararon bibliotecas de ADN Illumina
TruSeq libres de PCR con tamaños de inserción de 400 pb y se secuenciaron en un
instrumento Illumina NovaSeq6000. Se utilizó el software FASTP (Chen et al. 2018) para
eliminar las secuencias de adaptadores, las colas de poli-G y las lecturas que tenían una
calidad de escala de fase inferior a 15 para más del 15 % de las bases. Se alinearon entre
81.145.807 y 114.616.836 pares de lecturas filtradas con el ensamblaje Sscrofa11.1 del
genoma porcino utilizando el algoritmo MEM del software BWA (Li 2013) con la
configuración de parámetros por defecto. Marcamos los duplicados utilizando el conjunto
de herramientas PICARD (https://github. com/broadinstitute/picard) y clasificamos los
alineamientos por coordenadas utilizando SAMBAMBA (Tarasov et al. 2015). El número
de lecturas que cubren una posición se extrajo de los alineamientos utilizando el software
MOSDEPTH (versión 0.2.2) con la configuración de parámetros por defecto (Pedersen y
Quinlan 2018). La profundidad de lectura de secuenciación realizada en los cinco verracos
fue de 10,9 veces y osciló entre 8,9 y 12,5 veces.
Las variantes de secuencia (SNPs e Indels) de los cinco verracos secuenciados se
genotipificaron junto con 93 cerdos de diferentes razas para los que los datos de la
secuencia del genoma completo estaban disponibles en nuestra base de datos interna
utilizando el enfoque de llamada de variantes de múltiples muestras del GENOME
ANALYSIS TOOLKIT (GATK, versión 4.1.0; Depristo et al. 2011). Se filtraron las
variantes de la secuencia mediante un filtrado duro de acuerdo con las directrices de buenas
prácticas del GATK. Una descripción detallada de nuestro enfoque de descubrimiento y
filtrado de variantes guiado por referencias se describe en (Crysnanto et al. 2019). Las
consecuencias funcionales de los sitios polimórficos se predijeron según la anotación
Refseq (versión 106) del genoma porcino utilizando el software VARIANT EFFECT
PREDICTOR de Ensembl (McLaren et al. 2016) junto con el plugin SpliceRegion.pm
(https://github.com/ Ensembl/VEP_plugins/blob/release/101/SpliceRegion.pm).
Consideramos 82 cerdos con pedigrí conocido como grupo de control para el presente
estudio.

Identificación de variantes causales candidatas

Consideramos 14.806 SNPs y 3856 Indels que se detectaron dentro del segmento de
1,11Mb (entre 3.473.632 y 4.587.759 pb) de homocigosidad extendida en el cromosoma 12
como variantes causales candidatas posicionales. Para identificar variantes compatibles con
la herencia recesiva del trastorno de la cola de los espermatozoides, aplicamos una
estrategia de filtrado que tiene en cuenta los genotipos defectuosos y la infravaloración de
los genotipos heterocigotos debido a la relativamente baja cobertura de la secuenciación.
Específicamente, seleccionamos los alelos que tenían la siguiente frecuencia:
- 0,8 en cinco verracos afectados (al menos 8 de 10 alelos),
- 0,05 en 82 cerdos de control de diferentes razas (menos de 8 alelos).
Esta filtración sólo dio lugar a una variante compatible que era una deleción intrónica de 13
pb.

Secuenciación del transcriptoma completo y alineación de lecturas

Se recogieron testículos inmediatamente después del sacrificio en un matadero autorizado
de dos verracos (Verraco_80, Verraco_81) que eran homocigotos para la deleción de 13 pb
y que produjeron esperma con múltiples anomalías morfológicas de los flagelos. Las
muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta la
extracción del ARN.
Se prepararon bibliotecas de ARN de extremos pareados (2 x 150 pb) utilizando el ARN
total purificado del tejido testicular mediante el Kit de Preparación de Muestras de ARN
TruSeq de Illumina (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). Las bibliotecas se secuenciaron en
un instrumento Illumina NovaSeq6000 que produjo 49.198.010 y 70.451.148 lecturas. El
control de calidad de las lecturas de secuenciación de ARN sin procesar se realizó con el
software FASTP utilizando los ajustes de los parámetros por defecto (véase más arriba).
Los pares de lecturas filtradas (48.889.296 y 69.988.376) se alinearon con la secuencia de
referencia de Sscrofa11.1 y la anotación del gen Refseq (versión 106) utilizando la
herramienta de alineación de lecturas con conciencia de empalme STAR (versión 2.7.3a)
(Dobin et al. 2013). El número de lecturas de secuenciación de ARN que cubrían una
posición se contó utilizando el MOSDEPTH (véase más arriba).

Análisis bioinformático
Las secuencias de puntos de ramificación putativos dentro del intrón 55 de DNAH17 (XM_
021066525.1) se predijeron utilizando el algoritmo BPP (Zhang et al. 2017). Los sitios
aceptables de empalme 3' se predijeron utilizando la herramienta de software NNSPLICE
(https://www.fruitfly.org/ seq_tools/splice.html; Reese et al. 1997). Los dominios del
DNAH17 porcino (protein-ID: A0A287AFU3) se recuperaron de Uniprot.

Genotipado de la deleción de 13 pb
El ADN se aisló de las raíces del pelo (cerdos vivos) o del bazo (cerdos sacrificados)
utilizando el kit DNeasy para sangre y tejidos (Qiagen). A
Se estableció un ensayo de PCR consistente en un cebador delantero marcado con FAM
(Fw-DNAH17: 50-TGAGCATCTTCTTGGCGAGG-30) y un cebador inverso (Re-
DNAH17: 50-GCTGTTGATCAGCCAGGA-30) que se unen a los alelos de tipo salvaje y
mutante, así como un cebador inverso específico del tipo salvaje (Re-wt-DNAH17: 50-
TCGAGC TAGACGCGAGGG-30). Los fragmentos de la PCR se analizaron en un
DNAanalyzer 3130xl (Applied Bioscience).

Disponibilidad de datos
Los datos de la secuencia del genoma completo de 87 cerdos, incluyendo cinco verracos
con un defecto en la cola de los espermatozoides, han sido depositados en el Archivo
Europeo de Nucleótidos (ENA) del EMBL en los Bioproyectos PRJEB38156,
PRJEB37956, PRJEB39374, y PRJNA622908, bajo los números de acceso de las muestras
que se enumeran en el Archivo Suplementario S1. Los genotipos de cinco verracos
afectados y 82 no afectados en 14.806 SNPs y 3.856 Indels que se detectaron dentro del
segmento de autocigosidad están disponibles en Zenodo
(https://doi.org/10.5281/zenodo.4081475). Los datos de secuenciación de ARN de las
muestras de tejido testicular de dos verracos homocigotos para la deleción de 13 pb se han
depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) del EMBL en el BioProyecto
PRJEB38156 bajo los números de acceso de muestra SAMEA6832284 y SAMEA6832285.
Los datos de secuenciación de ARN de las muestras de tejido testicular de siete verracos
púberes son accesibles a través del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) del EMBL en
el BioProyecto PRJNA506525 bajo los números de acceso de muestra SAMN 10462191-
SAMN10462197. Los genotipos y haplotipos derivados del microarray de los casos y los
controles, los vectores propios considerados para tener en cuenta la estratificación, el script
de R utilizado para llevar a cabo las pruebas de asociación basadas en el haplotipo y los
resultados del estudio de asociación basado en el haplotipo están disponibles en Zenodo
(https://doi.org/10.5281/zenodo.4081475). El material complementario está disponible en
figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.13353605

Resultados

Manifestación fenotípica de un trastorno de la cola de los espermatozoides en verracos

blancos grandes
Cinco verracos blancos grandes suizos mantenidos en un centro de recogida de semen
produjeron eyaculados que contenían espermatozoides con colas defectuosas. El volumen
del eyaculado y la concentración de esperma eran normales. El análisis microscópico del
semen reveló múltiples anomalías morfológicas de los flagelos de los espermatozoides,
incluyendo colas rudimentarias, cortas, enrolladas y de forma irregular (Figura 1A). Se
observaron con frecuencia gotas citoplasmáticas proximales en la unión de la cabeza y la
cola de los espermatozoides. No se detectaron espermatozoides progresivamente móviles
en los eyaculados. La tinción con eosina-nigrosina del semen extraído del epidídimo de dos
verracos afectados indicó que el 48 y el 60% de los espermatozoides eran viables (Archivo
Suplementario S2).
Aparte de producir espermatozoides con colas defectuosas, los verracos estaban sanos y no
presentaban anomalías testiculares. Debido a la ausencia de espermatozoides móviles y al
alto grado de anormalidades de los flagelos, los verracos no eran aptos para la cría y fueron
sacrificados. El defecto de la cola espermática de los verracos se denomina comúnmente
astenoteratozoospermia.
Las secciones transversales de microscopía electrónica de transmisión de los flagelos de los
espermatozoides de un verraco fértil revelaron la típica disposición axonemal de nueve
dobletes de microtúbulos exteriores que rodean el par central (9x2þ2) (Figura 1D). Por el
contrario, los cortes transversales de los espermatozoides extraídos del epidídimo de dos
verracos afectados revelaron múltiples anormalidades ultraestructurales, incluyendo
axonemas completamente desorganizados (Figura 1C). Los dobletes de microtúbulos
centrales y exteriores estaban ausentes en algunos flagelos. Algunos espermatozoides
tenían estructuras axonémicas superfluas pero desorganizadas. Las bolsas citoplasmáticas
que se detectaron en la unión entre la cabeza y la cola de los espermatozoides mediante
microscopía óptica contenían componentes axonémicos desordenados o múltiples
estructuras similares a los flagelos dentro de la membrana celular de un espermatozoide
(Archivo Suplementario S3).

Figura 1 Características de un defecto recesivo de la cola de los espermatozoides de los

verracos Large White. Imágenes representativas de microscopía de contraste de fase de
espermatozoides producidos por verracos afectados (A) y fértiles (B). Los eyaculados de
los verracos afectados contenían espermatozoides con múltiples anormalidades
morfológicas de los flagelos, incluyendo colas cortas, enrolladas, rotas y dobladas. En la
mayoría de los espermatozoides de los verracos afectados se detectó una gota
citoplasmática proximal entre la cabeza y la cola del espermatozoide. Cortes transversales
representativos por microscopía electrónica de transmisión de flagelos de espermatozoides
de verracos afectados (C) y fértiles (D). Los cortes transversales de los flagelos de los
espermatozoides revelaron la disposición típica de nueve dobletes de microtúbulos
exteriores que rodean el par central (9_2þ2) en los verracos fértiles (D). La falta de dobletes
de microtúbulos centrales y exteriores y la desorganización completa del axonema se
detectaron con frecuencia en los cortes transversales de los flagelos de los espermatozoides
en los verracos afectados. Pedigrí de ocho verracos que produjeron esperma con colas
defectuosas (D). El pedigrí sólo contiene portadores de mutaciones obligadas. El color rojo
indica los ocho verracos afectados. Los números dentro de los recuadros corresponden a
las identificaciones de la Tabla 1. Los verracos 1246, 1249 y 1254 proceden de un
apareamiento entre dos animales presuntamente portadores. Los óvalos y los recuadros
representan los ancestros hembra y macho, respectivamente. El recuadro gris indica un
ancestro común (nacido en 2005) sobre el que se cruzaron todos los verracos afectados. Los
recuadros de color amarillo representan a los individuos que portaban el haplotipo superior
en estado heterocigoto (véase más adelante).

Los verracos que produjeron esperma defectuoso estaban estrechamente relacionados

(Figura 1E). Dos verracos afectados eran fullsibs (Verraco_80, Verraco_81). El coeficiente
de parentesco medio entre los verracos era de 0,28 y oscilaba entre 0,14 y 0,63. Su
coeficiente medio de consanguinidad fue de 0,087, ligeramente superior al de los verracos
fértiles (F¼0,06). Todos los verracos afectados eran consanguíneos de un verraco nacido en
2005. Este ancestro común estaba presente tanto en la ascendencia paterna como en la
materna de un número significativamente menor de verracos fértiles (N¼10, PFisher's exact
¼ 4,69 _ 10_6). Se utilizaron tres sementales de verracos afectados en la inseminación
artificial. Ninguno de sus eyaculados (n¼168) contenía una cantidad anómala de esperma
con flagelos defectuosos. Estas observaciones son compatibles con una herencia
autosómica recesiva del defecto de la cola de los espermatozoides. Para verificar la
presunta herencia recesiva y controlar las manifestaciones fenotípicas en los verracos
homocigotos, se realizó un apareamiento entre dos animales presuntamente portadores en el
campo (Figura 1E). La cerda parió una camada con ocho lechones hembra y tres machos
(Jabalí_1246, Jabalí_1249, Jabalí_1254). Los tres lechones machos se mantuvieron en un
establo de investigación. El jabalí_1246 murió a los 200 días de edad debido a un síndrome
intestinal hemorrágico. Se recogieron testículos y epidídimos post mortem. No se
detectaron anomalías testiculares. El análisis microscópico de los espermatozoides
extraídos del epidídimo reveló que los flagelos espermáticos presentaban múltiples
anomalías morfológicas. El verraco_1249 y el verraco_1254 estaban sanos y se
desarrollaron con normalidad en el establo de investigación. A los 17 meses, ambos
verracos fueron sacrificados en un matadero habitual y se recogieron los testículos y el
epidídimo. El análisis microscópico de los espermatozoides extraídos del epidídimo reveló
que ambos verracos producían espermatozoides con múltiples anomalías morfológicas de
los flagelos.

Las pruebas de asociación basadas en el haplotipo asignan el defecto de la cola de los

espermatozoides a un intervalo de 1,11Mb en el cromosoma 12 porcino
Seis verracos afectados (Tabla 1) fueron genotipados con el microarray Illumina
PorcineSNP60. Como grupo de control, se consideraron 100 verracos fértiles seleccionados
al azar de la población reproductora de Swiss Large White que también tenían genotipos
derivados de Illumina PorcineSNP60. Tras el control de calidad, se utilizaron los genotipos
de 41.094 SNP autosómicos para las pruebas de asociación. Las pruebas de asociación
caso/control basadas en un único marcador utilizando la prueba exacta de asociación alélica
de Fisher revelaron once SNP situados en los cromosomas porcinos 11, 12 y 13 que
superaron el umbral de significación corregido por Bonferroni (Figura 2A). La señal de
asociación más fuerte (P¼1.87 _ 10_9) resultó del SNP ASGA0052524 que está localizado
en 2,785,333 bp en el cromosoma porcino 12. Un factor de inflación de 1,55 indicaba que
el estudio de asociación basado en el SNP estaba enriquecido por señales de asociación
falsas y positivas. La inspección de los componentes principales superiores de la matriz de
relación genómica reveló la agrupación de los verracos con el defecto de la cola de los
espermatozoides (Archivo Suplementario S4), lo que sugiere que la estratificación de la
población confundió el análisis de asociación, produciendo así señales de asociación
espurias.
Para tener en cuenta la estratificación de la población, repetimos el análisis de asociación
utilizando un modelo lineal mixto basado en SNP o un modelo lineal basado en haplotipos
que incluía 30 componentes principales de una matriz de relación genómica como
covariables. Un factor de inflación de 1,03 indicó que el modelo lineal mixto basado en
SNP controlaba con éxito la estratificación de la población.Dos SNP (ASGA0052524 en
2.785.333 pb y ALGA0118426 en 8.504.544 pb) en SSC12 se asociaron significativamente
con el defecto de la cola del esperma (Figura 2B). Un factor de inflación de 1,15 indicó que
el control de la estratificación de la población basado en componentes principales tuvo
éxito en su mayor parte en el estudio de asociación basado en haplotipos. Veintiún
haplotipos situados entre 94.345 y 9.256.260 pb en el cromosoma 12 (SSC12) superaron el
umbral de significación corregido por Bonferroni (Figura 2C). Las asociaciones más fuertes
(P¼4,22 x 10_15) se detectaron para tres haplotipos superpuestos situados entre 2.166.472
y 3.755.956 pb. El haplotipo superior se presentó con una frecuencia del 3,5% entre los 100
verracos fértiles. Siete verracos fértiles eran portadores heterocigotos del haplotipo
superior. El haplotipo superior no se detectó en estado homocigoto en los verracos fértiles.
Ningún haplotipo localizado en cromosomas distintos del SSC12 se asoció con el defecto
de la cola del esperma. El estudio de asociación basado en el haplotipo alcanzó un
segmento de 1,11Mb de homocigosidad extendida (entre 3.473.632 y 4.587.759 pb) en el
cromosoma 12 porcino que era idéntico por descendencia en los seis verracos afectados,
corroborando la herencia recesiva (Figura 2D). Según la anotación Refseq del genoma
porcino, el segmento de autocigosidad extendida abarca 15 genes (Figura 2E).
Sospechamos que la mutación que causa el defecto de la cola de los espermatozoides afecta
a un transcrito que es abundante en los testículos. Encontramos niveles de expresión
superiores a 10 transcritos por millón para cuatro genes (DNAH17, BIRC5, SYNGR2,
SEC14L1) que estaban anotados dentro del segmento de 1,11Mb de homocigosidad
extendida (Figura 2E). Entre ellos, solo DNAH17, que codifica la cadena pesada axonemal
de dineína 17, muestra una expresión altamente sesgada en los testículos de los seres
humanos (https://gtexportal.org/home/), las ovejas (http://biogps.org/
dataset/BDS_00015/sheep-atlas/) (Clark et al. 2017) y el ganado vacuno
(http://cattlegeneatlas.roslin.ed.ac.uk/) (Fang et al. 2020). Se han detectado alelos
patógenos en ortólogos humanos y murinos de DNAH17 en machos que producen esperma
inmóvil con múltiples anomalías morfológicas de los flagelos (Whitfield et al. 2019; Zhang
et al. 2020). Por lo tanto, consideramos a DNAH17 como un gen candidato posicional y
funcional convincente para un defecto del flagelo de los espermatozoides en los verracos.
Una deleción intrónica de 13 pb está asociada con el defecto de la cola de los
espermatozoides
Secuenciamos cinco verracos afectados con una cobertura media de 10,9 pliegues
utilizando lecturas cortas pareadas. También consideramos 82 cerdos secuenciados de
nuestra base de datos interna que no estaban afectados por el trastorno de la cola de los
espermatozoides. El análisis de la profundidad de secuenciación en la región proximal de
SSC12 no reveló grandes deleciones o duplicaciones que se segreguen con el haplotipo.
Para identificar las mutaciones causales candidatas, se consideraron 18.662 variantes
(14.806 SNPs y 3856 Indels) que se detectaron dentro del intervalo de 1,11Mb (entre
3.473.632 y 4.587.759 bp) de homocigosidad extendida. De los 82 animales de control
secuenciados, 65 también tenían genotipos marcados por el array. Tres de los 65 cerdos que
tenían genotipos llamados por la matriz y la secuencia portaban el haplotipo superior en
estado heterocigoto, lo que arroja una frecuencia de haplotipos del 2% en los animales de
control secuenciados.
De las 18.662 variantes posicionales candidatas a la causa, una sola variante era compatible
con la herencia recesiva del defecto de la cola del esperma: una deleción de 13 pb en
Chr12:3.556.401-3.556.414 pb (XM_021066525.1: c.8510-17_8510-5del) localizada en un
intrón de DNAH17. La localización de 13 pb se encuentra dentro de la ventana superior del
estudio de asociación basado en el haplotipo. El genotipado de variantes de secuencia
utilizando GATK indicó que los cinco verracos secuenciados con el defecto de la cola del
esperma eran homocigotos para la deleción. Sólo los tres verracos del grupo de control, que
llevaban el haplotipo superior en el estado heterocigoto, también llevaban la deleción de 13
pb en el estado heterocigoto. La deleción no se produjo en el estado homocigoto en los
animales del grupo de control. Según el algoritmo de clasificación de variantes del software
VEP, la deleción intrónica de 13 pb se anotó como "splice_region_variant &
intron_variant". Se predijo que su impacto en la función de la proteína era bajo.

La secuenciación del ARN revela que la deleción de 13 pb provoca la omisión del exón
56 del ADNH17
Una inspección más detallada de la deleción de 13 pb reveló que elimina una secuencia
intrónica rica en pirimidina que contiene un tramo continuo de ocho bases de pirimidina
entre 5 y 17 bases aguas arriba de un sitio de empalme canónico 30 del exón 56 de
DNAH17 (Figura 3A). El plugin VEP SpliceRegion.pm indicó que la deleción coincide con
un tracto putativo de polipirimidina. Se predijo una secuencia consenso de punto de
ramificación (yUnAy) (Gao et al. 2008) (zscore: 4,79) 2-6 nucleótidos aguas arriba de la
deleción de 13 pb. El contenido de pirimidina entre la adenina del punto de ramificación
predicho y el sitio aceptor de empalme en el extremo 3' del intrón 55 es del 68,4%.
Teniendo en cuenta que el tracto de polipirimidina es un importante elemento que actúa en
cis para el ensamblaje del spliceosoma en los sitios de empalme aceptores canónicos de tipo
"GTAG" (Coolidge et al. 1997), sospechamos que la deleción de 13 pb perturba el
empalme del pre-ARNm. La predicción in silico del sitio de empalme utilizando
NNSPLICE indicó (puntuación de predicción 0,46) que la deleción de 13 pb probablemente
impide el reconocimiento del sitio aceptor de empalme 30 en el límite intrón-exón del exón
56, causando así posiblemente la omisión del exón.
Figura 2 Un segmento de 1,11Mb en el cromosoma 12 porcino está asociado con el defecto
de la cola del esperma. Diagrama de Manhattan de un estudio de asociación de todo el
genoma basado en SNP (A, B) y haplotipos (C). El color rojo representa once SNP y
veintiún haplotipos que superaron el umbral de significación corregido por Bonferroni. Los
estudios de asociación basados en SNP se realizaron utilizando pruebas exactas de Fisher
de asociación alélica (A) o un modelo lineal mixto como el implementado en GCTA (B).
Mapeo de homocigosidad en seis verracos que produjeron esperma con colas defectuosas
utilizando SNPs localizados en el cromosoma 12 porcino (D). El azul y el azul pálido
representan los genotipos homocigóticos (AA y BB), los genotipos heterocigóticos se
muestran en negro. La barra roja indica un segmento de 1,11Mb de homocigosidad
extendida que fue compartido en los seis verracos afectados. La abundancia de ARNm
(cuantificada en transcritos por millón) de 15 genes que están localizados dentro del
segmento de homocigosidad extendida en el tejido testicular de verracos púberes (E). La
línea vertical representa la desviación estándar estimada en siete muestras.
El exón 56 del DNAH17 porcino se expresa regularmente en el tejido testicular de los
verracos púberes (Archivo Suplementario S5). Para examinar si la pérdida del tracto de
polipirimidina aguas arriba del exón 56 perturba el splicing, secuenciamos el ARN
purificado del tejido testicular de dos verracos que producían esperma defectuoso y eran
homocigotos para la deleción de 13 pb. Alineamos 49 y 70 millones de lecturas de
secuenciación de ARN de extremo pareado (2x150 nt) con el transcriptoma porcino para
cuantificar la abundancia de transcritos y exones. Se detectó una media de 49 transcritos de
DNAH17 por millón (TPM) en los dos verracos homocigotos para la deleción de 13 pb. Sin
embargo, ninguna lectura se alineó con la secuencia del exón 56, lo que corrobora que la
deleción de 13 pb impide el reconocimiento del sitio de empalme 3', causando así la
omisión del exón (Figura 3B).

Figura 3 Una deleción de 13 pb perturba el splicing de DNAH17. Secuencia genómica en

los límites intrón-exón del exón 56 del DNAH17 porcino (XM_021066525.1) (A). El fondo
gris indica la secuencia del exón 56. El color rojo destaca los 13 nucleótidos que se
eliminan en los verracos con el defecto de la cola del esperma. Los sitios aceptores y
donantes del empalme están representados en negrita y cursiva. El color violeta indica la
secuencia de punto de ramificación (BPS) predicha (z-score: 4,79). Expresión de DNAH17
(en recuentos por millón) en los testículos de dos verracos blancos grandes suizos
(SAMEA6832284, SAMEA6832285) homocigotos para la deleción de 13 pb (B). El
número de lecturas que cubren una posición se dividió por el número total de lecturas (en
millones) asignadas a transcripciones, y se promedió en ambos verracos. El color azul
indica la estructura exón-intrón del DNAH17 porcino. El exón 56 se muestra en color rojo.
Dominios de DNAH17 según Uniprot (protein-ID: A0A287AFU3) (C). Los recuadros de
diferentes colores representan los dominios conservados en el tallo de las cadenas pesadas
de dineína (DHC), la región de unión a microtúbulos (MT) y seis dominios ATPasa
(ATPasas asociadas a diversas actividades celulares, AAA1-AAA6). La omisión del exón
56 trunca 89 aminoácidos (color rojo) de AAA4.
La omisión del exón 56 provoca una pérdida dentro del marco de 89 aminoácidos (residuos
2836-2924) que representan el 2% del DNAH17 porcino (XP_020922184.1). La DNAH17
contiene seis dominios evolutivamente conservados de tipo "ATPasa asociada a una
variedad de actividades celulares (AAA)" que están unidos como un anillo hexamérico
asimétrico necesario para impulsar el movimiento de batido de los flagelos de los
espermatozoides (Snider et al. 2008; Gleave et al. 2014). Los 89 aminoácidos están
truncados de AAA4 de DNAH17 (Figura 3C).

Discusión
Ocho verracos blancos grandes suizos produjeron esperma con múltiples anormalidades
morfológicas de los flagelos. Teniendo en cuenta que todos los espermatozoides eran
inmóviles, se consideró que los verracos eran infértiles y no se utilizaron para la cría. Dado
que la mayoría de los espermatozoides eran viables, la fecundación podría ser posible
utilizando la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Nijs et al. 1996;
Ortega et al. 2011). Aunque la ICSI no se aplica de forma rutinaria en los programas de cría
de cerdos, podría permitir la reproducción de verracos con defectos en la cola de los
espermatozoides que impiden la fertilización de otra forma. Sin embargo, las tasas de éxito
tras la ICSI pueden variar considerablemente en individuos con astenoteratozoospermia
(Wambergue et al. 2016). Curiosamente, la ICSI tiene éxito en algunos pero no todos los
individuos con alelos patógenos de DNAH17 (Whitfield et al. 2019). En cualquier caso, la
aplicación de la ICSI en poblaciones ganaderas parece injustificada si la infertilidad
subyacente del factor masculino sigue una herencia recesiva, porque un alelo defectuoso se
transmitiría a la descendencia y podría aumentar la frecuencia alélica en la población.
Aparte de producir esperma con colas defectuosas, los verracos estaban sanos. Era menos
probable que las enfermedades y los factores de estrés ambiental causaran los flagelos
espermáticos defectuosos (Jurewicz et al. 2009), porque los verracos se mantuvieron en un
centro de recogida de semen con muchos otros verracos que producían semen normal. La
infertilidad idiopática y la mala calidad del semen en machos sanos pueden ser el resultado
de alelos patógenos en genes que se expresan específicamente en el tracto reproductivo
masculino (Pausch et al. 2014 ; Pausch et al. 2016b; Iso-Touru et al. 2019; Noskova et al.
2020). Los ocho verracos afectados eran consanguíneos de un ancestro común que apoya la
hipótesis de una etiología genética compartida. Aunque la presencia de ancestros comunes
en los pedigríes de todos los verracos afectados es compatible con la herencia recesiva, no
descarta otros modos de herencia (Bourneuf et al. 2017). Teniendo en cuenta que todos los
verracos afectados, pero solo unos pocos fértiles, eran consanguíneos del ancestro común,
era probable un modo de herencia recesivo. Un apareamiento entre dos portadores
heterocigotos dio lugar al nacimiento de ocho lechones hembras y tres machos (5 wt/wt, 2
wt/mt, 4 mt/mt). Los tres lechones machos eran portadores homocigóticos de la deleción de
13 pb y manifestaban el defecto de la cola del esperma, corroborando así la herencia
recesiva.
Los defectos morfológicos y ultraestructurales de los flagelos de los ocho verracos blancos
grandes suizos son similares a los observados en los verracos Yorkshire finlandeses que son
homocigotos para un alelo recesivo de pérdida de función en KPL2 (también conocido
como SPEF2) (Andersson et al. 2000; Sironen et al. 2006). Aunque no se ha documentado
recientemente el cruce entre Yorkshire finlandés y cerdos blancos grandes suizos, el alelo
defectuoso podría estar localizado en un antiguo haplotipo compartido (Pausch et al. 2016a;
Schwarzenbacher et al. 2016). Sin embargo, la región genómica del cromosoma 16 que
engloba a SPEF2 no está asociada al defecto espermático de los verracos Large White
suizos, lo que indica una heterogeneidad genética.
Los SNP de los cromosomas 11, 12 y 13 se asociaron significativamente con el trastorno
espermático mediante la prueba exacta de asociación alélica de Fisher. Este resultado fue
desconcertante porque era improbable una herencia oligogénica del defecto de los flagelos
del esperma. La clasificación fenotípica errónea y la heterogeneidad genética podrían
conducir a un estudio de asociación no concluyente (Manchia et al. 2013). Sin embargo, las
anomalías morfológicas de los flagelos espermáticos eran sorprendentemente similares en
los eyaculados de ocho verracos. Además, el análisis del pedigrí sugirió una herencia
recesiva monogénica. El análisis de componentes principales y un factor de inflación
genómica de 1,55 indicaron que la estratificación de la población confundía nuestro estudio
de asociación basado en SNP (Price et al. 2010). Aunque las pruebas exactas de Fisher se
han aplicado ampliamente para mapear rasgos binarios (Balding 2006), estas pruebas son
propensas a errores de tipo I cuando los casos y los controles difieren en su ascendencia.
Un estudio de asociación basado en un modelo lineal mixto controló con éxito la
estratificación de la población y reveló dos SNPs asociados en SSC12. Sin embargo, los
SNPs estaban a 6 millones de pb de distancia el uno del otro y la señal de asociación no era
muy fuerte (P¼1,2 _ 10_9). Siguiendo el enfoque de (Hiltpold et al. 2020), ajustamos los
componentes principales superiores de una matriz de relación genómica como covariables
en un modelo de asociación basado en haplotipos para tener en cuenta la estratificación de
la población. Se mantuvo una señal de asociación convincente (P¼4,22 _ 10_15) en el
cromosoma 12, mientras que todas las demás señales de asociación desaparecieron. De
acuerdo con estudios anteriores (Price et al. 2006; Pausch et al. 2011; Hiltpold et al. 2020)
y evidenciado por un bajo factor de inflación, la corrección basada en componentes
principales eliminó con éxito las señales espurias que surgieron debido a la estratificación
de la población.
Teniendo en cuenta que el haplotipo más significativamente asociado también abarca la
variante causal para el defecto de los flagelos del esperma, nuestros resultados corroboran
que las pruebas de asociación basadas en el haplotipo a nivel del genoma ofrecen un
enfoque poderoso para identificar regiones asociadas a rasgos en cohortes de mapeo
estratificadas (Kadri et al. 2014; Pausch et al. 2016a; Hiltpold et al. 2020). El haplotipo
asociado a múltiples anomalías morfológicas de los flagelos del esperma lleva una deleción
de 13 pb en un intrón de DNAH17 que codifica la cadena pesada axonemal de la dineína
17. Nuestros resultados muestran que la DNAH17 es abundante en el tejido testicular
porcino. Las cadenas pesadas axonémicas de dineína son necesarias para el ensamblaje
axonémico y el movimiento de batido de los flagelos (Inaba 2003; Ben Khelifa et al. 2014;
Tu et al. 2019; Whitfield et al. 2019; Liu et al. 2020; Sha et al. 2020; Sironen et al. 2020;
Zhang et al. 2020). Los alelos patogénicos de DNAH17 humanos y murinos se manifiestan
en espermatozoides con una vaina mitocondrial y gotas citoplasmáticas anormales, así
como una desorganización axonémica que incluye la ausencia del par central y la falta de
dobletes de microtúbulos periféricos (Whitfield et al. 2019; Sha et al. 2020; Zhang et al.
2020). Los verracos que son homocigotos para una deleción de 13 pb en el intrón 55 de
DNAH17 también producen esperma con múltiples anormalidades morfológicas y
ultraestructurales de los flagelos. Aunque está anotada como una variante de bajo impacto,
la deleción intrónica de 13 pb perturba el empalme del pre-ARNm porque interrumpe el
tracto de polipirimidina en el intrón 55 de DNAH17. El mutante DNAH17 carece de parte
del dominio AAA4, lo que probablemente compromete el ensamblaje del axonema y el
movimiento de batido del flagelo del espermatozoide en el estado homocigoto. El
ensamblaje del axonema flagelar está menos desorganizado cuando otros dominios de
DNAH17 están afectados por variantes patogénicas (Whitfield et al. 2019; Sha et al. 2020;
Zhang et al. 2020), probablemente porque un dominio AAA4 intacto es esencial para la
función fisiológica de DNAH17 (Snider et al. 2008). Así, nuestros hallazgos sugieren que
la deleción intrónica de 13 pb es un alelo de pérdida de función. Anteriormente
identificamos mutaciones en los sitios donantes de empalme y en los sitios aceptores de
empalme cercanos que se manifiestan en trastornos reproductivos masculinos debido a un
empalme aberrante (Iso-Touru et al. 2019; Hiltpold et al. 2020). Nuestro presente estudio
revela una deleción intrónica de 5 a 17 nucleótidos aguas arriba de un sitio de empalme
canónico 3' que perturba el empalme como la variante causal más probable para un nuevo
defecto de flagelo de esperma porcino. La deleción de 13 pb compromete el empalme
porque extirpa un tracto de polipirimidina aguas arriba del exón 56 de DNAH17. Las
consecuencias fenotípicas derivadas de las mutaciones del tracto de la polipirimidina se
habían descrito raramente hasta ahora (Lefe'vre et al. 2002; Sartelet et al. 2015;
Abramowicz y Gos 2018). Hasta donde sabemos, nuestro estudio informa de la primera
asociación fenotipo-genotipo para una mutación que afecta a un tracto intrónico de
polipirimidina en cerdos. Proporcionamos pruebas de que la pérdida del tracto de
polipirimidina en el intrón 55 del DNAH17 porcino impide el reconocimiento del sitio de
empalme 30, lo que conduce a la omisión del exón 56, causando así flagelos espermáticos
defectuosos. Los motivos de secuencia que gobiernan el ensamblaje del espliceosoma
pueden estar más alejados de los sitios de empalme 3' que el tracto de polipirimidina en el
intrón 55 de la DNAH17 porcina (Zhang et al. 2017). Sin embargo, las herramientas
estándar de anotación de variantes de secuencia son en gran medida ciegas a las
consecuencias putativas que surgen de las mutaciones dentro de los motivos intrónicos. Por
lo tanto, la caracterización sistemática de los puntos de ramificación y los tractos de
polipirimidina parece justificada para refinar la clasificación funcional de las variantes
intrónicas.
Nuestros hallazgos permiten el seguimiento de la deleción de 13 pb y la identificación
inequívoca de los animales portadores y homocigotos mediante pruebas genéticas directas.
Aunque la homocigosidad para la deleción de 13 pb se reconoce fácilmente en los verracos
de inseminación artificial mediante el análisis microscópico del semen, puede pasar
desapercibida en cerdas y verracos de servicio natural. Los verracos de servicio naturales
afectados se notarán después de pocos apareamientos debido a su baja fertilidad. De
acuerdo con hallazgos anteriores sobre alelos de pérdida de función en el DNAH17 humano
y murino (Whitfield et al. 2019; Sha et al. 2020; Zhang et al. 2020), los portadores de la
mutación homocigota estaban sanos. Teniendo en cuenta que la frecuencia de la deleción de
13 pb es baja y que la mayoría de las cerdas son inseminadas artificialmente, las pérdidas
económicas debidas a la cría infructuosa con verracos homocigotos son insignificantes en la
población de Swiss Large White.
El número de condiciones recesivas detectadas en las poblaciones ganaderas aumenta
constantemente (Nicholas y Hobbs 2014). El bajo tamaño efectivo de la población, los
efectos fundadores y la endogamia favorecen la manifestación de condiciones recesivas.
Los recientes avances en el genotipado y la secuenciación de todo el genoma ofrecen
poderosas herramientas para la rápida detección de variantes causales que subyacen a las
condiciones heredadas (Bourneuf et al. 2017). Las consecuencias fenotípicas y económicas
de la deleción de 13 pb en DNAH17 son menos perjudiciales que las mutaciones que se
manifiestan en lechones malformados y no viables (Derks et al. 2018; Fang et al. 2020). Sin
embargo, los alelos que comprometen la calidad del semen y la fertilidad de los machos en
individuos por lo demás sanos pueden alcanzar una alta frecuencia en ausencia de
manifestaciones deletéreas en las hembras (Pausch et al. 2014; Hiltpold et al. 2020). La
deleción de 13 pb en DNAH17 se suma a un catálogo de variantes de secuencia que causan
infertilidad por factor masculino en cerdos (Sironen et al. 2006, 2011; Noskova et al. 2020).
Sigue siendo una cuestión abierta cómo un número creciente de alelos recesivos no
deseados puede considerarse adecuadamente en las poblaciones ganaderas (Cole 2015;
Upperman et al. 2019). Aunque la deleción de 13 pb recientemente identificada no
compromete el bienestar de los animales homocigotos ni da lugar a enormes pérdidas
económicas, su frecuencia debería mantenerse a un nivel bajo para evitar el nacimiento de
verracos homocigotos que manifiesten un trastorno de la cola de los espermatozoides
esterilizante.

Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Cecilia Bebeacua (ScopeM) su apoyo en la microscopía electrónica
de transmisión. Agradecemos el excelente apoyo técnico proporcionado por las plataformas
tecnológicas de ETH Zu¨ rich FGCZ (https://fgcz.ch/), ScopeM (https://scopem.ethz.ch/), y
el Centro de Diversidad Genética (https://gdc.ethz.ch/), respectivamente, para la
secuenciación, microscopía y análisis de fragmentos de ADN.

Financiación
Agradecemos el apoyo financiero de SUISAG, Micarna SA y la Fundación ETH Zu¨ rich.

Conflictos de intereses
Christin Selige y Andreas Hofer son empleados de SUISAG (el centro de competencia y
cría de cerdos de Suiza).