Colección y Conservación de Microorganismos

Andrés Marmolejo a, Vanessa Amazo b, Victoria Pineda c

a, b y c Facultad de Ingeniería, Universidad Icesi, Santiago de Cali, Colombia

Octubre 13 de 2017
1. Resumen
Las colecciones microbianas son depósitos de microorganismos que presentan características
nuevas o de importancia potencial para la salud o la industria, en ellas se asegura su
preservación, mantenimiento y disponibilidad. Por consiguiente, en esta práctica se realizó
la conservación y el control de diferentes cepas bacterianas de Saccharomyces y Escherichia
coli, para esto se realizaron dos metodologías de conservación de cepas de referencia y
aisladas, ambas con el objetivo de verificar la pureza del cultivo. Por otro lado, se realizaron
siembras en superficie y conteo en camara, para todas las diluciones de Saccharomyces en
agar sabouraud y de Escherichia coli en agar MACCONKEY.
Por último, se estudió la importancia de las colecciones microbianas y su contribución como
material de referencia. También se reconocieron diferentes métodos de conservación
microbiana que se han empleado en centros de colección de microorganismos como el
subcultivo repetido, conservación en perlas de agar, criopreservación, liofilización, entre
otros.

2. Palabras claves

Colección, Conservación, Recuento, E. coli, S. cerevisiae.

3. Introducción
La Escherichia coli, es una bacteria bacilo gramnegativa que generalmente se encuentra en
el tracto gastrointestinal de humanos y algunos animales. La E. coli es una bacteria anaerobia
facultativa comensal, que hace parte de la familia de las enterobacterias, ésta se caracteriza
por ser un organismo patógeno, produciendo infecciones gastrointestinales en humanos. La
Escherichia coli en humanos puede actuar como una bacteria comensal formando parte de la
microbiota intestinal, ayudando a la absorción de nutrientes. Sin embargo, se pueden
encontrar algunas cepas patógenas pueden iniciar una infección en un paciente
inmunodeprimido. En algunos estudios para el aislamiento e identificación de la E. coli, se
han tomado muestras a 37°C en un medio selectivo en condiciones aeróbicas, en un medio
de agar MacConkey, debido a que las enterobacterias pueden ser diferenciadas para su
caracterización por características morfológicas. Debido a estas características, para la
tinción de Gram realizada en la práctica, la E. coli se decolora y se contratiñen de rosado con
fucsina, confirmado que se trata de esta bacteria gram negativa. (Poolman, 2016)
Por otro lado, la Saccharomyces cerevisiae es un tipo de levadura que es empleado mucho
en la industria para la obtención de diferentes productos como la cerveza, el pan y vino. Éste
puede estar constituido de dos formas alternas del ciclo de vida, una haploide y otra diploide.
Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. S. cerevisiae es uno de los
modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos, ya que su crecimiento es
rápido y la replicación de cultivos y aislamientos posee gran facilidad. Además, la ausencia
de patogenicidad permite una manipulación sencilla. En este caso, al ser un tipo de levadura
tiene una constitución de polisacáridos y glicoproteínas, de tal forma la clasificación como
Gram positiva o Gram negativa no aplica para estos microorganismos. (Gonzalez, 2015)
En este orden de ideas, cabe mencionar que estas dos bacterias trabajadas, son uno de los
más utilizados como modelos para muchos avances. En primer lugar, E. coli, es un organismo
que hoy en día, ha sido explotado en campos como la ingeniería genética, algunas de sus
aplicaciones son: amplificación para obtener muchas copias de un fragmento de ADN,
fabricación de proteínas recombinantes a gran escala, como la insulina. Plásmidos de interés
para fines de antibióticos, como vectores de clonación, vectores de expresión. Indicador de
microorganismos contaminantes y patógenos y por último es empleada en la producción de
lactato (Bacillus subtilis) y sobreproducción de genes para la producción de etanol con
Zymomonasmobilis.

Ahora bien, en torno a Saccharomyces cerevisiae, esta bacteria desde la antigüedad se ha

caracterizado por ser la precursora de la producción de pan, vino, cerveza entre otros. Por
ende, los estudios realizados sobre esta han sido de gran abundancia ya que es considerada
un modelo biológico de organismos eucariotas. Entre las aplicaciones más relevantes de esta
cepa, se encuentra en alimentos, productos farmacéuticos, probioticos y bioetanol.
Saccharomyces boulardii, es una bacteria perteneciente al género Saccharomyces, la cual ha
sido de gran importancia para la terapia con antibióticos con el objetivo de detener la diarrea,
como la diarrea infecciosa, la diarrea asociada con antibióticos y la diarrea asociada con el
VIH. (Uriel, 2009)

En los últimos años, la producción de productos químicos industriales por microorganismos

ha recibido una mayor atención. Actualmente los microorganismos son utilizados como
herramienta biotecnológica en áreas muy diversas como producción de alimentos
fermentados, tratamiento de efluentes industriales, obtención de metabolitos secundarios,
entre otras aplicaciones. Después de un tiempo utilizando un microorganismo este comienza
a sufrir variaciones genéticas que afectan la calidad del producto produciendo perdidas en las
industrias. Por tal razón, al conservar los microorganismos en colecciones se crean depósitos
de recursos biológicos que constituyen una manera importante para conservar la
biodiversidad y favorecer a estudios posteriores sobre los microorganismos. En los últimos
años, se han formado diferentes organizaciones a nivel nacional e internacional para la
creación de ceparios que implementan técnicas de preservación de estos microorganismos
con el objeto de tenerlos disponibles y viables para el uso de sus características y propiedades.
Por esta razón, se realizó una conservación de cepas de bacterias de Saccharomyces y
Escherichia coli, haciendo énfasis en la gran importancia que tiene el estudio y el
reconocimiento de éste campo para la comunidad científica. (González, 2013)

La preservación de los microorganismos por desecación ha sido el método preferido para el

almacenamiento a largo plazo de microorganismos desde hace décadas. Muchos
microorganismos mueren porque los medios de cultivo en los que se aíslan se secan. Sin
embargo, algunas bacterias que al secarse forman esporas pueden ser preservadas durante
años usando el método de desecación. No obstante, para obtener resultados deseados es
necesario tener en cuenta el medio en el cual se va a utilizar la desecación del
microorganismo. La conservación y control de calidad de cepas bacterianas de
Saccharomyces y Escherichia coli se llevó a cabo por el método de congelación empleando
glicerol como crioprotectante. Este método consiste en congelar las células en suspensión en
un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados
centígrados, con lo que el agua se congela, y al no disponer las células de agua en forma
líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se
recuperan subiendo la temperatura.

Los agentes crioprotectante (ACP) son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que
impiden por interacción molecular con el agua la acción destructiva del congelamiento sobre
las células, por lo que lo protegen de la formación de cristales de hielo. Existen dos clases de
crioprotectantes, los penetrantes y los no penetrantes. Estos primeros, son pequeñas
moléculas capaces de atravesar membranas celulares, pueden reducir la acumulación del
hielo y la deshidratación celular durante la congelación. Por otro lado, los crioprotectantes
no penetrantes son de alto peso molecular, además, ejercen la acción crioprotectante
promoviendo la rápida deshidratación celular. Para este laboratorio, el crioprotectante es el
glicerol, un soluto poli hidroxilado pequeño con una alta solubilidad en agua y una baja
toxicidad, este puede penetrar la membrana plasmática de las células, aunque trabaja de una
manera lenta. La viscosidad del glicerol es otra propiedad que puede inhibir el crecimiento
de cristales de hielo cuando se desciende la temperatura. También puede disminuir en estrés
osmótico intracelular resultante de la deshidratación. (Macas, 2016)

El con el objetivo de realizar un control de calidad sobre las cepas bacterianas escogidas, se
calculó el porcentaje de viabilidad de los cultivos, determinada por recuento en placa de las
diluciones que se hacen a partir del vial, obteniendo un resultado asertivo, ya que cumple con
los requerimientos de la IBUN. De cierta manera, este porcentaje puede verse afectado por
diferentes factores como la velocidad en la congelación y descongelación, la adecuada
temperatura de almacenamiento, el correcto empleo del agente crioprotectante, entre otras.
Este tipo de estudios son de gran relevancia, ya que determina los estándares de calidad de
las colecciones en los diferentes centros de colección. Como se mencionó anteriormente, el
papel de las colecciones microbianas, tanto a nivel industrial, como en el estudio de los
microorganismos tiene una gran transcendencia en estos aspectos.

4. Materiales y métodos

Se obtuvo una cepa reactivada de Saccharomyces y Escherichia coli las cuales habían
sido conservadas por un mes. Se tomó 1 mL de la cepa Saccharomyces cerevisiae y 1 mL
de la cepa de Escherichia coli y se adicionaron en 9 mL de solución salina estéril 0.85%
(p/v). A continuación, se realizaron seis diluciones seriadas en base 10 en 9 mL de
solución salina estéril 0.85% (p/v). Posteriormente, se realizó tinción de Gram a las
diluciones de 10-1 de ambas cepas así: se adicionó una gota de cada disolución sobre una
lámina porta objetos y se dejó secar, se adicionó 10 gotas de cristal violeta, solución
Lugol, alcohol acetona y por ultimo fucsina (entre la adición de cada reactivo se esperó
1 minuto y se hizo un lavado con agua destilada); y se procedió a la caracterización
microscópica enfocando con el objetivo 100X. Por otro lado, se realizaron siembras en
superficie para todas las diluciones de Saccharomyces cerevisiae en agar Sabouraud y de
Escherichia coli en agar MACCONKEY, y se dejaron incubar durante 48 horas a una
temperatura de 35°C. Finalizado el tiempo de incubación se realizó el recuento de
colonias para ambas cepas.
5. Resultado y discusión

Una vez finalizado el tiempo de incubación para ambas cepas, se procedió a realizar el
recuento de colonias para ambas cepas correspondientes al mes 1 haciendo uso de la
ecuación 1, siendo incontable para todas las disoluciones de E. coli y obteniéndose 1.01
x 106 UFC/mL para la disolución correspondiente al factor de dilución 10 -3 de S.
cerevisiae. Los resultados obtenidos para los diferentes tiempos de conservación se
muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Recuento de S. cerevisiae y E. coli.

Tiemp Recuento Log UFC Porcentaje de
o S. cerevisiae E. coli S. cerevisiae viabilidad
(meses) (UFC/mL) (UFC/mL)
0 1.2 x 108 1.2 x 105 8.01 100
1 1.01 x 106 Incontable 6.004 74.3
6
3 2.7 x 10 Incontable 6.4 79.3
6 1.4 x 107 Incontable 7.1 87.9
6
9 4.5 x 10 Incontable 6.6 81.7
12 5.9 x 106 Incontable 6.7 83
7
18 1.7 x 10 Incontable 7.2 101.6

Considerando que el agar MACCONKEY contiene sales biliares y cristal violeta que
inhiben a bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas que no pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae, y el agar Sabouraud presenta alto contenido de glucosa y
bajo pH, favoreciendo el crecimiento de hongos, como levaduras, sobre el de bacterias,
(RODRIGUEZ, 2007) se tiene la certeza de que las colonias contadas pertenecen a las
cepas de E. coli y S. cerevisiae.

En este orden de ideas, una vez realizados todos los recuentos de colonias, se obtuvo el
logaritmo en base 10 de todos los datos para facilitar su análisis y se procedió a calcular
el porcentaje de viabilidad haciendo uso de la ecuación 2. Una vez realizados todos los
cálculos previos, resulta evidente la carencia de sentido lógico de los datos obtenidos ya
que, en los meses 6 y 18 se reporta mayor número de unidades formadoras de colonias
por mililitro que en los meses 1, 3, 9 y 12. Algunas posibles explicaciones sobre este
hecho son: en primer lugar, la mala realización de las diluciones. En segundo lugar,
errores en la técnica de siembra en superficie. En tercer lugar, la contaminación de la
cepa con otros microorganismo durante el desarrollo de la práctica. Por último, la
conservación o reactivación de ambas cepas se realizó a condiciones incorrectas.

El porcentaje de viabilidad de un cultivo se determina por recuento en placa de las

diluciones que se hacen a partir del vial. Este conteo se expresa como UFC/mL, y se
compara los resultados obtenidos, con el recuento obtenido previo a la preservación de la
cepa. Es necesario tener en cuenta que la muerte celular en la mayoría de los métodos de
preservación, ocurre el proceso y el tiempo inicial de almacenamiento. Es importante
establecer un nivel de expresión de las características, que refleje las condiciones
aceptables del cultivo. En el instituto de biotecnología de la Universidad Nacional de
Colombia (IBUN), con relación a la viabilidad celular, se ha establecido que un recuento
menor a 1x 103 UFC/mL es considerado como insuficiente y por lo tanto se debe
conservar nuevamente la cepa (TEDESHI, 2011).

Teniendo en cuenta que el tiempo de conservación de las cepas asignadas al grupo de

trabajo fue de un mes, es decir, las cepas con menor tiempo de conservación, y basándose
en que el porcentaje de viabilidad es del 74.3%, se puede considerar que la conservación
de la cepa de S. cerevisiae durante el primer mes fue exitosa, ya que: (1) cumple con los
estándares del IBUN, (2) fue la única cepa a la que fue posible realizar un conteo.

Ahora, los recursos microbiológicos son la materia prima esencial para el avance de la
tecnología, las ciencias de la vida, el desarrollo de medicamentos farmacéuticos, agentes
agroquímicos, biocontroles, cosméticos y productos industriales. Además, con el
surgimiento de los medios de cultivo para el crecimiento y el éxito de los primeros
aislamientos de microorganismos, se marcó la necesidad de preservarlos para el futuro.
(CASTAÑEDA, 2015). Dada esta importancia, la baja viabilidad de una cepa afectaría
la reproducibilidad y la producción de un proceso industrial ya que la industria misma
tendría que invertir más recursos en la conservación de la cepa o esta no será óptima para
llevar a cabo dicho proceso, produciendo perdidas económicas en ambos sentidos.

Por otro lado, una vez realizada la tinción de Gram para las disoluciones correspondientes
a 10-1 de ambas cepas se procedió a realizar su descripción microscópica utilizando el
objetivo 100x de un microscopio, como se enseña en la Tabla 2. Teniendo en cuenta que
la mayoría de bacterias Gram positivas la pared celular está compuesta por varias capas
de peptidoglucano que conforman una estructura gruesa y rígida. La pared celular de las
bacterias Gram negativas contienen solamente un capa delgada de peptidoglucano. En el
proceso de tinción, las bacterias Gram positivas retienen el colorante violeta luego de un
proceso de decoloración con éter-acetona y, por lo tanto, se ven teñidas de este color, en
tanto, las Gram negativas se decoloran y se contratiñen de rosado con fucsina.
(TORTORA, 2007) Como se puede observar en la Figura 2, la coloración de la S.
cerevisiae es rosa, por lo tanto, se trata de una bacteria Gram negativa. Por otro lado, la
pared celular de la levadura está constituida por polisacáridos y glicoproteínas en forma
de una red tridimensional (MORALES, 2007) y en consecuencia, la clasificación como
Gram positiva o Gram negativa no aplica para estos microorganismos. Aun así, se llevó
a cabo la tinción de Gram con el objetivo de visualizar mejor morfología microscópica
de la muestra.

Tabla 2. Tinción de Gram de S. cerevisiae y E. coli

Tiempo Tinción de Gram
(meses) S. cerevisiae E. coli
0 Levaduras con presencia de cocos Bacilos Gram negativos, Cocos
Gram positivos. Predomina la Gram positivos. Se observó una
morfología de las levaduras. mayor de población de cocos con
respecto a los bacilos.
1 Únicamente levaduras de forma Varios bacilos Gram negativos.
ovalada y coloración violeta. Figura 2.
Figura 1.
Comparando la descripción microscópica realizada correspondiente al mes 1 con la
descripción suministrada para el mes 0, resulta evidente la ausencia de cocos Gram
positivos en las muestras correspondientes al mes 1. Teniendo en cuenta la metodología
empleada descrita en la guía de laboratorio, ambas cepas se conservaron en caldo
CASOY estéril y utilizando glicerol como crioprotectante a una temperatura entre los -
20 y 196°C. La conservación de bacterias Gram positivas y Gram negativas es posible
llevarla a cabo en glicerol si se realiza a temperaturas entre -70 y 196°C (temperaturas
obligatorias para Gram negativas), además la duración del almacenamiento varia de 2 a
30 años. (TEDESCHI, 2011) Por tanto, la presencia de E. coli indica que la conservación
se llevó a cabo entre este intervalo de temperatura y que la ausencia de las bacterias Gram
positivas en el mes 1 se debe a otros factores. En adición, una posible explicación de lo
observado es el hecho de que la muerte celular en la mayoría de los métodos de
preservación ocurre en el proceso y el tiempo inicial de almacenamiento. (TEDESCHI,
2011)

Por otra parte, el chequeo de bancos de células en general se basa en la identidad, pureza
del cultivo y estabilidad genética. La confirmación de la identidad como especie y del
genotipo-fenotipo puede incluir: análisis del crecimiento en medios selectivos,
requerimientos nutricionales, resistencia a antibióticos y caracterización bioquímica;
porcentaje de células que portan el plásmido de interés; número de copias del plásmido;
secuencia de ADN plasmídica y caracterización de los mismos por restricción. La pureza
se determina mediante la demostración de la presencia de contaminantes bacterianos y
fúngicos; la estabilidad genética se comprueba comúnmente por verificación de
mutaciones listadas en los fenotipos. En tal caso que las sepas presenten contaminantes,
estas se llevan a purificación en un medio selectivo y se realizan repliques sucesivos hasta
la adaptación del metabolismo de los microorganismos en el nuevo medio.

5.1 Figuras e Imágenes

Figura 1. Cepa de Saccharomyces Figura 2. Cepa de Escherichia coli

cerevisiae conservada durante un mes. conservada durante un mes.
 5.2 Fórmulas matemáticas

𝑁 = ∑ 𝑐 × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 10 Ec. 1

Siendo: c: número de colonias.

𝐥𝐨𝐠 𝑼𝑭𝑪
% 𝒗𝒊𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 = 𝐥𝐨𝐠 𝑼𝑭𝑪 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍 × 𝟏𝟎𝟎 Ec. 2
𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍

Siendo: UFC: unidades formadoras de colonias.

6. Conclusiones
• Dados los resultados, no resulto posible realizar un control de calidad para la cepa
conservada de E. coli.
• El método de conservación para la cepa de S. cerevisiae utilizando glicerol como
crioprotectante es viable, por lo menos durante el primer mes.
• Dados los resultados obtenidos, no es posible determinar si el método de
conservación para las cepas de S. cerevisiae y E. coli utilizando glicerol como
crioprotectante es viable hasta los 18 meses.
• Es posible conservar levaduras y bacterias Gram negativas utilizando glicerol
como crioprotectante.
7. Referencias

Bibliografía
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