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Evaluación del impacto del método de extracción de ADN en la representación de comunidades bacterianas y fúngicas

orales humanas

La cavidad oral alberga uno de los microbiomas más diversos del cuerpo humano [1]. Dentro de la cavidad oral, se
producen varios nichos distintos, incluidos los que se encuentran en la placa y la saliva [2, 3], donde la disbiosis y la
presencia de microbios específicos pueden asociarse con la enfermedad [4–6]. La elección del protocolo de extracción de
ADN tiene el potencial de influir en nuestra percepción de la estructura del microbioma. La extracción de ADN se puede
lograr a través de diferentes procedimientos de lisis celular, que incluyen químicos, enzimáticos, mecánicos y térmicos.
Estudios recientes demuestran que el método de lisis celular utilizado durante la extracción de ADN de muestras orales
puede afectar la recuperación de phylas bacterianas específicas [7]. La lisis mecánica aumenta el número de diferentes
phylas bacterianos recuperados de la saliva [7], mientras que la adición de lisozima a la lisis mecánica mejora el
rendimiento general del ADN bacteriano de la saliva [8]. Del mismo modo, en la placa, un paso de lisis mecánica y la adición
de lisozima maximiza la recuperación a nivel de especie [9]. Como todos los métodos tienen sesgos inherentes, un enfoque
que proporcione una representación real del microbioma oral es vital si queremos comprender más plenamente sus
manifestaciones clínicas.

Los estudios sobre el sesgo de extracción de ADN se han centrado en gran medida en los componentes bacterianos del
microbioma oral, por lo tanto, los datos pertenecientes a la comunidad fúngica (micobioma) carecen de comparación. El
huésped idéntico (humano) y las secuencias fúngicas en los sitios de unión del cebador del gen 18S rRNA hacen de este
gen un objetivo inadecuado para muchas muestras humanas, ya que las secuencias obtenidas pueden ser
predominantemente humanas en lugar de derivadas de hongos. En parte por esta razón, la región espaciadora transcrita
interna intergénica (ITS) se ha convertido en una alternativa atractiva a la secuenciación del gen 18S rRNA para análisis de
la comunidad fúngica, debido a su mayor variabilidad de secuencia que lo diferencia del ADN del huésped y también
permite una mayor resolución taxonómica [10] Sin embargo, las ventajas de la secuenciación de ITS aún no han conducido
a una mejor comprensión del micobioma oral. Hasta la fecha, solo unos pocos estudios han intentado describir esta
comunidad, con aún menos énfasis en cómo la extracción de ADN puede afectar su representación [11-13]. Las
interacciones físicas y químicas se producen entre bacterias y hongos en el entorno oral, conduciendo la estructura y el
comportamiento de la comunidad microbiana oral y contribuye potencialmente a la patogénesis de las enfermedades
orales [14-16]. Por lo tanto, sería ventajoso estudiar simultáneamente el ADN de comunidades bacterianas y fúngicas,
para comprender las asociaciones clínicas de las relaciones intra e interdominio. Aquí, evaluamos sistemáticamente cuatro
métodos de extracción de ADN genómico (ADNg) para comparar los perfiles de la comunidad bacteriana y fúngica, y
determinar qué métodos proporcionan una representación adecuada de la diversidad microbiana en muestras de saliva y
placa dental humana.

Materiales y métodos

Declaración de Ética: La aprobación ética para este estudio fue otorgada por el Comité de Ética de Salud y Discapacidad
del Sur (HDEC) (14 / STH / 121) y la aprobación institucional se obtuvo de la Junta de Salud del Distrito de Auckland, Nueva
Zelanda. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes.

Recogida y preparación de muestras.

Doce pacientes fueron reclutados de la Unidad de Salud Oral, Hospital Green Lane, Auckland, Nueva Zelanda para
participar en este estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento para proporcionar placa dental sub y
supragingival para este estudio, recolectada durante una descamación de toda la boca. La placa fue removida por un
dentista registrado usando raspadores periodontales estériles y colocada en un tubo con tapón de rosca que contenía 1
ml de RNAlater1 (AMBION, Inc., Austin, TX, EE. UU.). Las muestras se almacenaron a -20 ° C hasta su posterior
procesamiento. Doce voluntarios sanos de la Universidad de Auckland, Nueva Zelanda, dieron su consentimiento para
proporcionar una muestra de saliva fresca. Se recogió al menos 1 ml de saliva de cada participante mediante secreción
pasiva en un recipiente estéril y se congeló puro a -20 ° C. Para crear una muestra homogénea de volumen adecuado para
la comparación de múltiples métodos de extracción de ADN, se reunió 1 ml de cada una de las 12 muestras de placa en
RNAlater1 (AMBION, Inc., Austin, TX, EE. UU.) en un tubo de polipropileno CELLSTAR1 de 50 ml ( Greiner Bio-One) y agitó
en vórtex hasta lograr una solución consistente. De manera similar, 1 ml de cada una de las 12 muestras de saliva se
agruparon y se mezclaron completamente. Los homogeneizados agrupados en placa y saliva (con un total de
aproximadamente 12 ml cada uno) se dividieron por separado en partes alícuotas de 200 μL para pruebas posteriores.

Extracción de ADN

Se realizaron cuatro técnicas de extracción por triplicado en las alícuotas de 200 μL de la placa agrupada y de los
homogeneizados de saliva agrupados. Se usaron tres kits de extracción de ADN comerciales de uso común según las
instrucciones del fabricante, a saber, el kit de aislamiento de ADN MoBio PowerSoil1 (M), el kit Qiagen QIAamp1 DNA Mini
(Q) y el Zymo Bacterial / Fungal DNA Mini PrepTM (Z) (Tabla 1). Además, se utilizó un método previamente descrito de
fenol: cloroformado para el aislamiento del ADN de la saliva (P) [17]. La ruptura celular mecánica se realizó utilizando un
Qiagen TissueLyser II a 30 Hz durante 2 x 50 s, según corresponda. Para cada método, se usó un blanco de extracción (agua
de grado PCR) para determinar la posible contaminación del kit y / o reactivo.

Eficiencia de extracción de ADN fúngico

Los cuatro métodos de extracción de ADN se emplearon por triplicado para extraer ADN fúngico por separado de 200 μL
de ~ 7500 CFU/μL Cryptococcus neoformans ATCC1 32045TM en RNAlater1 (AMBION, Inc., Austin, TX, EE. UU.) Y 200 μL
de ~ 1150 CFU / μL Penicillium chrysogenum ATCC1 10002TM en RNAlater1 (AMBION, Inc., Austin, TX, EE. UU.). La calidad
y el rendimiento del ADN se midieron en el NanoPhotometer1 N60 (IMPLEN, Inc., Westlake Village, CA, EE. UU.).

Kit de aislamiento de ADN MoBio PowerSoil. Se descongelaron alícuotas en hielo y se pipetearon en un tubo PowerBead
suministrado. El kit de aislamiento de ADN MoBio PowerSoil1 emplea un paso de lisis mecánico (golpe de cuentas) para
romper las células. La adición de la solución salina proporcionada ayudó a que el ADN se uniera al filtro de columna de
sílice, y una solución a base de etanol lavó el ADN unido. Finalmente, 100 μL de tampón de elución estéril liberaron el ADN
del filtro de la columna de centrifugación, produciendo ADN para aplicaciones posteriores.

Qiagen QIAamp1 Mini kit de ADN. Después de descongelar en hielo, se sedimentaron alícuotas a 5000 x g y se
resuspendieron en el tampón de lisis suministrado. La lisis celular y la digestión de proteínas se lograron usando una
incubación de Proteinasa K a 56 ° C durante 1 h. El ADN se unió a un filtro de columna giratoria, luego se lavó con etanol
al 96-100%, seguido de dos tampones de lavado (suministrados). El ADN unido se eluyó del filtro de columna de rotación
con 200 μl del tampón de elución suministrado.

Zymo Bacterial / Fungal DNA mini prepTM. La placa descongelada y las alícuotas de saliva se centrifugaron a 5000 x g y
se resuspendieron en 200 μl de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en un tubo de lisis ZR BashingBeadTM.
Se añadió una solución de lisis para ayudar a lisar las células durante la etapa de lisis mecánica. El sobrenadante de la
solución lisada se filtró utilizando un filtro de centrifugación Zymo-SpinTM IV, luego el ADN se unió a una columna IIC
Zymo-SpinTM en presencia de tampón de unión de ADN, que contenía 0,5% (v / v) de beta-mercaptoetanol. Se lavó el
ADN, luego se eluyó con 100 μl de tampón de elución de ADN.
Fenol: aislamiento de ADN a base de cloroformo. Este método de separación de fases se adaptó de un método descrito
previamente para la extracción de ADNg de la saliva [17]. Se añadió TE Buffer (400 μL) a la placa descongelada y alícuotas
de saliva y la mezcla se centrifugó a 8000 x g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en tampón TE que contenía
lisozima (5 mg / ml) y se incubó durante 1 hora a 37 ° C. Se agregaron proteinasa K y dodecilsulfato de sodio al 5% (SDS) a
las concentraciones respectivas finales de 2 mg / ml y 1% (v / p), luego los tubos se incubaron a 50 ° C durante 2 h, con
agitación a 300 rpm. Los ácidos nucleicos se liberaron de las células con tres ciclos de congelación-descongelación de -20
° C (5 min) y 65 ° C (3 min). Se añadió fenol saturado con tampón y los tubos se agitaron en vórtex, luego se centrifugaron
(13,000 x g, 4˚C, 10 min). Se recuperó la fase acuosa, a la que se añadió un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico
(24: 1). Los tubos se agitaron en vórtex y se centrifugaron nuevamente a 13,000 x g, 4 ° C durante 10 min. El sobrenadante
se transfirió a un tubo Eppendorf esterilizado con UV y los ácidos nucleicos se precipitaron con 0,6 volúmenes de
isopropanol durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, se sedimentó el ADN (13,000 x g, 4˚C, 10 min), se lavó con etanol al
70% y se resuspendió en 20 μL de agua estéril.

Evaluación de la calidad del ADN y el rendimiento de la placa y la saliva.

El rendimiento de ADN se determinó fluorométricamente usando el kit dsDNA de alta sensibilidad (Invitrogen Co.,
Carlsbad, CA, EE. UU.) En el fluorómetro Qubit1 1.0. Las proporciones de absorbancia se midieron
espectrofotométricamente en el NanoDrop1 ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, EE. UU.) Para evaluar
la pureza del ADN: A260 / 280 nm para contaminación de proteínas y A260 / 230 nm para contaminación de sal y fenol.
Dado que el ADN absorbe la luz a 260 nm, las relaciones de 1.8 a 2.0 (para A260 / 280 nm) y> 1.8 (para A260 / 230 nm)
indicaron que la muestra probablemente no estaría contaminada por las sustancias respectivas. Se visualizó ADN
genómico (3 μl) en un gel de agarosa al 1% (p / v) que contenía tinción de gel de ADN seguro SYBR (Invitrogen Co., Carlsbad,
CA, EE. UU.). La cantidad y calidad de ADN para cada muestra se evaluó adicionalmente utilizando un chip Agilent DNA
1000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania), que utiliza el tamaño de fragmento para evaluar la integridad y
degradación del ADN.

La amplificación por PCR y la preparación de secuenciación

Los extractos de ADN se diluyeron en agua destilada UltraPureTM (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EE. UU.) Para lograr
concentraciones equimolares. Para cada extracción por triplicado y blanco de extracción única de los cuatro métodos
diferentes, el ADNg se sometió a amplificación por PCR tanto del gen bacteriano 16S ARN ribosómico (16S rRNA) como de
la región espaciadora transcripta interna 1 fúngica (ITS1).

Amplificación del gen 16S rRNA. Los cebadores 341F y 806R se usaron para amplificar la región V3-V4 del gen 16S rRNA
[18]. Cada reacción de PCR contenía: 1 X tampón de PCR de alta fidelidad, sulfato de magnesio 2 mM, dNTP 0,5 mM,
0,004X Platinum1 Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EE. UU.), Cebador 0.2 μM 341F, 0.2 μM
806R, 18.9 μL PCR califica agua y 1 μL de cada plantilla de ADNg normalizada. Para cada ejecución de amplificación, se usó
1 μL de ADNg de Escherichia coli como control positivo y 1 μL de agua de grado PCR como control negativo. La PCR se
realizó utilizando las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 minutos, seguida
de 32 ciclos que consisten en desnaturalización (94 ° C durante 45 s), recocido (55 ° C durante 45 s) y extensión (72 ° C)
durante 90 s), con un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Se realizaron amplificaciones duplicadas para cada
reacción, luego se agruparon para dar un volumen total de 50 μL. Se corrieron dos microlitros de cada reacción de PCR
agrupada en un gel de agarosa al 1% (p / v) que contenía tinción de gel de ADN seguro SYBR (Invitrogen Co., Carlsbad, CA,
EE. UU.) Y se visualizaron bajo luz ultravioleta.

ITS1 amplificación. Los cebadores ITS1F [19] e ITS2 [20] se utilizaron para amplificar la región ITS1. Cada reacción de PCR
contenía: 1X tampón de PCR de alta fidelidad, sulfato de magnesio 2 mM, dNTP 0,5 mM, 0.004X Platinum1 Taq DNA
Polymerase High Fidelity (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EE. UU.), Cebador directo 0.2 μM ITS1, 0.2 μM ITS2 inverso cebador,
18.9 μL de agua de grado PCR y 1 μL de cada plantilla de ADN. Para cada reacción, se usó 1 μL de Candida albicans gDNA
como control positivo y 1 μL de agua de grado PCR como control negativo. Se utilizaron las siguientes condiciones de
termociclado: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 38 ciclos consistentes en desnaturalización
(94 ° C durante 45 s), recocido (50 ° C durante 30 s) y extensión (72 ° C durante 90 s), con un paso de extensión final a 72
° C durante 10 min. Se realizaron amplificaciones duplicadas para cada reacción, luego se agruparon para dar un volumen
total de 50 μL. Se corrieron dos microlitros de cada amplificación de PCR agrupada en un gel de agarosa al 1% (p / v) que
contenía tinción de gel de ADN seguro SYBR (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EE. UU.).

Preparación de amplicones de PCR para secuenciación illumina miSeq. Para cada uno de los genes de ARNr 16S agrupados
y los amplicones ITS1, se purificaron 40 μL usando perlas magnéticas AMPure XP (Beckman Coulter Inc., Beverly, MA, EE.
UU.) Hasta un volumen final de 20 μL en agua estéril. La concentración de ADN se midió para todas las muestras purificadas
utilizando el kit dsDNA de alta sensibilidad (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, EE. UU.) En el fluorómetro Qubit1 1.0. Los
amplicones purificados se sometieron a controles adicionales de calidad y cantidad antes de la secuenciación en la
plataforma MiSeq Illumina, realizada por el Centro de Genómica, Proteómica y Metabolómica a través de New Zealand
Genomics Ltd en la Universidad de Auckland. Los datos de secuencia se cargaron en el Archivo de lectura de secuencia de
NCBI, con el número de acceso SRP079075

Asignación taxonómica y análisis de diversidad bacteriana.

Las secuencias sin procesar se procesaron utilizando la tubería UPARSE y QIIME 1.9 [21, 22]. Brevemente, las lecturas de
ARNr bacteriano 16S hacia adelante y hacia atrás se fusionaron con una longitud mínima de fusión de 200 pb, luego se
filtraron simultáneamente para eliminar los tonos únicos y las quimeras en UPARSE [21]. Las muestras se enrarecieron a
6000 lecturas y se calcularon las métricas de diversidad alfa ("especies observadas", Chao1, Shannon, Simpson) en QIIME
1.9 [22]. Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se definieron con base en una similitud de secuencia del 97%, y la
taxonomía se asignó a OTU individuales a través del clasificador del Proyecto de Base de Datos Ribosomal (RDP) utilizando
la Base de Datos del Microbioma Oral Humano (HOMD) [23]. Se usaron secuencias FASTA alineadas para construir un árbol
filogenético utilizando el comando make_phylogeny.py en QIIME 1.9 para las medidas de diversidad beta posteriores
basadas en filogenética. Las matrices de disimilaridad (UniFrac ponderado, UniFrac no ponderado y Bray-Curtis) se
generaron en QIIME 1.9 y se visualizaron a través de gráficos de escalamiento multidimensional (MDS) construidos en
PRIMER v6 [24]. Las tres mediciones de diversidad beta produjeron resultados similares, y elegimos utilizar la métrica
UniFrac no ponderada para comparar la diversidad beta debido a su éxito anterior en distinguir comunidades microbianas
humanas con un tamaño de muestra pequeño [25].

Asignación taxonómica y análisis de diversidad fúngica.

Secuencias ITS1 fúngicas también se procesaron utilizando la tubería UPARSE y QIIME 1.9 [21, 22]. En resumen, las lecturas
de ITS1 de hongos hacia adelante y hacia atrás se fusionaron en la tubería UPARSE utilizando el comando USEARCH
fastq_mergepairs con una longitud de fusión mínima de 100 pb [21]. Las secuencias se filtraron con un umbral de
abundancia de más de cuatro recuentos de secuencias, para excluir géneros raros [13]. Las muestras se submuestrearon
a 959 lecturas. La diversidad alfa se estimó en QIIME 1.9 utilizando las métricas de diversidad de "especies observadas",
Chao1, Shannon y Simpson [22]. La taxonomía se asignó usando el clasificador RDP con UNITE OTU v12_11 [26] como la
base de datos usando un umbral de similitud de secuencia del 97%, basado en el 75% de las especies fúngicas que
contienen 3% de variación intraespecífica ITS1 [10].

Análisis estadísticos de la calidad y el rendimiento del ADN.

Para comparar los datos cualitativos y cuantitativos de las extracciones de ADN a través de los cuatro métodos, se utilizó
un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar medias, con la prueba post-hoc de Tukey-Kramer para tener
en cuenta las comparaciones múltiples por pares. Para comparar la reproducibilidad de cada método, se determinaron
los coeficientes de variación para describir el porcentaje de variabilidad en el rendimiento de ADN en relación con la media
para cada método de extracción de ADN. Los análisis estadísticos se realizaron en Prism v6 para Windows (GraphPad
Software, La Jolla, CA, EE. UU.).

Análisis estadísticos de datos de secuencia.

Para evaluar estadísticamente las diferencias en la abundancia relativa de OTU asignadas por taxones entre los métodos
de extracción de ADN, se utilizaron pruebas t de dos colas con ajuste de Bonferroni para múltiples comparaciones por
pares. El análisis de varianza multivariado permutacional (PERMANOVA) se realizó en PERMANOVA + en el software
PRIMER v6 y se usó para evaluar imparcialmente los datos multivariados. Los valores se obtuvieron utilizando la suma de
cuadrados de tipo III (parcial) con 9999 permutaciones de residuos bajo un modelo reducido.

Resultados y discusión

Influencia del método de extracción en la cantidad y calidad del ADN

Las imágenes de gel de agarosa revelaron la presencia de ADNg para todos los métodos de extracción tanto de placa como
de saliva. El método Q produjo la concentración más alta de ADNg por 100 μL tanto de la placa como de la saliva, mientras
que P arrojó la concentración más baja en ambos. Según las concentraciones de Qubit normalizadas (media ± SEM), se
detectó una diferencia significativa en el rendimiento de ADN de la placa y la saliva cuando se comparó Q (4,87 ± 0,79 ng
/ μL) por separado con cada uno de los tres métodos de extracción de ADN restantes (Fig. 1). Se demostró previamente
un enfoque enzimático para mejorar la extracción de ADNg de la saliva, en comparación con la lisis mecánica [8]; Esto es
consistente con el mayor rendimiento de ADNg obtenido utilizando el método Q en nuestro estudio, pero no es cierto
para el enfoque P. Por lo tanto, estos resultados cuantitativos pueden tener en cuenta la selección del método cuando se
requiere ADNg para múltiples aplicaciones posteriores. Los coeficientes de variación (CV) calculados para cada método
dentro del tipo de muestra indicaron que todos los métodos eran reproducibles para el rendimiento de ADN de ambas
placas (M = 40%, Q = 28%, Z = 10%, P = 59%) y saliva (M = 18%, Q = 28%, Z = 15%, P = 19%).

La pureza del ADN se evaluó a través de los cuatro métodos utilizando los valores combinados promedio de placa y saliva
NanoDrop1. En general, las Mextraction medias (± SEM) produjeron las proporciones más altas de A260 / 280 nm (2.28 ±
0.27), significativamente más altas que los otros tres métodos de extracción de ADN: Q (1.72 ± 0.04), Z (1.57 ± 0.03) y P
(1.56 ± 0.06), sin embargo, el rango de la relación MA260 / 280 nm fue mayor que la relación 1.8 ± 2.0 generalmente
aceptado como indicativo de ADN puro [27]. Las relaciones promedio de A260 / 230 nm indicaron que los métodos P (1.88
± 0.14) y Q (1.77 ± 0.14) tenían significativamente menos arrastre residual que los métodos M (0.92 ± 0.21) y Z (0.72 ±
0.05).

La diversidad y composición bacteriana y fúngica en la placa es comparable entre los cuatro métodos de extracción de
ADN.

Las 12 muestras de placa agrupadas (n = 4 métodos X n = 3 repeticiones) arrojaron un total de 238,945 lecturas únicas de
la secuencia del gen 16S rRNA (longitud promedio 456 pb). Después de la eliminación de las quimeras (0.9% de secuencias
únicas), la selección OTU de novo de las secuencias restantes arrojó 325 OTU únicas. La secuenciación de amplicones ITS1
de las mismas 12 muestras de placa arrojó un total de 47,352 lecturas únicas, con una longitud promedio de 256 pb.
Después de la eliminación de las quimeras (5.4% de secuencias únicas), la selección de OTU de novo devolvió 22 OTU
únicas.

Las comparaciones múltiples por pares entre los métodos de extracción de ADN no revelaron diferencias significativas en
la riqueza y uniformidad de especies bacterianas y fúngicas para las muestras de placa entre los métodos (Tabla 2). La
diversidad fúngica en la placa fue mucho más baja que la diversidad bacteriana, con un número medio de OTU observadas
que oscilaron entre 2.37 ± 3.07 para hongos y 197 ± 202 para bacterias, para los cuatro métodos (Tabla 2). Además, el
análisis de PERMANOVA de los perfiles de la comunidad bacteriana de la placa enrarece a 6,000 secuencias por muestra
para UniFrac no ponderado reveló que el método de extracción de ADN no estaba generando diferencias significativas en
los perfiles de la comunidad bacteriana (Fig. 2A). Estos resultados sugieren que los cuatro métodos de extracción de ADN,
con diferentes enfoques de lisis celular, no tienen un impacto significativo en la diversidad microbiana en la placa y están
de acuerdo con los hallazgos anteriores de que el método de extracción de ADN no es un factor influyente en la
composición de la comunidad de la placa [9].

La abundancia relativa de OTU asignadas por taxones bacterianos y fúngicos individuales identificados dentro de la placa
no difirió significativamente en ninguno de los cuatro métodos de extracción de ADN. Las secuencias asignadas a los
géneros bacterianos Capnocytophaga, Fusobacterium, Leptotrichia, Prevotella, Selenomonas y Streptococcus
representaron las mayores abundancias relativas en placa para cada método y estos géneros se recuperaron en _ 5% de
la comunidad bacteriana de la placa en todas las réplicas de cada método (Fig. 3A ) Además, Corynebacterium
comprendió> 5% de la comunidad de placas de M replicados y métodos Z, mientras que Veillonella se encontró en> 6%
en los métodos Q y P. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos que informaron estos géneros como
miembros de la comunidad de placa dental bacteriana [2, 28]. Los géneros presentes en _ 1% se recuperaron
constantemente de la placa mediante los cuatro métodos de extracción de ADN, incluidos los géneros periodontales
asociados a la enfermedad Porphyromonas, Tannerella y Treponema [4].

Los perfiles de la comunidad fúngica de la placa estaban estrechamente relacionados entre los cuatro métodos de
extracción de ADN, lo que indica una capacidad comparable de los cuatro enfoques para extraer ADN fúngico de la placa.
El micobioma de la placa estaba dominado casi en su totalidad por especies de Candida, con> 99% de secuencias para
todos los métodos asignados a este género (Fig. 3B). La coincidencia más cercana (100% de identidad de secuencia) a
través de NCBI BLAST indicó que C. albicans era la especie dominante en este género, en los cuatro métodos [29]. Otras
especies también identificadas dentro de este género incluyen C. dubliniensis y C. tropicalis, aunque fueron menos
abundantes. Dada la actual falta de datos disponibles sobre el micobioma en placa, no existen otros estudios basados en
secuenciación ITS1 contra los cuales podamos validar nuestros resultados. Nuestra comprensión del micobioma oral se ve
obstaculizada por los obstáculos inherentes que se enfrentan al estudiar comunidades fúngicas.

Varios factores contribuyen a la falta general de estudios de micobiomas orales humanos, entre ellos: la necesidad de
bases de datos bien curadas comparables a las utilizadas para estudios basados en el gen 16S rRNA bacteriano, el uso
variable de cebadores dirigidos a diferentes regiones del operón ITS entre estudios, y la alineación poco confiable de estas
secuencias ITS dirigidas. Sin embargo, un estudio basado en el gen 18S Rrna identificó a C. albicans como la especie
dominante en la placa subgingival de pacientes VIH + con bajas cargas virales y altos niveles de CD4, lo que puede respaldar
los hallazgos actuales [30].

Efecto del método de extracción de ADN en comunidades microbianas en saliva

Las reacciones purificadas de las 12 muestras de saliva agrupadas amplificadas con cebadores de dirección del gen 16S
rRNA (n = 4 métodos X n = 3 repeticiones) arrojaron un total de 360,337 secuencias (221,370 únicas), con una longitud
promedio de 459 pb. Las quimeras (1.1% de las lecturas únicas) se eliminaron y la selección OTU de novo de las secuencias
restantes arrojó 201 OTU únicas. La secuenciación de los amplicones ITS1 de las mismas 12 muestras de saliva arrojó un
total de 143,832 secuencias (19,694 lecturas únicas, longitud promedio 287 pb), con un rango de 11 a 86,096 secuencias
por muestra.

La eliminación de quimera (0.1% de las lecturas únicas) y la selección de OTU de novo devolvieron 92 OTU únicas.

De manera similar a la placa, las comparaciones múltiples por pares de los cuatro métodos de extracción de ADN no
arrojaron diferencias significativas en el número de OTU observadas en comunidades bacterianas de muestras de saliva.
El método Z produjo el mayor número de OTU bacterianas observadas (122 ± 1.40), seguido de los métodos Q (121 ±
2.50), M (120 ± 0.73) y finalmente P (112 ± 2.10). No hubo diferencias significativas en los índices de diversidad de Chao1,
Shannon o Simpson (Tabla 2).

El análisis de PERMANOVA de los perfiles de la comunidad bacteriana de la saliva enrarecidos a 6,000 secuencias por
muestra para UniFrac no ponderado no mostró diferencias significativas en los perfiles de la comunidad bacteriana en los
cuatro métodos de extracción de ADN

El umbral de rarefacción excluyó varias muestras de saliva de los análisis: 3 x Q, 2 x M y 1 x Z; El método P fue la única
técnica para producir un número adecuado de secuencias de las tres réplicas para los análisis de diversidad de hongos en
la comunidad. En consecuencia, las tres réplicas del método P obtuvieron el mayor número de OTU fúngicas observadas
de la saliva (23.2 ± 5.20), seguidas de M (14.5, n = 1) y Z (11.9 ± 0.90, n = 2). Las comparaciones por pares entre los métodos
de extracción de ADN para los índices de diversidad de hongos observados promedio, Chao1, Shannon y Simpson no
arrojaron diferencias significativas (Tabla 2).

Neisseria, Prevotella, Streptococcus y Veillonella dominaron la comunidad bacteriana presente en la saliva agrupada en
los cuatro métodos de extracción de ADN, con la abundancia relativa promedio de OTU asignadas a estos géneros dentro
de un método entre 7 ± 36% (Fig. 3C). Esto está de acuerdo con estudios previos que identificaron estos géneros como
miembros dominantes del microbioma bacteriano salival [31]. La recuperación de géneros que comprendían ≥ el 1% de la
comunidad bacteriana de la saliva en este estudio fue consistente en todos los métodos de extracción de ADN.

El micobioma salival se ve afectado por el método de extracción de ADN

El rendimiento de los tres kits comerciales de extracción de ADN no alcanzó el método de aislamiento de P al analizar el
micobioma salival. Varios factores podrían explicar esta observación. En primer lugar, dado que las levaduras y otros
hongos a menudo tienen una pared celular que es más difícil de lisar que las paredes celulares bacterianas, los kits
utilizados en este estudio pueden no estar optimizados para extracciones de ADN fúngico (aunque el nombre de al menos
uno de los kits implica lo contrario ) Además, dada la carga fúngica en la saliva de individuos sanos es incierta, la
sensibilidad de los kits comerciales para este estudio puede ser inadecuada.

Nuestros hallazgos utilizando el enfoque P indican que la comunidad fúngica en las 12 muestras de saliva agrupadas estaba
dominada por miembros del género Candida, que se encontró en > 50% en cada réplica. La abundancia relativa de
Penicillium fue del 6 al 19%, mientras que del 14 al 20% de las secuencias no pudieron identificarse a nivel de género.
Saccharomyces y Malassezia solo se encontraron en réplicas de P a <10% y <1%, respectivamente (Fig. 3D). Además, este
método no solo fue el único método de extracción de ADN para producir lecturas de secuenciación adecuadas para análisis
de diversidad fúngica, sino que fue el único método del que se aisló Malassezia (presente en todas las réplicas de saliva).
Según lo sugerido por Dupuy y sus colegas, es probable que la metodología de lisis celular tenga un efecto significativo en
la identificación de Malassezia como miembro de la comunidad fúngica en la saliva [13]. La presencia única de Malassezia
en las extracciones de P sugiere que este enfoque fue el único de los cuatro estudiados para detectar de manera confiable
este género en la saliva. Los datos obtenidos con el método P confirmaron la mayoría de los géneros de la comunidad
fúngica comunes a los dos únicos estudios previos del micobioma salival humano [11, 13]: Candida, Emericella, Lewia,
Malassezia y Saccharomyces se encontraron en al menos dos de las tres réplicas. , mientras que Cryptococcus se identificó
a partir de una sola réplica (Fig. 3D). A diferencia de los estudios anteriores, Cladosporium / Davidiella, Fusarium /
Gibberella, Aureobasidium y Epicoccum estuvieron ausentes en todas las réplicas, aunque Epicoccum se identificó en
números bajos de dos de las tres réplicas de la placa P.

De las extracciones Z, las secuencias fúngicas asignadas al género Alternaria, un patógeno vegetal ubicuo, representaron
el 29% y el 48% de la abundancia relativa de la comunidad fúngica en dos réplicas (Fig. 3D). Candida fue el siguiente género
más abundante, con 15% y 18%. El cladosporium, un molde común en interiores y exteriores, comprendía el 10% de las
secuencias en una sola réplica, pero no se encontró en ninguna otra muestra que cumpliera con el criterio de rareficación
en los cuatro métodos de extracción de ADN. Las secuencias no asignadas constituyeron el 9% y el 18% de la abundancia
relativa en las dos réplicas Z.

La única réplica de M para cumplir con nuestro umbral de rarefacción estuvo dominada en gran medida por Xeromyces
(77%), un molde de descomposición de alimentos, que no estaba presente en las réplicas de los otros métodos. Además,
Candida y Penicillium constituyeron solo el 0.7% y el 0.1% de las abundancias relativas respectivas, y las secuencias a las
que no se asignó la identificación a nivel de género constituyeron el 23% (Fig. 3D).

La calidad y el rendimiento del ADN extraído de C. neoformans ATCC® 32045TM y P. chrysogenum ATCC® 10002TM no
es significativamente diferente entre los enfoques de extracción de ADN

Dada la variación en los datos del micobioma salival entre los métodos, la capacidad de los cuatro enfoques de extracción
de ADN empleados aquí para extraer ADN fúngico justifica la investigación. No se detectaron diferencias significativas en
el rendimiento del ADN o en las relaciones A260 / 280 nm y A260 / 230 nm en los cuatro métodos al intentar extraer ADN
fúngico de C. neoformans ATCC1 32045TM y P. chrysogenum ATCC1 10002TM (Tabla S1). Sin embargo, estos datos
sugieren que ciertos enfoques de extracción son más eficientes que otros cuando se intenta extraer el ADNg de las células
fúngicas.

Conclusiones

Nuestra comprensión del microbioma oral en la salud y la enfermedad depende de la obtención de una descripción precisa
de la comunidad microbiana oral. Las muchas variaciones en la metodología de extracción de ADN y los pasos de curación
de secuencia que ocurren entre laboratorios disminuyen la consistencia y la comparabilidad entre los estudios, y pueden
confundir los resultados. Aquí, examinamos cómo los diferentes enfoques de extracción de ADN influyen en nuestra
evaluación de las comunidades microbianas orales al comparar la diversidad y composición bacteriana y fúngica utilizando
diferentes protocolos de extracción de ADN.

Nuestros hallazgos sugieren que la calidad general y el rendimiento del ADNg están influenciados por el enfoque de
extracción de ADN. El enfoque enzimático empleado por el Qiagen QIAamp1 DNA Mini Kit produjo ADNg de buena calidad
con un rendimiento significativamente mayor en comparación con los otros tres métodos de extracción de ADN. La
diversidad de comunidades bacterianas en la placa y la saliva no se vio afectada en gran medida por el método de
extracción de ADN, sin diferencias significativas en la abundancia relativa de OTU asignadas por taxones en los cuatro
métodos de extracción de ADN. La evaluación de la diversidad del micobioma de la placa agrupada tampoco logró
identificar discrepancias entre los métodos de extracción de ADN, sin embargo, como esta comunidad era> 99% de
especies de Candida, la diversidad de nuestro homogeneizado puede haber sido inadecuada para una comparación
rigurosa de los métodos.

El método de aislamiento de ADN basado en fenol: cloroformo probado fue el único de los cuatro métodos de extracción
de ADN evaluados para producir secuencias fúngicas suficientes para el análisis de las tres réplicas de saliva. Esto refuerza
la importancia de seleccionar un método de extracción de ADN apropiado para estudiar las comunidades microbianas
orales, que debe guiarse por su capacidad para producir datos suficientes y precisos que aborden la pregunta de
investigación.