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Condiciones experimentales estándar de caracterización enzimática
-- - 12 de septiembreth - dieciséisth, 2011, Rüdesheim / Rhein, Alemania
Email: *thomas.millat@uni-rostock.de
Abstracto
Los grampositivos estrictamente anaeróbicos Clostridium acetobutylicum es
capaz de fermentar material con almidón a acetona, butanol y etanol. Debido al
aumento de los costos, la disminución de los recursos y las preocupaciones
ambientales con respecto a la extracción y el uso de petróleo y gas natural, el
interés académico e industrial enC. acetobutylicum ha sido renovado en los
últimos años. Sin embargo, una mejor comprensión del metabolismo clostridial
y sus regulaciones es un requisito previo para futuras aplicaciones industriales.
http://www.beilstein-institut.de/escec2011/Proceedings/Millat/Millat.pdf
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Millat, T. et al.
Introducción
La bacteria grampositiva anaeróbica obligatoria Clostridium acetobutylicum fermenta el material con almidón a
acetona, butanol y etanol, que son sustancias químicas importantes que se utilizan en una gran cantidad de
aplicaciones industriales. La aplicación industrial temprana de la fermentación de acetona-butanoletanol (AB o
ABE) está estrechamente asociada a Chaim Weizmann, quien ayudó a desarrollar instalaciones industriales y
poseía varias patentes relacionadas con este proceso de fermentación clostridial. Se convirtió en el segundo
proceso biotecnológico comercial más grande jamás realizado hasta principios de la década de 1960, cuando la
producción de estos productos químicos a partir de productos petroquímicos se volvió económicamente más
favorable. Debido al aumento de los costos, la disminución de los recursos y las preocupaciones ambientales
con respecto a la extracción y el uso de petróleo y gas natural, el interés académico e industrial enC.
acetobutylicum ha sido renovado en los últimos años [1]. Sin embargo, las demandas económicas y ecológicas
sobre la producción de energía y (bio) químicos requieren una optimización de la fermentación microbiana.
Estas demandas incluyen una producción a gran escala de energía transportable de alta densidad que coincide
con los combustibles fósiles en conveniencia y utilidad. Aquí,C. acetobutylicum podría ser un candidato
adecuado para el futuro CO2-Producción de energía neutra utilizando (bio) butanol. En primer lugar, no es
patógeno para los seres humanos, los animales y las plantas y no produce subproductos tóxicos que puedan
dañar el medio ambiente. En segundo lugar, el butanol es un biocombustible más atractivo que el etanol, que se
utiliza actualmente para ese fin [2, 3]. Su contenido energético es similar al de la gasolina pura y, por tanto,
aproximadamente un 30% más alto que el del etanol. Además, el butanol es menos corrosivo, escasamente
soluble en agua y no absorbe agua. Por lo tanto, a diferencia del etanol, el butanol se puede agregar en la
refinería, transportarse y entregarse a través de la infraestructura existente y no requiere modificaciones en los
motores. A pesar de su uso como biocombustible, el butanol también es un importante producto químico a
granel necesario para una amplia gama de aplicaciones que incluyen recubrimientos de superficies, adhesivos /
escamas, elastómeros, textiles, superabsorbentes, floculantes, fibras y plásticos [4]. En resumen, el butanol es
un recurso importante y la fermentación AB clostridial podría ser una alternativa al uso de productos químicos
de petróleo en disminución para su producción.
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Sin embargo, el estado actual de la tecnología es insuficiente para una aplicación a gran escala de
este proceso bacteriano. El uso futuro requiere una mayor eficiencia de la fermentación, por
ejemplo, la mejora del flujo metabólico a través de la vía y el butanol producido por equivalente de
glucosa. Además, el control de la fermentación AB por medios externos es poco conocido.
Además, la característica anaeróbica obligatoria deC. acetobutylicum y su preferencia por los
azúcares como fuente de energía y carbono dificultan futuras aplicaciones. Por lo tanto, una mejor
comprensión del metabolismo clostridial y sus regulaciones es un requisito previo para futuras
aplicaciones industriales a gran escala.
La evidencia experimental indica que el nivel de pH extracelular es crucial para el espectro del
producto y, por lo tanto, puede permitir un control externo del flujo metabólico a través de la vía.
Curiosamente, la fermentación AB enC. acetobutylicum comprende dos fases características
dependientes del pH: acidogénesis y solventogénesis. Durante la acidogénesis (pH alto), la
bacteria produce predominantemente los ácidos acetato y butirato, mientras que los disolventes
acetona y butanol se fermentan durante la solventogénesis (pH bajo). Un estudio sistémico de
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el espectro del producto en estado estacionario como función del nivel de pH externo se muestra
en la Figura 1. Además, ajustamos tangentes hiperbólicas en los datos experimentales para definir
medidas cuantitativas para esta transición de fase dependiente del pH. Usando sus puntos de
inflexión, encontramos que la bacteria está en fase acidógena a pH> 5.2 y en fase solventogénica a
pH <5.1. Una fase de transición intermedia emerge dentro del rango 5.2 <pH <5.1 que difiere de la
acidogénesis o solventogénesis. Además, esta transición de fase metabólica se acompaña de
cambios en el transcriptoma, proteoma y metaboloma que se han medido utilizando una
configuración experimental estandarizada.
El consorcio COSMIC, como parte de la iniciativa transnacional europea SysMo [5], se centra en el cambio
metabólico inducido por el pH de C. acetobutylicum desde la acidogénesis hasta la solventogénesis. Una
estrecha colaboración entre experimentadores y modeladores realizó un ciclo iterativo de modelos
basados en datos y diseño de experimentos basado en modelos. Este enfoque impulsado por objetivos
se discutirá utilizando el cambio metabólico inducido por el pH enC. acetobutylicum como ejemplo. Con
este fin, presentamos los hallazgos experimentales recientes y pasados y la configuración experimental
estandarizada en la siguiente sección. Posteriormente, usamos esta información para establecer un
modelo matemático dinámico y discutir los supuestos aplicados en su formulación. Debido a la falta de
datos, la dependencia del pH de las reacciones cinéticas enzimáticas involucradas en la fermentación AB
se ignora en los modelos actuales. Sin embargo, se supone que la actividad específica dependiente del
pH es crucial para la regulación cinética del cambio metabólico. Por lo tanto, discutimos su influencia
potencial en la transición de fase en la siguiente sección. Finalmente, resumimos nuestros resultados y
damos una perspectiva a futuras investigaciones.
Figura 2. El pH extra e intracelular y las concentraciones de butirato y butanol en función del tiempo
en un experimento de crecimiento en cultivo discontinuo. A diferencia de los organismos aeróbicos,
el anaeróbico estrictoC. acetobutylicum es incapaz de mantener un nivel de pH intracelular
constante, sino que mantiene constante el gradiente de pH transmembrana. Por lo tanto, el pH
intracelular sigue el nivel de pH extracelular sin un retraso significativo y una diferencia aproximadaD
pH »1. Reproducido por cortesía de Springer de [11].
El primer punto de ramificación, acetil-CoA, es el punto de partida para la formación de acetato y etanol.
El acetato se genera en dos reacciones secuenciales que involucran una fosfotransacetilasa y una acetato
quinasa [9, 16]. La actividad de la acetato quinasa disminuye rápidamente a niveles muy altos en la
solventogénesis [17, 18]. Simultáneamente, se forma etanol a través de una acetaldehído / alcohol
deshidrogenasa. Dos acetaldehído / alcohol deshidrogenasas dependientes de NADH expresadas
antagonísticamente, AdhE1 y AdhE2, juegan un papel crucial en el cambio metabólico inducido por el pH
[16, 19]. Mientras queadhe2 se transcribe durante la acidogénesis en un quimiostato y su producto
génico sólo facilita la formación de etanol, AdhE1 se induce durante la solventogénesis y reemplaza a
AdhE2 [19]. Curiosamente, el AdhE1 bifuncional promueve la producción de alcoholes, etanol y butanol
[20].
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La información disponible sobre la fermentación ABE, resumida en la red reducida que se muestra en la
Figura 3, sugiere que la formación de ácidos y disolventes se ve afectada por la cinética dependiente del
pH y la expresión génica dependiente del pH. Curiosamente, la formación de ácido parece estar
modulada principalmente por cambios de las propiedades cinéticas, mientras que la formación de
disolvente requiere ambos mecanismos reguladores.
La evidencia experimental indica que el cambio metabólico inducido por el pH involucra varios niveles de
organización biológica. Sin embargo, la medición dinámica de cambios transcriptómicos, proteómicos,
metabólicos y ambientales suele estar más allá de la capacidad de un solo laboratorio [28]. Por lo tanto, varios
laboratorios con diferentes especializaciones deben colaborar estrechamente para proporcionar datos que se
ajusten a las necesidades del modelado. Con este fin, el consorcio COSMIC estableció una configuración
experimental estandarizada y procedimientos operativos estándar.
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El cultivo continuo bajo limitación de fosfato [29, 30] es superior a los cultivos discontinuos, porque
reduce los factores ambientales y biológicos que podrían influir en la población bacteriana. Por lo tanto,
permite una restricción razonable de los procesos considerados en el modelo y proporciona datos
reproducibles que es un requisito fundamental para el modelado. Sin embargo, la población de
clostridios puede comportarse de manera sustancialmente diferente en estas condiciones que en los
cultivos por lotes [29]. La tensionC. acetobutylicum ATCC 824 se cultivó en condiciones anaeróbicas a
37ºC. Los experimentos se realizaron en un sistema fermentador, que se muestra en la Figura 4, con 0.5
mM de KH2correos4 y glucosa al 4% (p / vol) en el medio de suministro y una tasa de dilución D = 0,075
horas71. El pH externo en el medio de cultivo se ajustó y se mantuvo constante a pH 5,7 (fase acidógena)
y pH 4,5 (fase solventogénica) mediante la adición automática de KOH.
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En tres 'experimentos de cambio' individuales, el nivel de pH se cambió de 5,7 a 4,5 para inducir el
cambio metabólico. Se tomaron datos para transcriptoma, proteoma, metaboloma, espectro de
producto y medio ambiente durante todo el tiempo de observación. Usamos la información recopilada
para establecer un modelo matemático de la transición de fase metabólica inducida por pH enC.
acetobutylicum. La estructura del modelo, los supuestos subyacentes y las aproximaciones se presentan
en la siguiente sección.
En concreto, nos centramos en aquellas reacciones que tienen más probabilidades de estar reguladas por el
cambio del nivel de pH intracelular. El modelo metabólico resultante viene dado por un sistema acoplado de
nueve ecuaciones diferenciales:
dAc
¼ R1 - R2 - R3 - 2R4 þ R9 - D - AC;
dt
dA
¼ R2 - R9 - D - A;
dt
guarida
¼ R3 - D - En;
dt
dAaC
¼ R4 - R6- R - R910 - D - AaC;
dt
dan
¼ R5 - D - An; (1)
dt
dBC
¼ R6 - R7 - R8 þ R10 - D - BC;
dt
dB
¼ R7 - R10 - D - B;
dt
dBn
¼ R8 - D - Bn;
dt
dAa
¼ R9 þ R10 - R5 - D - Aa:
dt
Tenga en cuenta que reorganizamos las reacciones en comparación con la representación que publicamos en
[31].
La tasa de cambio de los metabolitos y productos intracelulares considerados está determinada por la
suma de las reacciones. RI que producen (signo positivo) o consumen (signo negativo) la molécula
respectiva. Además, introdujimos un término de flujo de salida que es el producto de la tasa de dilución.
D con la concentración del metabolito correspondiente, porque tenemos un flujo de salida constante de
productos intracelulares extra e intracelulares como resultado del flujo de salida celular a través del
fermentador.
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2V1-Glc V 6-AaC
R1 ¼ K1þGlc ; R6 ¼
K6þAaC
;
R2 ¼ ; R7 ¼ ;
K2þC.A. K7þantes de Cristo
(2)
R3 ¼ a3 - AC - adherir; R8 ¼ a8 - BC - adherirse;
V 4-AC
R4 ¼ ; R9 ¼ a9 - A - AaC - ctf;
2DK4þC.A.Þ
aquí incluimos la constante estequiométrica de dos en R1 ya que dos moléculas de acetil-CoA se forman a
partir de una de glucosa. De manera similar, la constante 0.5 enR4 representan la formación de un
acetoacetil-CoA a partir de dos acetil-CoA. En consecuencia, introdujimos un factor de dos en la ecuación
cinética para acetil-CoA, ver red metabólica (1), para mantener la estequiometría correcta para esta
molécula.
En las ecuaciones (2), las ecuaciones similares a Michaelis-Menten describen reacciones que involucran enzimas
con regulación génica independiente del pH y, por lo tanto, con concentraciones intracelulares constantes. Este
tipo de reacción está determinada por una tasa límite aparenteVI y una aparente constante de Michaelis-Menten
KI. Por el contrario, las enzimas productoras de solución se inducen durante el cambio metabólico, de modo que
la suposición de concentraciones de enzimas totales constantes realizadas en la derivación de la ecuación de
Michaelis-Menten no se cumple para las reacciones que facilitan esas enzimas. Por lo tanto, solo aplicamos la
aproximación de estado cuasi-estacionario que nos lleva a reacciones aparentemente bimoleculares y
trimoleculares, donde el coeficiente de velocidad aparente se define como:¼ k3= Kmetro [31, 32].
Además de la red metabólica (1), requerimos las siguientes ecuaciones dependientes del pH
para describir la inducción de enzimas solventogénicas:
papá
¼ rah þ rþah - FDpHÞ- D - adherirse;
dt
dadc
¼ ranuncio þ rþ - FDpHÞ-D- adc; (3)
dt anuncio
dctf
¼ rct þ r þ - FDpHÞ- D - ctf:
dt Connecticut
Estas ecuaciones de velocidad comprenden dos velocidades de síntesis diferentes. Durante la acidogénesis, la en-
las zimas se expresan con una tasa basal baja rI. Su síntesis aumenta enrþ I en solvento-
génesis. La función dependiente del pH
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genera el cambio entre ambos modos de expresión génica. Se acopla al nivel de pH externo
que se aproxima usando una tangente hiperbólica [31].
Finalmente, estimamos todos los parámetros del modelo a partir de tres experimentos de 'cambio'. Con este fin,
normalizamos y escalamos los datos a lo largo del intervalo de cambio dinámico para que las comparaciones entre
puntos de tiempo sean significativas. Cada conjunto de datos fue interpolado en puntos de tiempo idénticos, lo que
permitió calcular el promedio de los tres conjuntos escalados para la estimación de parámetros.
En la Figura 5, comparamos los resultados de la simulación numérica con los datos de un experimento
de 'cambio'. El cultivo de clostridios se mantuvo en acidogénesis (pH 5,7) durante aproximadamente 135
horas. Durante este período, se estableció un estado estable acidógeno y las células produjeron
principalmente los ácidos acetato y butirato. Luego, se detuvo el control del pH, lo que permitió que
comenzara el cambio metabólico natural inducido por el pH a la solventogénesis. Durante el turno, el
espectro de productos de la cultura cambió drásticamente. La producción de ácido cayó y
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las células reasimilaron los ácidos previamente excretados del medio, lo que resultó en una rápida disminución
de la concentración de ácido. Simultáneamente, se inició la formación de solventes y las concentraciones de
acetona y butanol aumentaron fuertemente. Este cambio duró aproximadamente un día hasta que el cultivo
alcanzó un pH solventogénico de 4,5. Sin embargo, el cultivo continuo aún no se había acercado a un estado
estable metabólico en este punto. Se necesitaron 100 horas más para establecer un estado estable
solventogénico.
El espectro del producto en estado estacionario predicho por nuestra simulación numérica está de acuerdo con los datos experimentales. Este acuerdo prueba que el cambio inducido por el pH
implica una reordenación de la composición proteómica deC. acetobutylicum. Durante la transición de fase, la bacteria induce enzimas productoras de solvente adicionales. Curiosamente, la
concentración de enzimas productoras de ácido cambia de manera insignificante [23], mientras que la transcripción aumenta para varios genes que codifican esas enzimas [24]. Estos hallazgos
pueden reflejar el comportamiento deC. acetobutylicum en su hábitat natural. Aquí, el cambio metabólico inducido por el pH se inicia para contrarrestar una mayor disminución del nivel de pH
ambiental. Finalmente, la bacteria vuelve a un estado acidógeno que requiere la presencia de enzimas productoras de ácido. El aumento encontrado en la transcripción podría, por lo tanto,
compensar la disminución del ARNm o la estabilidad de la proteína en la solventogénesis. Además, la simulación se desvía de los datos experimentales durante la transición dinámica de la
acidogénesis a la solventogénesis. El tiempo de transición teórico predicho es mucho más corto que el medido en los experimentos. Las propiedades cinéticas enzimáticas dependientes del pH que
se descuidan en el presente modelo podrían ser una explicación plausible para esa observación. En particular, la dinámica de la formación de acetona está sobreestimada, lo que coincide con el
hecho de que la acetoacetato descarboxilasa involucrada exhibe un notable comportamiento dependiente del pH [17, 21]. Esta evidencia sugiere que la influencia del nivel de pH cambiante sobre
las propiedades cinéticas de los componentes involucrados en la fermentación AB es crucial para los procesos de conversión metabólica, así como para su regulación intracelular. Por lo tanto,
investigamos en la siguiente sección, cómo algunos motivos de red importantes responden a las variaciones en el pH intracelular si se considera la cinética dependiente del pH. Esto arrojará una
nueva luz sobre los procesos celulares relacionados con factores ambientales, como la temperatura, el pH o la salinidad, que afectan directamente las propiedades enzimáticas. Esta evidencia
sugiere que la influencia del nivel de pH cambiante sobre las propiedades cinéticas de los componentes involucrados en la fermentación AB es crucial para los procesos de conversión metabólica,
así como para su regulación intracelular. Por lo tanto, investigamos en la siguiente sección, cómo algunos motivos de red importantes responden a las variaciones en el pH intracelular si se
considera la cinética dependiente del pH. Esto arrojará una nueva luz sobre los procesos celulares relacionados con factores ambientales, como la temperatura, el pH o la salinidad, que afectan
directamente las propiedades enzimáticas. Esta evidencia sugiere que la influencia del nivel de pH cambiante sobre las propiedades cinéticas de los componentes involucrados en la fermentación
AB es crucial para los procesos de conversión metabólica, así como para su regulación intracelular. Por lo tanto, investigamos en la siguiente sección, cómo algunos motivos de red importantes
responden a las variaciones en el pH intracelular si se considera la cinética dependiente del pH. Esto arrojará una nueva luz sobre los procesos celulares relacionados con factores ambientales,
como la temperatura, el pH o la salinidad, que afectan directamente las propiedades enzimáticas. cómo algunos motivos de red importantes responden a las variaciones en el pH intracelular si se
considera la cinética dependiente del pH. Esto arrojará una nueva luz sobre los procesos celulares relacionados con factores ambientales, como la temperatura, el pH o la salinidad, que afectan
directamente las propiedades enzimáticas. cómo algunos motivos de red importantes responden a las variaciones en el pH intracelular si se considera la cinética dependiente del pH. Esto arrojará
una nueva luz sobre los procesos celulares relacionados con factores ambientales, como la temperatura, el pH o la salinidad, que afectan directamente las propiedades enzimáticas.
dP dS Vmax-S
¼- ¼ ; (5)
dt dt KmþS
con una tasa límite dependiente del pH Vmax y una constante de Michaelis-Menten dependiente del
pH Kmetro. Ambos parámetros están determinados por el equilibrio de disociación y asociación de
hidrones que se describe mediante las constantes de disociación K(a, d) E y K(a, d) C, donde el subíndice
'a' denota la asociación de un hidrón y el subíndice 'd' la disociación, y la concentración de hidrón
H+. La tasa límite dependiente del pH [35]
Vmax
Vmax ¼ (6)
1þHþ =KC.AþKdC =Hþ
cumple la relación Vmax Vmax, dónde Vmax ¼ k3 - miT es la tasa límite del estándar
Ecuación de Michaelis-Menten. Presenta una forma típica de campana, Figura 7.
Figura 7. La tasa límite aparente, en función del pH, presenta una forma típica en forma de
campana. Su máximo está determinado por las constantes de disociación.KC.A y Kcorriente continua
que describen la asociación y disociación de un hidrón hacia y desde, respectivamente, el
complejo C.
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resulta de la multiplicación de la constante estándar de Michaelis-MentenKmetro ¼ ðk2 þ k3Þ =k1 con una
expresión dependiente del pH racional. Un análisis más detallado de la ecuación de velocidad (5) revela que la
dependencia del pH de las constantes aparentes de Michaelis-Menten debe considerarse para concentraciones
pequeñas de sustrato.SKmetro. Por lo tanto, descuidamos su efecto sobre la velocidad de reacción en nuestras
investigaciones posteriores. Entonces, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la velocidad
límite dependiente del pH y comparte la misma funcionalidad.
Ahora aplicamos este formalismo desarrollado para enzimas aisladas para investigar los efectos de un
pH cambiante en los motivos de la red elegidos de la vía de fermentación AB. Con este fin, consideramos
el impacto separado del pH intracelular en la regulación de la expresión génica mediante un ciclo de
(des) activación con dos estados distintos dependientes del pH, Figura 8 [a], y en las reacciones
metabólicas mediante un punto de ramificación, Figura 8 [b], como ejemplo.
En el ciclo considerado de (des) activación, una proteína es activada por una enzima mi1, por ejemplo, por
fosforilación, y desactivado por enzima mi2, por ejemplo, por desfosforilación, de una manera dependiente del
pH. Dependiendo de su estado de activación, la proteína puede desencadenar o inhibir funciones celulares
específicas como la actividad del factor de transcripción. Suponiendo que la activación y desactivación son
mucho más rápidas que las funciones celulares reguladas por la proteína, nos enfocamos en el estado
estacionario como una función del nivel de pH externo e investigamos cómo un cambio de posición de la
actividad dependiente del pH afecta el estado estacionario. concentración. Para ello, elegimos perfiles
dependientes del pH con la misma mitad de ancho y alto para activación y desactivación, respectivamente.
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Las concentraciones en estado estacionario en función del pH externo se muestran en la Figura 9 para dos
escenarios diferentes: [a] perfiles de pH ligeramente diferentes y [b] perfiles de pH muy diferentes. De acuerdo
con la evidencia experimental, la última configuración asume que las enzimas productoras de ácido y solvente
operan de manera óptima durante la acidogénesis o la solventogénesis. Debido a que los procesos de activación
y desactivación poseen una actividad dependiente del pH diferente, el estado estacionario es una función del pH
externo. Debido a las actividades dependientes del pH ligeramente diferentes investigadas en la Figura 9 [a], el
sistema "ajusta" la concentración de proteína a sus requisitos actuales. En nuestro ejemplo, el máximo de
activación se encuentra en un valor de pH menor que la desactivación. Por lo tanto, la forma activa de la
proteína disminuye al aumentar el pH, mientras que la forma inactiva aumenta con el pH. Máximos muy
diferentes dan como resultado estados estacionarios sensibles al pH que proporcionan un comportamiento
similar al de un interruptor, Figura 9 [b]. La proteína puede, por tanto, actuar como un sensor de pH intracelular
que desencadena adaptaciones metabólicas y fisiológicas enC. acetobutylicum.
Figura 9. La fracción de la forma activa e inactiva de proteína. W en estado estacionario en función del
pH externo. Se comparan dos situaciones diferentes: [a] los máximos de las actividades difieren
ligeramente (METROA= 5,15 y METROD = 5,25) y [B] los máximos difieren fuertemente entre sí (METRO
A= 5,45 y METROD = 5,95). Las actividades específicas correspondientes, en función del pH, se
muestran como recuadros. Con una separación creciente de los perfiles de pH, surge un
comportamiento similar al de un interruptor, lo que permite que el ciclo de (des) activación detecte el
nivel de pH intra o extracelular, lo que da como resultado una respuesta celular apropiada.
Para investigar la influencia del pH intracelular en el espectro del producto de un punto de ramificación,
consideramos un metabolito X, por ejemplo, butiril-CoA, que se convierte en productos A y
B, por ejemplo, butirato y butanol. Además, metabolitoX1 se producirá en ambas reacciones que puede
ser un reactivo en etapas posteriores de una vía metabólica, figura 8 [b]. Las reacciones son facilitadas
por enzimas.mi1 y mi2. En aras de la simplicidad, asumimos que sus concentraciones se mantienen
constantes. Nuevamente, consideramos dos escenarios diferentes, [a] actividades específicas
ligeramente diferentes y [b] actividades específicas muy diferentes. Resultado específico ligeramente
diferente en una adaptación dependiente del pH de la concentración de productosA y B.
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Figura 10. La fracción de productos A y B con respecto al metabolito X en función del valor de
pH externo. Nuevamente, se comparan dos situaciones: [a] los máximos de las actividades
enzimáticas específicas difieren ligeramente y [B] los máximos difieren fuertemente entre sí.
Las actividades específicas correspondientes en función del pH se muestran en los recuadros.
Los perfiles dependientes del pH divergentes conducen a un espectro de producto
dependiente del pH. Eventualmente, un pH cambiante desplaza el espectro del producto del
metabolito A al metabolito B yviceversa.
Curiosamente, ambos escenarios que representan la regulación genética y la regulación cinética exhiben un
comportamiento dependiente del pH similar. Sin embargo, difieren en sus escalas de tiempo específicas. Los
procesos cinéticamente regulados responden inmediatamente a los cambios en el pH intracelular. Por el
contrario, los procesos regulados genéticamente siguen variaciones ambientales con un retraso causado por el
tiempo requerido para la síntesis de proteínas.
En resumen, nuestra investigación demuestra que un nivel de pH cambiante puede conducir a una
formación de producto alterada debido a cambios en los patrones de expresión génica o cambios en
actividades específicas de las reacciones involucradas en la vía de fermentación AB de C. acetobutylicum.
Discusión
La bacteria C. acetobutylicum cambia su metabolismo entre acidogénesis y solventogénesis en respuesta
a cambios en el pH externo. Durante la acidogénesis (pH alto), produce predominantemente ácidos,
mientras que los disolventes de pH neutro, acetona y butanol, son los principales productos de
fermentación en la solventogénesis. Varios estudios experimentales, utilizando un cultivo continuo bajo
limitación de fosfato, indican que esta adaptación metabólica implica cambios en los niveles
transcriptómico, proteómico y metabolómico. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la regulación
del cambio solventogénico siguen sin estar claros.
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Utilizando el conocimiento existente sobre la red metabólica y las reacciones bioquímicas, establecimos
un modelo cinético de fermentación AB en C. acetobutylicum. La incorporación de la regulación génica
de las enzimas productoras de disolventes proporciona una representación mecanicista de esta
transición de fase inducida por el pH. Aunque el modelo captura bien el comportamiento observado, la
inclusión de una regulación adicional puede mejorar el ajuste. Por ejemplo, hemos asumido que la
inducción de enzimas solventogénicas se activa al mismo valor umbral de pH; la asignación de valores de
umbral distintos a cada gen codificante puede mejorar la precisión del modelo.
Nuestras investigaciones revelan que tanto los mecanismos reguladores, la regulación genética, considerada en el
presente modelo, como la regulación cinética pueden resultar en un comportamiento dependiente del pH similar.
Tomados en conjunto los conocimientos experimentales y teóricos, llegamos a la conclusión de que la regulación cinética
y genética contribuyen a la adaptación celular deC. acetobutylicum en respuesta a los cambios en los niveles de pH.
Los enfoques de biología de sistemas que implican alteraciones en los niveles de expresión génica se adoptan
con frecuencia para investigar y explotar bacterias. Por ejemplo, realizamos análisis de estado estable para
hacer predicciones sobre el efecto de mutaciones individuales en el rendimiento de butanol durante la
solventogénesis. Variando los niveles de expresión génicaen silico, inferimos que las alteraciones en la
expresión de un solo gen son insuficientes para incrementar significativamente la producción de butanol.
Obviamente, se requiere un enfoque más complejo que se dirija a dos o más genes simultáneamente.
Millat, T. et al.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de
Alemania (BMBF) como parte de la Red Transnacional Europea - Biología de Sistemas
de Microorganismos (SysMo) - dentro del consorcio COSMIC (FKZ 0313981D y
0315782D). La responsabilidad del contenido de este manuscrito recae en los autores.
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