Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

(2019) 12: 264

Wu et al. Biocombustibles biotecnolhttps://doi.org/
10.1186/s13068-019-1604-7 Biotecnología para biocombustibles

INVESTIGAR Acceso abierto

Regulación pleiotrópica de un PTS específico de

glucosa en Clostridium acetobutylicum
para la producción de butanol de alta eficiencia a partir de
rastrojos de maíz sin desintoxicación
Youduo Wu1, Yidi Bai1, Daojing Zhang2, Chi Cheng1, Lijie Chen1, Fengwu Bai3 y Chuang Xue1 *

Abstracto

Fondo: El rastrojo de maíz (CS) se evalúa como la materia prima candidata más favorable para la producción de butanol a través de la
fermentación microbiana de acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum. Mediante el pretratamiento ácido independiente y
la hidrólisis enzimática, se liberaron azúcares fermentables (principalmente glucosa y xilosa), de los cuales la glucosa fue utilizada
naturalmente como la fuente de carbono más preferida porC. acetobutylicum. Sin embargo, la fermentación ABE utilizando hidrolizado de
rastrojo de maíz (CSH) sin desintoxicación se limita típicamente a una mala utilización de azúcares, producción de butanol y productividad. En
presencia de inhibidores derivados del pretratamiento, el ATP intracelular y el NADH, como factores importantes implicados en el crecimiento
celular, el inicio de la solventogénesis y la respuesta al estrés, se ven sumamente desafiados debido a la alteración del sistema de glucosa
fosfotransferasa (PTS). Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar enfoques de ingeniería efectivos para superar estas limitaciones para la
producción de butanol de alta eficiencia a partir de CSH sin desintoxicación.

Resultados: Diseñado por PTS C. acetobutylicum Las cepas se construyeron mediante la sobreexpresión y la desactivación del gen. glcGque
codifica PTS IICBA específico de glucosa, que regula pleiotrópicamente la utilización de glucosa, el crecimiento celular, la solventogénesis y la
tolerancia a los inhibidores. El PTSGlcG-La cepa que sobreexpresa exhibió una alta eficiencia de fermentación, en la que la producción y
productividad de butanol fue de 11,1 g / L y 0,31 g / L / h, en comparación con las de 11,0 g / L y 0,15 g / L / h con el PTSGlcG-Cepa deficiente.
Durante el cultivo CSH sin desintoxicación, el PTSGlcG-La cepa que sobreexpresa exhibió inhibidores deseables, tolerancia y solventogénesis con
una producción de butanol de 10.0 g / L, aumentada en un 300% y 400% en comparación con las de 2.5 y 2.0 g / L con el control y PTSGlcG-cepas
deficientes, respectivamente. Como resultado del exceso de glucosa y 10 g / L de CaCO3 Además de CSH, la producción de butanol y la
productividad se maximizaron aún más a 12,5 g / L y 0,39 g / L / h. Estas mejoras validadas en el PTSGlcGLa cepa de sobreexpresión se atribuyó
no solo al transporte eficiente de glucosa, sino también a sus efectos en cascada sobre la generación de ATP y NADH intracelular, el inicio de la
solventogénesis y la tolerancia a los inhibidores en la fase de crecimiento exponencial.

Conclusión: El PTSGluG La regulación podría ser un enfoque de ingeniería eficaz para la fermentación ABE de alta eficiencia a partir de
hidrolizados lignocelulósicos sin desintoxicación o generación de aguas residuales, proporcionando información fundamental para la
producción de butanol económicamente sostenible con alta productividad.

Palabras clave: Clostridium acetobutylicum, Rastrojo de maíz, Regulación PTS, Tolerancia a inhibidores, Productividad del butanol

* Correspondencia: xue.1@dlut.edu.cn
1 Escuela de Bioingeniería, Universidad Tecnológica de Dalian, No 2

Linggong Road, Dalian 116024, China

La lista completa de información del autor está disponible al final del artículo.

© The Author (s) 2019. Este artículo se distribuye bajo los términos de la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (http://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que
otorgue el crédito apropiado a los autores originales y la fuente, proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron
cambios. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/ publicdomain / zero / 1.0 /) se aplica a
los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario.
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Fondo
Teniendo en cuenta el agotamiento mundial de los recursos de
combustibles fósiles, la fluctuación de los precios del petróleo crudo y
las crecientes preocupaciones ambientales, la producción sostenible de
butanol a través de la fermentación clostridial de acetona-butanol-
etanol (ABE) está despertando una atención intensiva debido a las
propiedades fisicoquímicas únicas del butanol como un sustituto
prometedor para la energía de origen fósil [1-3]. El rastrojo de maíz (CS)
está bien aceptado como la materia prima candidata más favorable
para la fermentación ABE sostenible debido a su amplia disponibilidad
y alto rendimiento de residuos [4-6]. Seguido de un pretratamiento
ácido indispensable y la hidrólisis enzimática, los azúcares
fermentables (principalmente glucosa y xilosa) se liberan de CS [4, 7],
de los cuales se utiliza glucosa como la fuente de carbono más
preferida. Aunque H2ASI QUE4-El pretratamiento es rentable y
ampliamente utilizado para preparar hidrolizado de rastrojo de maíz
(CSH) a escala industrial, el principal inconveniente de este proceso de
pretratamiento es la formación de productos de degradación como
ácidos débiles, derivados de furano y compuestos fenólicos, que
exhiben toxicidades combinadas en clostridios [4, 7]. Como resultado,
el proceso fermentativo se inhibe severamente sin una aparente
utilización de azúcar, crecimiento celular o solventogénesis, lo que hace
que la producción de butanol a partir de materias primas
lignocelulósicas sea menos sustentable y competitiva en costos.
En los últimos años se han realizado numerosos esfuerzos en el
desarrollo de métodos de pretratamiento y desintoxicación,
técnicas de recuperación de butanol, así como refuerzos de cepas
mediante mutagénesis, manipulación genética y perturbaciones
metabólicas [8-17]. Particularmente, se han logrado mejoras
significativas con cepas solventogénicas diseñadas mediante la
eliminación de la represión del catabolito de carbono o mejorando
el metabolismo de la xilosa. Sin embargo, estas cepas modificadas
genéticamente se probaron en medios sintéticos en lugar de
hidrolizados lignocelulósicos desintoxicados [11, 14-17]. Hasta
ahora, de las mejores cepas disponibles para la fermentación ABE
basada en CS, la mayor producción y productividad de ABE de 26,3
g / L y 0,31 g / L / h se lograron conC. beijerinckii P260 usando H
sobrecallado2ASI QUE4-CSH pretratada, mientras que no se
observó fermentación utilizando hidrolizado no desintoxicado [18].
A pesar de los métodos de desintoxicación física, química o
biológica desarrollados para eliminar la toxicidad de los
inhibidores, la emisión de aguas residuales, el costo energético, la
pérdida de azúcar y la baja productividad resultantes siguen
siendo obstáculos para la viabilidad económica y la sostenibilidad
ambiental a escala industrial [4, 7, 8, 19]. Por lo tanto, existe la
necesidad de desarrollar cepas tolerantes a inhibidores aplicables
al cultivo de CSH sin desintoxicación o generación de aguas
residuales.
Cuando se expone a altos niveles de inhibidores como HMF y
furfural, C. acetobutylicum Las células se ven afectadas por el
desacoplamiento de las funciones celulares asociadas con el transporte
de nutrientes, la replicación celular, la catálisis enzimática y
Página 2 de 11
respuesta al estrés, lo que resulta en la acumulación interna de
metabolitos tóxicos y la escasez de carbono, energía y poder
reductor [7]. Además, el ATP y el NADH se drenan durante la
respuesta al estrés, como la biosíntesis de proteínas de choque
térmico, las bombas de salida y la transformación de inhibidores,
cambiando así el metabolismo hacia la producción de ácido para
compensar la disminución del suministro de ATP [20]. En conjunto,
los problemas importantes para el cultivo de CHS radican en la
interrupción del PTS específico de glucosa, así como en los efectos
de los inhibidores microbianos de drenaje de ATP y NADH [7]. Más
recientemente, el zinc micronutriente como adictivo medio afectó
la fermentación ABE a niveles metabólicos y transcriptómicos de
C. acetobutylicum [21-23]. La expresión regulada al alza del gen
glcG que codifica el PTS IICBA específico de glucosa condujo a un
transporte eficiente de glucosa, lo que provocó efectos en cascada
sobre la generación de cofactores, el inicio de la solventogénesis y
la tolerancia al estrés [22]. Con base en estos hallazgos, el objetivo
de este trabajo es desarrollar PTSGlcG-ingeniería
C. acetobutylicum aplicable a la cultura CSH sin desintoxicación.
Finalmente, PTSGlcG la sobreexpresión ejercía funciones pleiotrópicas
que facilitaban el cultivo de CSH y, por lo tanto, podría ser un enfoque
de ingeniería eficaz para la producción de butanol de alta eficiencia a
partir de materias primas lignocelulósicas.
Resultados y discusiones
Regulación pleiotrópica de PTSGluG sobre la fermentación ABE
La mezcla de glucosa y xilosa se seleccionó primero como fuentes
de carbono por la cepa de tipo salvaje L7, cepa de control L7
(pPthl), PTSGlcG-expresa la cepa L7 (GlcG) y PTSGlcGcepa L7
deficiente (ΔGlcG). Los perfiles y resultados comparativos se
ilustraron en la Fig.1 y mesa 1, respectivamente. Similar a la cepa
L7, la cepa L7 (pPthl) utilizó lentamente 45,6 g / L de glucosa y 8,6
g / L de xilosa con una producción de butanol y una productividad
de 11,0 g / L y 0,18 g / L / h. La producción de acetato alcanzó el
nivel más alto de 4,7 g / L a las 12 h y luego disminuyó a 0,8 g / L
hasta el final de la fermentación. En cuanto a la cepa L7 (ΔGlcG), se
consumieron simultáneamente 46,8 g / L de glucosa y 13,7 g / L de
xilosa, por lo que se promovió la utilización de xilosa mientras que
se observó poca diferencia en la utilización de glucosa, alcanzando
una producción de butanol y una productividad de 11,0 g / L y 0,15
g / L / h. Además, se detectó menos de 2,5 g / L de acetato durante
toda la fermentación. Estas observaciones fueron idénticas a los
resultados que se informaron recientemente [11], en el que
interrumpir PTSGlcG facilitó la utilización simultánea de glucosa,
xilosa y arabinosa por C. acetobutylicum. Durante el cultivo por
lotes con la cepa L7 (GlcG), 46,6 g / L de glucosa se agotaron
rápidamente en 24 h, logrando una tasa de consumo promedio de
1,94 g / L / h, en comparación con los de 0,84 y 0,89 g / L / h de las
cepas L7 (pPthl) y L7 (ΔGlcG), respectivamente. Sin embargo, solo
se utilizaron 5,3 g / L de xilosa debido a la rápida producción de
butanol hasta 11,1 g / L y su grave toxicidad en las células.
Finalmente, butanol
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Figura 1 PTSGlcG-regulación mediada por la fermentación ABE utilizando una mezcla de glucosa / xilosa como fuentes de carbono por cepas de a C. acetobutylicum L7; B C.
acetobutylicum L7 (pPthl); C C. acetobutylicum L7 (GlcG); D C. acetobutylicum L7 (ΔGlcG)
La productividad de 0,31 g / L / h se incrementó
considerablemente en un 72,2% y 106,7% en comparación con los
de 0,18 y 0,15 g / L / h de las cepas L7 (pPthl) y L7 (ΔGlcG),
respectivamente. En particular, la cepa L7 (GlcG) produjo solo 2,6
g / L de acetato a las 12 h y creció rápidamente con un pico de DO.
620 de 4,8 a las 24 h, en comparación con el de 3,6 a las 36 h para la
cepa L7 (ΔGlcG), lo que indica PTSGlcGfunciones pleiotrópicas
mediadas en la utilización de glucosa / xilosa, el crecimiento
exponencial y el inicio de la solventogénesis.
Especialmente para el consumo de xilosa dentro de las primeras
36 h de fermentación, las cepas L7 y L7 (pPthl) solo utilizaron 2,5 y
3,2 g / L de xilosa, respectivamente, lo que indica que la represión
severa del catabolito de carbono sobre el consumo de xilosa
ocurrió en presencia de glucosa. Finalmente, las cepas L7 y L7
(pPthl) consumieron 6,6 y 5,4 g / L de xilosa desde las 36 h hasta el
final de la fermentación. De manera similar, la cepa L7 (GlcG)
consumió tan solo 3,7 g / L de xilosa en las primeras 24 h de
fermentación. Sin embargo, en ausencia de glucosa, solo se
consumieron 1,6 g / L de xilosa desde las 24 h hasta el final de la
fermentación debido a la severa inhibición de la alta concentración
de butanol (> 9 g / L). A pesar de que PTS consume más xilosa
rápidamenteGlcG-deficiente en las primeras 48 h en presencia de
glucosa, el proceso de fermentación siguió siendo ineficaz debido
al bajo rendimiento de butanol y al metabolismo prolongado.
Hasta hace poco,
Página 3 de 11
Se ha logrado un cultivo eficiente de glucosa / xilosa mediante
la adición de carbonato de calcio y sulfato de zinc, en el que la
producción y la productividad de butanol se maximizan a 13,9
g / L y 0,35 g / L / h [23]. Los resultados transcriptómicos y
proteómicos globales mostraron que el CaCO3 y ZnSO4
podría actuar sobre las funciones celulares generales asociadas con la
utilización del azúcar, el metabolismo central del carbono y la
respuesta al estrés a niveles globales [22, 24-26]. Particularmente,
seguido de la adición de zinc, la expresión del genglcG fue 3.62 veces
regulado al alza en la fase de crecimiento exponencial de C.
acetobutylicum. Además, el análisis de metabolitos intracelulares
mostró que el flujo de carbono central se redistribuyó antes hacia la
solventogénesis debido a un mayor suministro de ATP y NADH como
fuerzas impulsoras [22]. Por lo tanto, la eficiencia de la fermentación
depende no solo de las cepas utilizadas, sino de un rápido cambio
hacia la solventogénesis, que se atribuyó principalmente a la
coordinación de las señales metabólicas y sus efectos en cascada sobre
C. acetobutylicum.
Mayor tolerancia a los inhibidores durante el cultivo de
CSH sin desintoxicación
Las composiciones químicas básicas de los sólidos de CS sin pretratar
fueron 40,8% de celulosa, 15,2% de hemicelulosa, 32,1% de lignina
insoluble en ácido y cenizas. Seguido de un pretratamiento con ácido,
los sólidos de CS pretratados estaban compuestos principalmente
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264 Página 4 de 11

Tabla 1 Resultados comparativos de la fermentación ABE por lotes por C. acetobutylicum son

Cepa Azúcar utilizado (g / L) Productos (g / L) YBEBÉ (g / g) PAGBEBÉ (g / l / h)

Butirato de acetato Acetona Butanol Etanol

Mezcla de glucosa al 7% / xilosa (2: 1) como fuentes de carbono

L7 44,1±1.1 / 9.1±0,9 1.3±0,2 1.0±0,2 6.5±0.4 11,2±0,5 1.2±0,1 0,21 / 0,36 0,19 / 0,32

L7 (pPthl) 45,6±1,5 / 8,6±0,8 1.1±0,1 0,9±0,1 6.0±0,3 11,0±0,5 1.8±0,1 0,20 / 0,35 0,18 / 0,31

L7 (GlcG) 46,6±1.3 / 5.3±0,8 0,8±0,1 0,5±0,1 6.6±0,5 11,1±0.4 1,9±0,2 0,21 / 0,38 0,31 / 0,54

L7 (ΔGlcG) 46,8±1,5 / 13,7±1.1 0,9±0,1 0.4±0,1 6.1±0,3 11,0±0,5 1.2±0,1 0,18 / 0,30 0,15 / 0,25

H no desintoxicado2ASI QUE4-CSH pretratada como fuentes de carbonoa

L7 15,6±1.3 2.4±0,2 2.1±0,3 1.8±0,1 2.5±0,2 0,5±0,1 0,16 / 0,31 0.07 / 0.13

L7 (pPthl) 15,2±1.1 2.8±0,2 2.3±0,2 1,7±0,1 2.5±0,2 0,5±0,1 0,16 / 0,31 0.07 / 0.13

L7 (GlcG) 45,4±1,6 1.3±0,1 1.1±0,1 6.0±0,3 10.0±0.4 1.3±0,1 0,22 / 0,38 0,28 / 0,48

L7 (ΔGlcG) 12,3±1.4 1,7±0,2 1.4±0,2 1.2±0,1 2.0±0,1 0.4±0,1 0,16 / 0,29 0.04 / 0.08

No desintoxicado enzimáticamente H2ASI QUE4-CSH pretratada como fuentes de carbono

L7 16,5±1.3B 2.6±0,2 2.2±0,3 1.4±0,1 3,0±0,2 0.4±0,1 0,18 / 0,29 0.08 / 0.13

L7 (pPthl) 15,6±1.0B 2.9±0,3 2.3±0,2 1,5±0,1 2,7±0,1 0,5±0,1 0,17 / 0,30 0.08 / 0.13

L7 (GlcG) 34,5±1,9B 1.8±0,2 1,5±0,2 3.9±0,2 7.2±0,3 0,9±0,1 0,21 / 0,35 0,20 / 0,33

45,0±1,5C 2,7±0,3 2.1±0,2 5,6±0,3 10.0±0,3 1.0±0,1 0,22 / 0,37 0,28 / 0,46

52,5±2.0D 1,5±0,1 1.2±0,2 6.6±0.4 11,0±0.4 1,6±0,1 0,21 / 0,37 0,34 / 0,60

60,0±1.8mi 2.1±0,2 1,7±0,1 6,7±0.4 12,5±0.4 1.8±0,2 0,21 / 0,35 0,39 / 0,66

a Con glucosa suplementada a 60 g / L de azúcares totales

B CSH con 45 g / L de azúcares totales y sin nutrientes añadidos

C CSH con 45 g / L de azúcares totales y 10 g / L de CaCO3 adicional

D CSH con glucosa suplementada a 60 g / L de azúcares totales y sin nutrientes añadidos

mi CSH con glucosa suplementada con 60 g / L de azúcares totales y 10 g / L de CaCO3 adicional

de 56,5% de celulosa, 4,5% de hemicelulosa, 34,7% de lignina
insoluble en ácido y ceniza. Las tasas de recuperación de sólidos,
celulosa y hemicelulosa fueron 57,8%, 79,5% y 17,1%,
respectivamente. En la H2ASI QUE4-CSH pretratada, la
concentración inicial de azúcares totales fue de 22,0 g / L (3,0 g / L
de glucosa, 15,5 g / L de xilosa y 3,5 g / L de arabinosa), y las
concentraciones iniciales de acetato, furfural y HMF como los
principales compuestos inhibidores fueron 4.0, 1.5 y 0.9 g / L,
respectivamente. Después de una inoculación al 10%, la
concentración de azúcares totales se ajustó a ~ 60 g / L agregando
glucosa. Como se muestra en la Fig.2 y mesa 1, los impactos
regulatorios de PTSGlcG sobre la tolerancia a los inhibidores se
investigaron más a fondo utilizando el H no desintoxicado2ASI
QUE4-CSH pretratada. Similar a la cepa L7, la cepa L7 (pPthl)
exhibió un crecimiento celular pobre y solventogénesis, donde se
produjeron 2.5 g / L de butanol a partir de 15.2 g / L de azúcares
totales (principalmente glucosa) con una tasa promedio de
consumo de azúcar de 0.42 g / L / h. El acetato residual disminuyó
a 2,8 g / L. En cuanto a la cepa L7 (ΔGlcG), solo se utilizaron 12,3 g /
L de azúcares totales (8,8 g / L de glucosa y 3,5 g / L de xilosa) con
una tasa promedio de consumo de azúcar de 0,34 g / L / h, lo que
resultó en una leve disminución de la producción de butanol. de
2,0 g / L. El acetato residual disminuyó a 1,7 g / L. Cabe señalar que
en el caldo de fermentación quedaron 1,3 g / L de furfural y 0,8 g /
L de HMF, lo que
transformación metabólica de furfural y HMF por las
cepas L7 (pPthl) y L7 (ΔGlcG).
Particularmente para la cepa L7 (GlcG), se utilizaron
rápidamente hasta 45,4 g / L de azúcares totales (42,7 g / L de
glucosa y 2,7 g / L de xilosa) en 36 h, alcanzando un pico de DO.
620 de 3.0 y una tasa promedio de consumo de azúcar de 1.26 g /
L / h. Finalmente, se logró una producción de butanol de 10.0 g / L
junto con un rendimiento y productividad de 0.22 g / gy 0.28 g / L /
h, respectivamente, que aumentaron en un 300%, 37.5% y 300%
respecto a los de la cepa L7 (pPthl ). Más sorprendente aún, el
acetato residual, furfural y HMF disminuyeron significativamente a
1,3, 0,3 y 0,1 g / L, respectivamente, lo que demuestra que estos
inhibidores derivados del pretratamiento podrían transformarse
en gran medida en compuestos menos tóxicos por la cepa L7
(GlcG), lo que hace que el no -Cultura CSH desintoxicada
sostenible. Por ejemplo, el potencial de oxidación-reducción (ORP)
se mantuvo en el rango de
- 550 a −520 mV, lo cual fue consistente con el metabolismo
celular activo por PTSGlcG sobreexpresión. En consecuencia, el
ORP aumentó rápidamente después de 24 h de cultivo con
ambas cepas L7 (pPthl) y L7 (ΔGlcG), en las que se produjo la
muerte celular y la terminación prematura debido a sus
insuficientes soportes de carbono, energía y poder reductor.
Hasta ahora, la producción más alta de butanol de 14.5 g / L se
logró medianteC. beijerinckii P260 desde
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Figura 2 PTSGlcGimpacto mediado en inhibidores microbianos tolerancia de C. acetobutylicum usando H no desintoxicado2ASI QUE4-CSH pretratada. Perfiles comparativos de
fermentación dea azúcares totales; B sobredosis620; C butanol; D ORP
H desintoxicado2ASI QUE4-CSH pretratada (60,3 g / L de azúcares
totales mediante la adición de glucosa) [18], sin embargo, la
productividad de butanol de 0,17 fue mucho más baja que la de 0,28 g /
L / h en cultivo de CSH no desintoxicado por la cepa L7 (GlcG).
Los inhibidores microbianos como furfural y 5-hidroximetil furfural
(HMF) podrían transformarse naturalmente en productos menos
inhibidores a través del proceso de desintoxicación metabólica
dependiente de NADH en Clostridium cepas [7], que a su vez dificulta
un cambio metabólico hacia la solventogénesis debido al consumo
excesivo de NADH en C. acetobutylicum [27]. Además, la disminución
del suministro de ATP altera el crecimiento celular y la respuesta al
estrés, incluida la modificación de la membrana, la biosíntesis de
proteínas de choque térmico y las bombas de eflujo. Por lo tanto, el
aumento de los suministros de ATP y NADH intracelulares se ha
validado como un enfoque racional para combatir estos efectos
negativos de los inhibidores [28-31]. Por ejemplo, el glicerol como
cosustrato con glucosa (2: 1, mol / mol) podría generar ATP y NADH
adicionales y ejercer efectos positivos sobre el crecimiento celular, las
actividades de alcohol / aldehído deshidrogenasas y la transformación
de furfural / HMF [12]. Cuando se sometió a 5 g / L de furfural durante
la fermentación ABE, el glicerol generó un aumento de 1.8 veces en el
nivel de NADH, lo que representó un aumento de 2.3 veces en la tasa
de desintoxicación de furfural, la utilización de glucosa y
Página 5 de 11
producción de butanol en comparación con el control sin adición de
glicerol [12]. Sin embargo, la utilización naturalmente pobre de glicerol
sigue siendo un cuello de botella para la mayoría de las cepas de
clostridios solventogénicos, lo que genera un apoyo insostenible de
ATP / NADH, así como un desperdicio innecesario [32, 33]. Por lo tanto,
el PTS demostradoGlcG la sobreexpresión posiblemente aumentó los
suministros intracelulares de ATP / NADH y provocó efectos en cascada
sobre la tolerancia a los inhibidores.
Mayor suministro intracelular de ATP y NADH
al sobreexpresar PTSGlcG
Con el fin de comprender mejor la energía intracelular y reducir
los cambios de potencia en C. acetobutylicumdespués de PTSGlcG
Sobreexpresión, se realizó un cultivo discontinuo basado en
glucosa para analizar los niveles de ATP y NADH de las cepas L7
(pPthl) y L7 (GlcG), respectivamente. Como se muestra en la Fig.3,
la cepa L7 (GlcG) mostró una utilización eficaz de la glucosa y una
solventogénesis más temprana, en la que se consiguieron 12,6 g /
L de butanol a partir de 59,4 g / L de glucosa en sólo 28 h. Por lo
tanto, también se alcanzaron tasas de consumo de glucosa y
productividad de butanol tan altas como 2,12 y 0,45 g / L / h,
respectivamente, que aumentaron en un 130,4% y un 125% en
comparación con las de la cepa L7 (pPthl). Además, el crecimiento
exponencial de la cepa L7 (GlcG) fue
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Fig. 3 PTSGlcG-Efectos mediados por la fermentación ABE utilizando glucosa como única fuente de carbono. Perfiles comparativos dea glucosa, OD620 y butanol de la
cepa L7 (pPthl); B glucosa, OD620 y butanol de la cepa L7 (GlcG); C ATP y NADH de las cepas L7 (pPthl) y L7 (GlcG)
significativamente mejorado con un pico de DO620 de 4,9 obtenido
a las 24 h, en comparación con el de 4,1 obtenido a las 28 h para la
cepa L7 (pPthl). Dado que la cepa L7 (GlcG) exhibió una mayor
eficiencia de fermentación que la cepa L7 (pPthl), los tiempos de
muestreo fueron 8, 16 y 24 h de la fase de crecimiento exponencial
para ambas cepas. En los tres tiempos de muestreo de 8, 16 y 24
h, los niveles de ATP de la cepa L7 (GlcG) fueron de 6,85, 9,33 y
9,69 µmol / g-DCW, respectivamente, que aumentaron en un
40,4%, 49,0% y 49,8% en comparación con los de la cepa L7 (pPthl),
lo que conduce a un aumento del 23,1%, 55,6% y 48,5% en la DO
620. Más importante aún, los niveles de NADH de la cepa L7 (GlcG)
fueron 0,69, 1,68 y 1,73 µmol / g-DCW, respectivamente, que
aumentaron en un 52,2%, 61,9% y 37,6% en comparación con los
de la cepa L7 (pPthl), lo que contribuyó a iniciación más temprana
de la solventogénesis y transformación de inhibidores impulsada
por NADH. Por lo tanto, como se ilustra en la Fig.4, los resultados
experimentales demostraron que la sobreexpresión de PTSGlcG
desempeñó funciones pleiotrópicas regulando el transporte de
glucosa y sus efectos en cascada sobre la generación de
cofactores, el inicio de la solventogénesis y la tolerancia de los
inhibidores de C. acetobutylicum.
Fermentación ABE de alta eficiencia a partir de CSH no desintoxicada
Para lograr una producción rentable de butanol lignocelulósico,
enzimáticamente H2ASI QUE4-la CSH pretratada fue
Página 6 de 11
utilizado directamente para cultivo por lotes sin desintoxicación
(Fig. 5). De manera similar, las cepas L7 y L7 (pPthl) exhibieron un
rendimiento de fermentación deficiente y produjeron menos de 3
g / L de butanol a las 36 h. En cuanto a la cepa L7 (GlcG), se
produjeron 7,2 g / L de butanol a partir de 34,5 g / L de azúcares
totales en 36 h. Sin embargo, en el caldo de fermentación
permanecieron hasta 10,5 g / L de azúcares residuales
(principalmente xilosa). Como resultado de 10 g / L CaCO3 Además,
todos los azúcares se agotaron rápidamente por la cepa L7 (GlcG)
en 36 h, en donde la producción de butanol y la productividad se
maximizaron aún más a 10,0 g / L y 0,28 g / L / h. Cabe señalar
que, en las mismas condiciones de cultivo, la producción de
butanol todavía estaba limitada a ~ 6,0 g / L con las cepas L7 y L7
(pPthl), respectivamente, lo que implica una posible redistribución
del flujo de carbono central hacia la biosíntesis de butanol al
sobreexpresar PTS.GlcG. En realidad, 100 g de rastrojo de maíz seco
produjeron ~ 45 g de azúcares fermentables (27,8 g de glucosa, ~
14 g de xilosa y ~ 3,2 g de arabinosa) en este estudio. Dado que se
pueden extraer hasta ~ 66 g de azúcares fermentables de 100 g de
CS seco [4], si es posible, el rastrojo de maíz pretratado podría
liberar más azúcares fermentables (especialmente glucosa). Por lo
tanto, la alta concentración de azúcares totales se ajustó aún más
a 60 g / L agregando glucosa después de la inoculación al 10%.
Como se esperaba, 60 g / L de azúcares totales se agotaron por la
cepa L7 (GlcG) en presencia de solo 10 g / L de CaCO3.
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Figura 4 Regulación pleiotrópica de PTSGlcG sobreexpresión en Clostridium acetobutylicum
Se pudo lograr una producción y productividad de butanol de
12.5 g / L y 0.39 g / L / h, las cuales aumentaron en 316.7% y
387.5% con respecto a las de la cepa L7 (pPthl), haciendo
innecesario el proceso de desintoxicación, generación de
aguas residuales y optimización del medio para cultivo CSH no
desintoxicado.
Como se resume en la tabla 2, a pesar de los considerables
esfuerzos para mejorar la fermentación ABE basada en CS [10,
18, 34-36], el cultivo de CSH de alta eficiencia sigue siendo un
problema importante en la consideración sintética de la
utilización de azúcar, la producción de butanol y la
productividad. Por ejemplo, Qureshi et al. informó que la
producción más alta de butanol de 14.5 g / L se logró con una
productividad de 0.17 g / L / h porC. beijerinckii P260 usando H
desintoxicado2ASI QUE4-CSH pretratada [18]. Zhang y col.
informó que se produjo 7,1 g / L de butanol con mucho menos
Página 7 de 11
productividad de 0.10 g / L / h de CSH desintoxicada por C.
acetobutylicum ATCC 824 [36]. Hasta hace poco, la productividad del
butanol se mejoraba a 0,19 g / L / h utilizando CSH pretratada
enzimáticamente con NaOH desintoxicada porC. beijerinckiiCC101 [37].
Según lo informado por Gao et al., El tolerante al butanolC.
acetobutylicum la cepa 206 se examinó mediante mutagénesis de NTG
y se demostró que es robusta para la fermentación lignocelulósica ABE,
en la que se podría lograr una productividad de butanol de hasta 0,14
g / L / h utilizando CSH pretratada enzimáticamente con NaOH no
destoxificada [38]. Sin embargo, hasta la fecha no se dispone de cepas
solventogénicas de clostridios para el cultivo de CSH de alta eficacia.
Por lo tanto, el PTS demostradoGlcG La sobreexpresión en este estudio
se validó como un enfoque de ingeniería factible para la producción de
butanol de alta eficiencia a partir de materias primas lignocelulósicas
sin desintoxicación o generación de aguas residuales.
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264 Página 8 de 11

Figura 5 Lote de fermentación ABE utilizando enzimáticamente H no desintoxicado2ASI QUE4-CSH pretratada. Condiciones de fermentación dea 45 g / L azúcares totales; B45
g / L de azúcares totales con 10 g / L de CaCO3 adición; C 60 g / L azúcares totales con / sin 10 g / L CaCO3 adición

Tabla 2 Comparaciones de fermentación ABE por lotes usando CSH desintoxicada o no desintoxicada

Cepa Pretratamiento Desintoxicación Productos Referencias

método método
Butanol / ABE (g / L) Rendimiento (g / g) Productividad (g / L / h)

C. acetobutylicum Doble tornillo alcalino Lavado 7.1 / 11.2 0,18 / 0,29 0,10 / 0,16 Zhang y col. [36]
ATCC 824 extrusión
C. acetobutylicum Explosión de vapor Carbón activado NA / 12.4 NA / 0,30 NA / 0,17 Wang y Chen [35]
ATCC 824
C. beijerinckii P260 1% (v / v) H2ASI QUE4 Sobrelimado 14,5 / 26,3 0,24 / 0,44 0,17 / 0,31 Qureshi y col. [18]
C. beijerinckii P260 1% (v / v) H2ASI QUE4 Sobrelimado NA / 24.4 NA / 0,44 NA / 0,30 Qureshi y col. [34]
C. beijerinckii CC101 NaOH al 2% (v / v) Lavado 11,2 / 19,8 0,28 / 0,49 0,19 / 0,33 Xue y col. [37] Wang y
C. acetobutylicum Explosión de vapor DAKOTA DEL NORTE 2,2 / 3,7 NA / NA 0.03 / 0.05 Chen [35]
ATCC 824
C. acetobutylicum NaOH al 2% (v / v) DAKOTA DEL NORTE 9,8 / 15,4 0,26 / 0,41 0,14 / 0,21 Gao y col. [38]
cepa 206
C. beijerinckii P260 1% (v / v) H2ASI QUE4 DAKOTA DEL NORTE Sin fermentación Qureshi y col. [18]

C. acetobutylicum L7 1% (v / v) H2ASI QUE4 DAKOTA DEL NORTE 3,0 / 4,8 0,18 / 0,29 0.08 / 0.13 Este estudio

C. acetobutylicum 1% (v / v) H2ASI QUE4 DAKOTA DEL NORTE 12,5 / 21,0 0,21 / 0,35 0,39 / 0,66 Este estudio
L7 (GlcG)

N / A No disponible, DAKOTA DEL NORTE no desintoxicado

Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264 Página 9 de 11

Conclusiones utilizado para construir el control y las cepas diseñadas por

En este estudio, PTSGlcG-ingeniería C. acetobutylicumlas cepas se
construyeron a través de genes glcG sobreexpresión y knockout
para abordar los principales problemas durante el cultivo de CSH
no desintoxicado. El PTSGlcGLa cepa que sobreexpresa mostró
mejoras notables en la utilización de glucosa, el crecimiento
exponencial y la tolerancia a los inhibidores, lo que se atribuyó al
transporte eficiente de glucosa, pero también a sus efectos en
cascada sobre la generación de ATP y NADH intracelular, el inicio
de la solventogénesis y la tolerancia a los inhibidores. Finalmente,
se lograron 12.5 g / L de butanol dentro de las 32 h de cultivo de
CSH no desintoxicado, lo que resultó en una productividad de
butanol significativamente mejorada hasta 0.39 g / L / h, y por lo
tanto hizo que la producción de butanol a partir de materias
primas lignocelulósicas sea más económicamente sostenible y
amigable con el medio ambiente.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas, cebadores y plásmidos
Todas las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio
se enumeran en la Tabla 3. Generalmente, la tensiónC.
acetobutylicum L7, adaptado de la cepa de tipo salvaje C.
acetobutylicum ATCC 824 como se informó anteriormente [21], era
PTS. SonE. coli Se utilizaron DH5α y DH10B cultivados con
medio LB o agar que contenía 10 µg / ml de ampicilina y 50
µg / ml de espectinomicina para la amplificación de plásmidos
y la metilación in vivo. Basado en elC. acetobutylicum ATCC
824 genoma, gen glcG sintetizado por Sangon (Shanghai,
China) fue digerido con el SalI/KpnIsitios de restricción y luego
ligado en el plásmido de control pIMP1-Pthl, produciendo el
plásmido diana pIMP1-Pthl-GlcG. Plásmidos pIMP1-Pthl y
pIMP1-Pthl-GlcG se metilaron por primera vez en E. coli DH10B
y luego electroporados en la cepa L7, respectivamente, de
acuerdo con los protocolos estándar [39]. Las células
resultantes se cultivaron luego en agar RCM (Thermo Fisher,
Oxoid Ltd.) que contenía 50 μg / ml de eritromicina para la
selección de colonias individuales, produciendo la cepa de
control L7 (pPthl) y PTS.GlcG-que sobreexpresa la cepa L7
(GlcG). Según el método descrito por Xiao et al., El PTSGlcGLa
cepa L7 deficiente (ΔGlcG) se construyó mediante un sistema
de desactivación mediada por intrones con un intrón
insertado en 269/270 pb del gen. glcG [11], y todos los
cebadores relacionados fueron sintetizados por Sangon (ver
archivo adicional 1: Tabla S1). Todas las enzimas comerciales
se adquirieron en New England Biolabs (Beverly, MA).

Pretratamiento ácido del rastrojo de maíz

Tabla 3 Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio La CS (variedad Pioneer) utilizada en este estudio se obtuvo de un
Cepas / plásmidos Caracteristicas relevantes Fuente / referencias agricultor local en Shandong y se molió en partículas de 1 a 2 mm
utilizando un molino de martillos. Según lo documentado por
Cepas bacterianas
Malmierca et al., Se remojaron cien gramos de CS molido con 1 L
E. coli
de H diluido al 1% (v / v).2ASI QUE4 solución en un tanque agitado a
DH5α Células huésped para clonación de genes y Invitrogen
121 ° C durante 90 min, seguido de enfriamiento a temperatura
amplificación de plásmidos
ambiente y ajuste del pH a 5.0 usando NaOH 10 M [40]. La
DH10B Cepa utilizada para metilar la Invitrogen
vector concentración inicial de azúcares totales en el H2ASI QUE4La CSH
C. acetobutylicum pretratada fue de 22 g / L, que se añadió adicionalmente a 60 g / L
ATCC 824 Cepa de tipo salvaje ATCC con glucosa extra cuando fue necesario.

L7 Adaptado de C. acetobutylicum [21]

ATCC 824 Hidrólisis enzimática de rastrojo de maíz pretratado con ácido

L7 (pPthl) Cepa de control, que contiene L7 Este estudio Según lo optimizado por Xue et al., El H resultante2ASI QUE4-La
el plásmido de control pIMP1- mezcla de CS pretratada que contenía citrato 30 mM se hidrolizó
Pthl
usando celulasa (Tianjin Novozymes Biotechnology, China) con 20
L7 (GlcG) L7 que contiene el plásmido Este estudio
pIMP1-Pthl-glcG
FPU / g-CS a 50 ° C, pH 4,8 y 200 rpm durante 72 h [37]. El

L7 (ΔGlcG) PTSGlcGcepa deficiente a través de Este estudio

nocaut mediado por intrones
Plásmidos
pAN1 Φ3TI, origen p15A; Sper
PSY6 Intrón del grupo II, ltrA
pIMP1 Amperior; MLSr; repL, origen ColE1,
vector de lanzadera
pIMP1-Pthl Control de transporte de vectores thl Pro-
moter, derivado de pIMP1
pIMP1-Pthl-glcG Derivado de pIMP1-Pthl con
glcG sobreexpresión en L7
PSY-GlcG Vector para la inserción de intrones en
269/270 pb de glcG en L7
enzimáticamente H2ASI QUE4-CSH pretratada se obtuvo mediante
centrifugación a 8000×gramo durante 5 min para eliminar los
sedimentos, y luego se almacena a 4 ° C para el lote posterior
[39] cultivo sin proceso de desintoxicación u optimización de medios
[41] mización. Seguido de una inoculación al 10% durante el cultivo de CSH
[11] tura, la concentración inicial de azúcares totales fue ~ 45 g / L,
que se agregó a 60 g / L con glucosa extra cuando fue
[11] necesario.
Este estudio
Condiciones de los medios y la cultura
Los medios para el precultivo y el cultivo de semillas fueron los
Este estudio
descritos anteriormente [21, 23]. La fermentación estándar
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
El medio está compuesto por (g / L): glucosa o mezcla de glucosa /
xilosa (2: 1, p / p) 70.0, extracto de levadura 2.0, K2HPO4 0,50, KH2
correos4 0,50, MgSO4·7H2O 0.20, MnSO4·H2O 0.10, FeSO4·7H2O
0.01, CH3COONH4 3,22, ácido para-aminobenzoico 0,01 y biotina
0,01. Los CSH mencionados anteriormente se utilizaron
directamente para la fermentación ABE por lotes,
respectivamente. Todos los CSH y los medios se esterilizaron a 121
° C durante 15 min, se enfriaron a temperatura ambiente y se
agregaron 10 μg / ml de eritromicina cuando fue necesario. El pH
inicial para el cultivo por lotes se ajustó a 5,5 usando 3 MH2ASI
QUE4 o NaOH 3 M después de una inoculación al 10%. Todos los
reactivos químicos utilizados en este estudio fueron de grado
analítico o equivalente y se compraron a Sangon.
Fermentación por lotes ABE
La fermentación por lotes de ABE se llevó a cabo en un tanque agitado
que contenía CSH o medio estándar en condiciones anaeróbicas como
se describió anteriormente [21]. Después de la inoculación al 10%, el
pH de la fermentación inicial se ajustó a 5,5 usando 3 MH2ASI QUE4 o
NaOH. Todos los experimentos se triplicaron y se tomaron muestras
para analizar el crecimiento celular, azúcares residuales, ácidos y
producción de ABE. En particular, el ATP intracelular y el NADH se
cuantificaron durante el cultivo por lotes utilizando H no desintoxicado.
2ASI QUE4-CSH pretratada.
Análisis de ATP y NADH intracelulares
Durante el cultivo por lotes utilizando glucosa como única fuente
de carbono, C. acetobutylicum Las células se recolectaron a las 8,
16 y 24 h por centrifugación a 10,000×gramo durante 3 min a -10 °
C. Los sedimentos celulares resultantes se inactivaron
inmediatamente con 500 µl de mezcla de solución de metanol,
acetonitrilo y agua (40:40:20, v / v, -40ºC) y luego se congelaron en
nitrógeno líquido para preparar extractos brutos. Según nuestro
estudio anterior [22], El análisis LC-MS / MS se realizó para la
cuantificación de ATP con un sistema ACCELA HPLC (Thermo
Scientific, CA) equipado con una columna XBridge BEH Amide (100
mm×ID de 2,1 mm, 2,5 μm, Waters, Irlanda). La monitorización de
masas se logró utilizando un analizador de masas de triple
cuadrupolo TSQ Quantum Ultra (Thermo Scientific, CA) equipado
con una fuente de ionización por electropulverización calentada
(HESI). El ensayo de NADH se realizó usando un kit comercial
(Sigma, MO). Los sedimentos celulares se lisaron primero usando
un Qiagen Tissue Lyser LT (Qiagen, Alemania) a 50 oscilaciones / s
durante 3 min en los tampones de extracción de NADH (Sigma,
MO), el lisado resultante se usó luego para la cuantificación de
NADH a 450 nm con un iMark™ lector de microplacas (Bio-Rad, CA).
métodos analíticos
Como se describió anteriormente, el crecimiento celular se midió a
620 nm utilizando un espectrofotómetro (Thermo Spectronic, EE.
UU.) [22]. Las composiciones químicas de los sólidos de CS no
tratados y pretratados se analizaron de acuerdo con los
Procedimientos analíticos de laboratorio [19].
Página 10 de 11
Los azúcares totales en CSH se determinaron mediante el
método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a 540 nm utilizando el
espectrofotómetro. Los ABE se determinaron mediante
cromatografía de gases (Agilgent 6890A GC). Los azúcares
(glucosa, xilosa y arabinosa), ácidos (acetato y butirato) e
inhibidores principales (furfural y HMF) se analizaron mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento (Waters 1525 HPLC).
Todos los productos químicos estándar de azúcares, ácidos y ABE
eran de grado de gradiente de HPLC de calidad y se compraron a
Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, EE. UU.). El rendimiento de
butanol o ABE (YBEBÉ) se calculó como el total de butanol o ABE
producido dividido por el total de azúcares utilizados y se expresa
en g / g. La productividad del butanol o ABE (PAGBEBÉ) se calculó
como el total de butanol o ABE producido dividido por el tiempo
de fermentación utilizado y se expresa en g / L / h.
Información suplementaria
Información suplementaria acompaña este documento en https: // doi. org /
10.1186 / s13068-019-1604-7.
Archivo adicional 1: Tabla S1. Primers utilizados en este estudio.
Abreviaturas
CSH: hidrolizado de rastrojo de maíz; PTS: sistema de fosfotransferasa; ABE:
acetonabutanol-etanol; RCM: reforzadoClostridium medio; ATP: trifosfato de
adenosina; NADH: dinucleótido de nicotinamida y adenina.
Agradecimientos
No aplica.
Contribuciones de los autores
YDW y DJZ diseñaron todos los experimentos. YDW construyó el PTSGlucepas de
ingeniería. YDB y CC realizaron fermentación y análisis de ATP / NADH. YDW y XC
redactaron el manuscrito e involucraron el análisis de datos. LJC y FWB revisaron
el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Fondos
Este estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China con
Grant Numbers (21808027, 41861124004 & 21878035), el Open Funding Project del
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, el National Key R&D Program of
China (2018YFB1501703), Liaoning Revitalization Programa de talentos
(XLYC1807269), Proyecto de innovación en ciencia y tecnología de Dalian
(2018J12SN074), Programa de apoyo al talento innovador de Liaoning (LR2017005),
Proyecto estrella de ciencia y tecnología para jóvenes de Dalian (2017RQ003) y
Fondos de investigación fundamental para las universidades centrales ( DUT17RC
(4) 006 y DUT19ZD213).
Disponibilidad de datos y materiales
Todos los datos generados o analizados en este estudio se incluyen en este artículo y sus archivos
de información adicional. Los conjuntos de datos utilizados y / o analizados durante el estudio
actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.
Aprobación ética y consentimiento para
participarNo aplica.
Consentimiento para la publicación
Todos los autores dan su consentimiento para la publicación del manuscrito en Biotechnology
for Biofuels.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Wu et al. Biocombustibles biotecnol (2019) 12: 264
Detalles del autor
1 Escuela de Bioingeniería, Universidad Tecnológica de Dalian, No 2 Linggong Road,
Dalian 116024, China. 2 Laboratorio estatal clave de ingeniería de biorreactores,
Universidad de Ciencia y Tecnología de China Oriental, Shanghai 200237, China.
3 Escuela de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghai,
Shanghai 200240, China.
Recibido: 4 de junio de 2019 Aceptado: 29 de octubre de 2019
Referencias
1. Xue C, Zhao XQ, Liu CG, et al. Prospectiva y desarrollo del butanol como biocombustible
avanzado. Biotechnol Adv. 2013; 31 (8): 1575–84.
2. Xue C, Zhao JB, Chen LJ, Yang ST, Bai FW. Avances recientes y estrategias de vanguardia
en ingeniería de cepas y procesos para la producción de biobutanol porClostridium
acetobutylicum. Biotechnol Adv. 2017; 35: 310–22.
3. Ranjan A, Moholkar VS. Biobutanol: ciencia, ingeniería y economía. Int J Energy
Res. 2012; 36 (3): 277–323.
4. Baral NR, Slutzky JL, Shah A, et al. Fermentación con acetona-butanol-etanol de
rastrojo de maíz: métodos de producción actuales, viabilidad económica y uso
comercial. FEMS Microbiol Lett. 2016; 363: fnw033.
5. Gottumukkala LD, Haigh K, Görgens J. Tendencias y avances en la conversión de
biomasa lignocelulósica en biobutanol: microbios, bioprocesos y viabilidad industrial.
Renew Sust Energy Rev. 2017; 76: 963–73.
6. Li J, Baral NR, Jha AK. Fermentación de acetona-butanol-etanol de rastrojo de maíz por
Clostridium especies: estado actual y perspectivas futuras. World J Microbiol
Biotechnol. 2013; 30 (4): 1145–57.
7. Baral NR, Shah A. Inhibidores microbianos: formación y efectos sobre la
fermentación acetonebutanol-etanol de biomasa lignocelulósica. Appl Microbiol
Biotechnol. 2014; 98: 9151–72.
8. Jönsson LJ, Martín C. Pretratamiento de lignocelulosa: formación de subproductos
inhibidores y estrategias para minimizar sus efectos. Bioresour Technol. 2016; 199:
103–12.
9. Yang ST, Zhao JB. Ingeniería adaptativa deClostridium para una mayor producción de butanol.
2013; Patente de EE. UU. 8450093.
10. Guo T, Tang Y, Zhang QY y col. Clostridium beijerinckii mutante con alta tolerancia a
inhibidores obtenido por implantación de iones de baja energía. J Ind Microbiol
Biotechnol. 2012; 39: 401–7.
11. Xiao H, Gu Y, Ning YY, et al. Confirmación y eliminación de los cuellos de botella del
metabolismo de la xilosa en glucosa fosfoenolpiruvato dependiente del sistema
de fosfotransferasa deficienteClostridium acetobutylicum para la utilización
simultánea de glucosa, xilosa y arabinosa. Appl Environ Microb. 2011; 77: 7886–
95.
12. Ujor V, Agu CV, Gopalan V, et al. La suplementación con glicerol del medio de
crecimiento mejora la desintoxicación in situ de furfural porClostridium beijerinckii
durante la fermentación del butanol. Appl Microbiol Biotechnol. 2014; 98 (14):
6511–21.
13. Grimmler C, Held C, Liebl W, et al. Análisis transcripcional de la represión de
catabolitos enClostridium acetobutylicum creciendo en mezclas de
D-glucosa y D-xilosa. J Biotechnol. 2010; 150: 315–23.
14. Ren C, Gu Y, Hu S y col. Identificación e inactivación del regulador pleiotrópico
CcpA para eliminar la represión de glucosa de la utilización de xilosa en
Clostridium acetobutylicum. Metab Eng. 2010; 12 (5): 446–54.
15. Jin L, Zhang H, Chen L y col. La sobreexpresión combinada de genes
implicados en la vía de las pentosas fosfato permite mejorarD-utilización de
xilosa porClostridium acetobutylicum. J Biotechnol. 2014; 173: 7–9.
16. Gu Y, Li J, Zhang L y col. Mejora de la utilización de xilosa enClostridium
acetobutylicum a través de la expresión de la talA gen que codifica la
transaldolasa de Escherichia coli. J Biotechnol. 2009; 143 (4): 284–7.
17. Gu Y, Ding Y, Ren C y col. Reconstrucción de la vía de utilización de xilosa y los
regulones enFirmicutes. BMC Genomics. 2010; 11 (1): 255.
18. Qureshi N, Saha BC, Hector RE, et al. Producción de butanol (un biocombustible) a
partir de residuos agrícolas: parte II: uso de rastrojo de maíz e hidrolizados de
pasto varilla. Bioenergía de biomasa. 2010; 34: 566–71.
19. Xue C, Zhang XT, Wang JF y col. La estrategia avanzada para mejorar la producción de
biobutanol y la recuperación de productos de alta eficiencia con una menor generación de
aguas residuales. Biocombustibles Biotechnol. 2017; 10: 148.
20. Gheshlaghi R, Scharer JM, Moo-Young M, et al. Vías metabólicas de los
clostridios para producir butanol. Biotechnol Adv. 2009; 27 (6): 764–81.
Página 11 de 11
21. Wu YD, Xue C, Chen LJ, et al. Efecto de la suplementación con zinc sobre la
fermentación acetonebutanol-etanol porClostridium acetobutylicum. J Biotechnol.
2013; 165: 18–21.
22. Wu YD, Xue C, Chen LJ, et al. Análisis transcripcional de la respuesta asociada a
micronutrientes zin para una mejor utilización de carbohidratos y solventogénesis
más temprana enClostridium acetobutylicum. Sci Rep.2015; 5: 16598.
23. Wu YD, Xue C, Chen LJ y col. Efecto sinérgico del calcio y el zinc sobre la utilización de
glucosa / xilosa y la tolerancia al butanol deClostridium acetobutylicum. FEMS
Microbiol Lett. 2016; 363: fnw023.
24. Han B, Ujor V, Lai LB y col. Uso del análisis proteómico para dilucidar el papel del
calcio en la fermentación de acetona-butanol-etanol (ABE) enClostridium beijerinckii
NCIMB 8052. Appl Environ Microbiol. 2013; 79: 282–93.
25. Richmond C, Han B, Ezeji TC. Efectos estimulantes del carbonato de calcio sobre la
producción de butanol por solventogénicoClostridium especies. Cont J Microbiol.
2011; 5: 18-28.
26. El Kanouni A, Zerdani I, Zaafa S, et al. La mejora de la fermentación de glucosa / xilosa
medianteClostridium acetobutylicum utilizando carbonato de calcio. World J
Microbiol Biotechnol. 1998; 14: 431–5.
27. Zhang Y, Han B, Ezeji TC. Biotransformación de furfural y 5-hidroximetil furfural
(HMF) porClostridium acetobutylicum ATCC 824 durante la fermentación del
butanol. N Biotechnol. 2012; 29 (3): 345–51.
28. Ventura JR, Hu H, Jahng D. Enhanced butanol production in Clostridium acetobutylicum ATCC
824 por doble sobreexpresión de los genes 6-fosfofructoquinasa y piruvato cinasa. Appl
Microbiol Biotechnol. 2013; 97 (16): 7505–16.
29. Liu D, Yang Z, Wang P y col. Hacia la producción de biocombustibles desacoplados de
acetona en solventogénicosClostridium mediante la reducción de la conservación de
energía. Metab Eng. 2018; 47: 102-12.
30. Agu CV, Ujor V, Ezeji TC. Ingeniería metabólica deClostridium beijerinckii para mejorar el
metabolismo del glicerol y la tolerancia al furfural. Biocombustibles Biotechnol. 2019;
12:50.
31. Liu J, Guo T, Wang D y col. Producción mejorada de butanol al aumentar los niveles de
NADH y ATP enClostridium beijerinckii NCIMB 8052 por inactivación insercional de
Cbei_4110. Appl Microbiol Biotechnol. 2016; 100 (11): 4985–96.
32. Girbal L, Croux C, Vasconcelos I, et al. Regulación de cambios metabólicos
enClostridium acetobutylicum ATCC 824. FEMS Microbiol Rev. 1995; 17
(3): 287-97.
33. Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P. Regulación del flujo de carbono y electrones en
Clostridium acetobutylicum crecido en cultivo de quimiostato a pH neutro en
mezclas de glucosa y glicerol. J Bacteriol. 1994; 176 (5): 1443–50.
34. Qureshi N, Cotta MA, Saha BC. Bioconversión de tobutanol (un biocombustible) paja de cebada
y rastrojo de maíz en biorreactores de fermentación integrada y recuperación simultánea de
producto. Proceso de bioproductos alimentarios. 2014; 92: 298–308.
35. Wang L, Chen HZ. Mayor fermentabilidad del rastrojo de maíz explotado con vapor
hidrolizado enzimáticamente para la producción de butanol mediante la eliminación de
inhibidores de la fermentación. Process Biochem. 2011; 46: 604–7.
36. Zhang YD, Hou TG, Li B y col. Producción de acetona-butanol-etanol a partir de rastrojos
de maíz pretratados mediante pretratamiento alcalino de extrusión de doble tornillo.
Bioprocess Biosyst Eng. 2014; 37: 913–21.
37. Xue C, Wang ZX, Wang SD y col. El papel vital del tampón de citrato en la fermentación de
acetonabutanol-etanol (ABE) utilizando rastrojo de maíz y recuperación de producto de alta
eficiencia mediante el proceso de extracción de vapor-permeación de vapor (VSVP).
Biocombustibles Biotechnol. 2016; 9: 146.
38. Gao K, Li Y, Tian S y col. Cribado y características de una cepa tolerante al butanol y
producción de butanol a partir de hidrolizado enzimático de rastrojo de maíz
pretratado con NaOH. World J Microbial Biotechnol. 2012; 28: 2963–71.
39. Mermelstein LD, Papoutsakis ET. Metilación in vivo enEscherichia coli por elBacillus
subtilis fago phi 3T I metiltransferasa para proteger los plásmidos de la restricción
tras la transformación de Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl Environ
Microbiol. 1993; 59: 1077–81.
40. Malmierca S, Díez-Antolínez R, Paniagua AI, et al. Estudio tecnoeconómico de la
producción de biobutanol AB. 1. Pretratamiento e hidrólisis de biomasa. Ind Eng
Chem Res. 2017; 56 (6): 1518–24.
41. Seno ET, Chater KF. Enzimas catabólicas de glicerol y su regulación en
cepas de tipo salvaje y mutante deStreptomyces coelicolor A3 (2). J Gen
Microbiol. 1983; 129: 1403-13.
Nota del editor
Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en
mapas publicados y afiliaciones institucionales.