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a
Ingeniero Físico, Universidad Nacional de Colombia sede Manizales.
b
Ingeniero Químico, Ph.D. Programa de Ingeniería Ambiental, Universidad Católica de Manizales.
c
Microbiólogo, Ph.D. Departamento de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia sede Manizales.
Resumen
La liofilización es un método ampliamente utilizado para la conservación de microorganismos debido a que permite que estos manten-
gan su viabilidad a temperatura ambiente por largos períodos de tiempo con una buena estabilidad genética. Dado que es un proceso
físico de deshidratación, donde el agua pasa por diferentes fases, las células pueden verse afectadas estructuralmente disminuyendo su
viabilidad. Es por esto que es muy importante el uso de agentes lioprotectores y condiciones de liofilización adecuadas para cada tipo
de microorganismos. En este artículo se analizan cuatro formulaciones de lioprotectores reportadas en la literatura para la conservación
de levaduras y bacterias, comprobando el efecto lioprotector de la leche descremada más trehalosa en cepas de Saccharomyces cerevisiae
y Pichia stipitis, así como de la miel de abejas en cepas de Bacillus megaterium y Cupriavidus necator, con porcentajes de viabilidad entre
85 % y 94 % después de la liofilización. Además, de establecer las mejores condiciones de liofilización para dichos microorganismos, se
presenta una discusión sobre las diferentes teorías del mecanismo de acción de los lioprotectores y su interacción con las células buscando
posibles explicaciones sobre el desempeño de los agentes lioprotectores utilizados (inositol, miel de abejas, leche descremada y trehalosa).
lioprotectores los cuales protegen a las células de producción de bioetanol, cerveza, pan y vino, gracias
los daños causados durante la liofilización. Algunos a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol
disacáridos (trehalosa, lactosa, maltosa y sacarosa) durante el proceso de fermentación (Madrigal et al.,
(Leslie et al., 1995; Muñoz-Rojas et al., 2006; Palmfeldt et 2013).
al., 2003), la leche descremada y diversos polialcoholes, Pichia stipitis: también conocido como Scheffersomyces
han mostrado gran eficacia como agentes lioprotectores stipitis, levadura empleada en la producción de etanol
(Berny y Hennebert, 1991; MacKenzie, 1977). a través de la fermentación de xilosa y producción de
Hasta el momento se han propuesto diferentes teorías ácido láctico (Martínez et al., 2008).
sobre el mecanismo de acción de los lioprotectores en Bacillus megaterium: bacteria Gram-positiva
las células liofilizadas. En el caso de los disacáridos, se utilizada en la producción de piruvato, vitamina B12,
plantea que estos protegen a las células al sustituir a las fármacos con propiedades fungicidas y antivirales,
moléculas de agua durante el proceso de liofilización enzimas y deshidrogenasas de aminoácidos y
(Leslie et al., 1995; Crowe et al., 2003). De esta forma polihidroxialcanoatos (Foster y Litchfield, 1964;
las células no pasan de su estado de cristal líquido a Naranjo et al., 2013).
la fase de gel y mantienen su estructura celular intacta Cupriavidus necator: también conocida como
(Leslie et al., 1995), lo cual posibilita que la membrana R a l s t o n i a e u t r o p h a , b a c t e r i a G r a m - n e g a t i va
no sufra rupturas durante el proceso de liofilización utilizada en la producción de biopolímeros de
y/o rehidratación. tipo polihidroxialcanoato (PHA), hidrogenasas e
La efectividad de los agentes lioprotectores varía de isobutanol (Foster y Litchfield, 1964; Naranjo, 2010).
acuerdo al microorganismo a preservar sin embargo,
aunque se han propuesto diferentes teorías sobre el Agentes lioprotectores a evaluar
mecanismo de protección de las diferentes sustancias, Cuatro medios de suspensión fueron evaluados
aún no hay un consenso en la literatura científica sobre como agentes lioprotectores, su composición expresada
el mecanismo de acción de estos agentes; por tanto, en % (p/v) en agua desionizada es la siguiente:
no hay una última palabra en cuanto a la designación
de un lioprotector efectivo para una cepa microbiana Miel de abejas 10 %.
determinada (Morales-García et al., 2010). Leche descremada en polvo 10 %.
En este artículo se analizan cuatro de los principales Trehalosa 10 %.
agentes lioprotectores en diferentes formulaciones Inositol 10 %.
reportados en la literatura para la conservación de las
bacterias Bacillus megaterium y Cupriavidus necator, así La elección de los agentes lioprotectores a evaluar y
como las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pichia su composición en peso volumen fueron determinadas
stipitis, por medio de liofilización, verificando su efecto por los datos reportados por Berny y Hennebert (1991)
en el porcentaje de viabilidad de estas cepas después de y Day y Staecy (2007), los cuales presentan estas
ser sometidas a un proceso de secado por liofilización. formulaciones y concentraciones específicas como
los mejores candidatos para agentes lioprotectores de
2. Materiales y métodos levaduras y bacterias.
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Viabilidad de levaduras y bacterias conservadas por liofilización: efecto de agentes lioprotectores
Al retirar el sobrenadante, se suspendieron los con base en un conteo celular, en cámara de Neubauer
microorganismos precipitados en 3 ml de las diferentes realizado para las levaduras, se efectuaron diluciones
formulaciones de liopreservantes a evaluar; las cuales de 1:10000 (10-4), 1:100000 (10-5), 1:1000000 (10-6) y
se esterilizaron previamente de la siguiente forma: la 1:10000000 (10-7) para cada formulación, las cuales se
leche descremada, la miel de abejas y una solución de sembraron por extensión en superficie utilizando un
inositol fueron esterilizadas por medio de autoclave a volumen de 0,15 ml en cajas de petri con agar extracto
115 oC por 15 minutos. Con la premisa de que tanto el de malta. Para la siembra de bacterias se mantuvieron
inositol como la trehalosa son compuestos termolábiles; las medidas de diluciones y de igual forma se
una segunda solución de inositol y la solución de sembraron por extensión en superficie utilizando un
trehalosa fueron esterilizadas por medio de filtración volumen de 0,15 ml en cajas de petri con agar nutritivo.
al vacío con membrana (tamaño de poro 0.2 µm). Para Los microorganismos se incubaron a 31 oC durante
diferenciar las dos soluciones de inositol, de ahora en 24 horas para levaduras y 48 horas para las bacterias.
adelante, se referenciará la solución esterilizada por Una vez crecidas las colonias, se realizó un conteo
medio de autoclave como inositol A 10 % y la solución de unidades formadoras de colonias (UFC) y se
esterilizada por filtración al vacío con membrana como procedió a calcular su concentración sobre mililitro
inositol M 10 %. (UFC/ml) mediante la ecuación 1.
Se procede a suspender los microorganismos en 3
ml de cada formulación, de los cuales se tomaron 0,5 Número de (1)
ml para su siembra en agar a fin de tener una referencia
inicial para medir su viabilidad después del proceso
de liofilización. Después del proceso de liofilización se rehidrata el
Los viales a liofilizar terminan con 2,5 ml contenido de los viales en 2,5 ml del medio en el que
de la formulación de lioprotector a evaluar con se creció previamente el microorganismo (extracto de
microorganismos suspendidos en ella, volumen malta para levaduras y caldo nutritivo para bacterias) y
elegido al mostrar los mejores resultados en el estudio se repite el mismo procedimiento descrito previamente
realizado por Berny y Hennebert (1991). para realizar el cálculo de UFC/ml.
El anterior procedimiento se realizó en cada Se calcula el porcentaje de viabilidad de los
microorganismo y en cada proceso de liofilización microorganismos en cada formulación de acuerdo a
efectuado, variando las formulaciones a evaluar la ecuación 2.
dependiendo del microorganismo.
(2)
Liofilización
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Luis C. Ávila Rincóna, Javier M. Naranjo Vasco, Juan C. Higuita Vásquez / Vector 10 (2015) 7-13
Tabla 1
Porcentajes de viabilidad de los 4 microorganismos liofilizados bajo el efecto de las 4 formulaciones de lioprotectores evaluadas
Miel 10 % - - - 91,33
Los espacios con el símbolo (-) indican que esa formulación no fue evaluada como lioprotector para dicho microorganismo.
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Viabilidad de levaduras y bacterias conservadas por liofilización: efecto de agentes lioprotectores
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Luis C. Ávila Rincóna, Javier M. Naranjo Vasco, Juan C. Higuita Vásquez / Vector 10 (2015) 7-13
los disacáridos puedan proteger una bicapa líquida es termolábil (sensible a cambios de temperatura), por
necesario que se encuentren a ambos lados de la capa; lo que la esterilización de la solución de inositol por
de igual manera para reemplazar las moléculas de agua medio de autoclave afectaría considerablemente las
dentro de la célula deben estos atravesarla, lo cual se propiedades físicas y químicas de este, teniendo como
consideraría poco probable, ya que los disacáridos resultado que su efecto como agente lioprotector
debido a su masa molecular son considerados agentes (esterilizado por este método) sea prácticamente nulo.
no penetrantes; es decir, que solo pueden ofrecer No obstante, este compuesto esterilizado por filtración
protección al exterior de la célula. Para ello, Israeli (1995) al vacío, a pesar de que muestra mejores resultados con
ofrece una explicación del mecanismo de penetración respecto a la solución esterilizada por autoclave, no
de los disacáridos durante el proceso de liofilización. Él presentó los resultados esperados de lioprotección para
postula que cuando las células comienzan a entrar en bacterias como sugiere la literatura; es decir, porcentajes
la transición de fase, la membrana se vuelve permeable de viabilidad cercanos al 80 % después de liofilización
y el disacárido fluye hacia el interior de las células y (Day y Staecy, 2007).
debido al poco tiempo antes de la congelación y el Una posible causa del pobre desempeño del
secado, así como a la gran cantidad de azúcar que entra inositol es que este polialcohol presenta nueve posibles
en la célula, la cantidad pérdida con el metabolismo es estereoisómeros, de los cuales el más común y más
extremadamente pequeña, por lo que pueden proteger extendido en la naturaleza es cis-1, 2, 3, 5, trans-4, 6,
de manera efectiva tanto a la membrana como a las ciclohexanohexol o mioinositol. Sin embargo, también se
estructuras celulares internas. Estas conclusiones las pueden encontrar en la naturaleza los isómeros naturales
determina Israeli (1995), observando el comportamiento scyllo-, muco-, D-chiro- y neo-inositol (González Alcaraz,
de células de E. coli (bacteria Gram-negativa) y B. 1991), de los cuales no se especifica en la literatura cual es
thuringiensis (bacteria Gram-positiva) con disacáridos el usado como agente lioprotector y puesto que el origen
(trehalosa y sacarosa) como protectores para el proceso y la clase de estereoisómero del inositol proporcionado
de liofilización. para este trabajo se desconoce, no se puede saber con
En el caso de los disacáridos evaluados en este certeza si fue el mismo estereoisómero empleado en la
trabajo, se presenta una acción similar en las cepas literatura de referencia.
bacterianas. Sin embargo se esperaría una mayor
diferencia en el efecto de los disacáridos en cada 4. Conclusiones
microorganismo procariota, ya que el B. megaterium
posee una pared celular tipo Gram-positiva la cual En este trabajo se determinaron las mejores
está conformada por una capa de peptidoglicano muy condiciones de liofilización y lioprotectores para la
gruesa (alrededor del 90 % de su estructura), diferente conservación de S. cerevisiae, P. stipitis, B. megaterium
a las de C. necator que presenta una pared celular tipo y C. necator. Para el C. necator no se encuentra mucha
Gram-negativa la cual consta de una bicapa líquida información sobre agentes lioprotectores y protocolos
formada por una capa fina de peptidoglicano adyacente para su conservación por liofilización en la literatura; por
a la membrana citoplasmática constituyendo solo el 10 lo que estos resultados son de gran valor. Se concluye
% de la pared celular y una capa adicional compuesta que la trehalosa y los carbohidratos presentes en la miel
de lipopolisacárido (Madrigan et al., 2003). de abejas muestran un muy buen desempeño como
Los resultados obtenidos muestran que la trehalosa lioprotectores en bacterias Gram-negativas y Gram-
10 % ofrece protección a bacterias sin importar su pared positivas con porcentajes de viabilidad alrededor del
celular, corroborando de esta manera el postulado 92 %; además ofrece una excelente protección para
de Israeli (1995) sobre el efecto de los disacáridos levaduras durante la liofilización ya que, con la adición
en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas con adecuada de leche descremada, mantienen la viabilidad
porcentajes de viabilidad de 92,24 % para el B. de las levaduras entre un 85 % y un 93 %. El proceso de
megaterium y de 85,33 % para el C. necator. liofilización implica fenómenos complejos que, incluso
En el caso del inositol, polialcohol que según Day después de décadas de investigación, no se comprenden
y Staecy (2007) sería un lioprotector efectivo para por completo porque cada nuevo estudio que se realiza
bacterias Gram-positivas, los porcentajes de viabilidad aporta elementos para entender los mecanismos
obtenidos en este trabajo fueron extremadamente bajos. de acción de los lioprotectores y el fenómeno de la
Para la solución de inositol esterilizada por autoclave el conservación por liofilización.
resultado tiene sentido, ya que el inositol es un producto
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Viabilidad de levaduras y bacterias conservadas por liofilización: efecto de agentes lioprotectores
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